專利名稱：玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因啟動(dòng)子克隆和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)作物的生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及一種通過構(gòu)建融合基因及轉(zhuǎn) 基因改變植物性狀的方案及用途。
背景技術(shù)：
植物基因工程的發(fā)展依賴于具有不同特性的啟動(dòng)子應(yīng)用。目前植物基因工程中常 用的啟動(dòng)子主要有組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如雙子葉轉(zhuǎn)基因植物中常用的花椰菜花 葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、胭脂堿合酶基因Nos啟動(dòng)子、擬南芥Rd29A啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基 因植物中常使用的玉米Ubil啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白基因Actl啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子具有 驅(qū)動(dòng)基因在各種組織持續(xù)、恒定表達(dá)的特點(diǎn)，可產(chǎn)生大量的異源蛋白質(zhì)，這在培育抗蟲抗除 草劑基因工程中有重要意義。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可是目標(biāo)基因在特定條件下表達(dá)，有利于植株 正常生長和發(fā)育。在轉(zhuǎn)基因生物研究中，經(jīng)常需要在特定組織中高強(qiáng)度表達(dá)目標(biāo)基因，現(xiàn)有 啟動(dòng)子在許多情況下很難滿足需要。另外，有報(bào)道表明，重復(fù)使用同一種啟動(dòng)子啟動(dòng)兩個(gè)或 者兩個(gè)以上外源基因在細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致基因沉默現(xiàn)象發(fā)生。因此，開發(fā)新的啟動(dòng)子 在轉(zhuǎn)基因生物研究中意義重大。植物基因啟動(dòng)子克隆及應(yīng)用的工作已有大量報(bào)道。如Pierre等(2003)從咖啡 中克隆了 1，5-二磷酸核酮糖梭化酶/加氧酶小亞基基因-RBCSl的啟動(dòng)子區(qū)域，分析表 明該啟動(dòng)子含有調(diào)控植物發(fā)育和光誘導(dǎo)的順式作用元件，用該啟動(dòng)子構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)化 煙草，得出該啟動(dòng)子具有葉片特異性和光誘導(dǎo)性。Singh等(2003)從百合中克隆了一個(gè) LGCl基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因只在花粉中雄配子細(xì)胞中表達(dá)。在LGCI啟動(dòng)子 的-242 -183bp之間可能包含某一特異表達(dá)的順式作用元件，它的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞特異 性表達(dá)特性喪失。Gu等(2006)克隆得到玉米β-葡萄糖苷酶基因(ZmGLUl)的啟動(dòng)子，用 該啟動(dòng)子啟動(dòng)gus基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因煙草中⑶S蛋白在根中表達(dá)水平很高。Luo等(2006) 從水稻的圓錐花序中分離出了絨氈層特異性RTS基因，此基因的啟動(dòng)子含有一些與其他花 藥特異性啟動(dòng)子相同的順式作用元件，并能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中組織特異性表 達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生雄性不育。Tittarelli等(2007)從小麥中一個(gè)可能的高親和力磷轉(zhuǎn) 運(yùn)體-TaPT2基因ATG上游分離到一個(gè)579bp的片段，在低磷條件下該片段可在轉(zhuǎn)基因小麥 根系中特異地啟動(dòng)gus報(bào)告基因的表達(dá)。Gutha等(2008)將水稻OsDREBIB抗逆基因745bp 的啟動(dòng)子區(qū)域與gus融合后轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草，組織化學(xué)分析結(jié)果顯示報(bào)告基因的表達(dá)受 甘露醇、NaCl、PEG、冷、ABA和水楊酸多種脅迫的誘導(dǎo)。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase) (EC4. 1. 1. 49)普遍存在于動(dòng)植物和微生物細(xì)胞中，催化腺苷酸和Mn2+-依賴性的草酰乙酸 和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的相互轉(zhuǎn)化，即催化草酰乙酸+ATP —— PEP+ADP+C02。雖然在 體外這個(gè)反應(yīng)是可逆的，但在高等生物體內(nèi)，由于在生理?xiàng)l件下對(duì)CO2的低親和力致使該酶 催化的羧化反應(yīng)可以忽略(Ray and Black 1976 ；Urbina and Avilan 1989)。在不同物種 中PEPCK在細(xì)胞內(nèi)分布和特性會(huì)有明顯不同，編碼基因序列和結(jié)構(gòu)有很長差異。在細(xì)菌、酵
3母和植物中，ATP依賴性PEPCK的一級(jí)結(jié)構(gòu)是同樣的，但與動(dòng)物細(xì)胞中GTP依賴性PEPCK的 一級(jí)結(jié)構(gòu)相似度很低(Utter and Kolenbrander, 1972 ；Kim and Smith，1994)。來自于高 等植物的該酶序列與動(dòng)物的PEPCK序列呈現(xiàn)很大差異，但它們的催化性質(zhì)相似，酶的活性 位點(diǎn)相同或相似，在進(jìn)化上關(guān)聯(lián)。與動(dòng)物PEPCK序列相比較，黃瓜和C4禾草類的PEPCK序 列與酵母、大腸桿菌等微生物的該酶序列相似度高，但高等植物的酶較大，具有N-端延伸 (Kim and Smith 1994 ；Finnegan and Burnell 1995 ；Walker and Leegood 1995,1996)。在非光合作用細(xì)胞中，PEPCK在糖異生代謝中是一個(gè)關(guān)鍵酶，催化三羧酸循環(huán)中 間物進(jìn)入糖異生途徑中的第一步反應(yīng)。在動(dòng)物細(xì)胞中，PEPCK(GTP-dependent)不僅在細(xì) 胞糖異生代謝中扮演重要角色，而且其活性與細(xì)胞分裂生長和肌體代謝疾病密切相關(guān)，已 有大量的工作。在萌發(fā)種子中該酶催化糖異生(Leegood and ap Rees 1978)，在一些藻類 中該酶參與CO2富集(Reiskind and Bowes 1991)。PEPCK也存在于一些植物如黃瓜的韌 皮部和生毛體中(R. P. Walker, L. I. Tecsi and R. C. Leegood,未發(fā)表資料)。在C4植物中 PEPCK參與蘋果酸或天門冬氨酸的脫羧作用，即葉肉細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)生蘋果酸或門冬氨酸進(jìn) 入維管束鞘細(xì)胞后，它們被轉(zhuǎn)變?yōu)椴蒗Ｒ宜幔笳咴赑EPCK作用下脫去羧基，釋放C02，CO2又 被Rubisco固定產(chǎn)生磷酸糖。植物的光合作用分為光反應(yīng)和暗反應(yīng)兩個(gè)階段，光反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是在光下產(chǎn)生同化 力ATP和NADPH去推動(dòng)暗反應(yīng)的進(jìn)行；而暗反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是用同化力將CO2轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的碳 水化合物。在C4植物中，固定CO2的酶為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxlase, PEPC)，它對(duì)底物CO2有較高的親和力，且不受O2的競爭抑制，形成的初產(chǎn)物 為草酰乙酸(oxaloacetic acid, 0AA)，OAA再被還原為蘋果酸或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為天冬氨酸， 然后蘋果酸或天冬氨酸通過胞間連絲轉(zhuǎn)移到維管束鞘細(xì)胞中，再迅速在脫羧酶的催化下重 新釋放CO2，參與Calvin循環(huán)，形成糖類。根據(jù)植物所形成的C4 二羧酸的種類以及脫羧反 應(yīng)參與的酶類，C4植物分為3個(gè)亞型葉綠體NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)催化脫羧反應(yīng)的 NADP-ME型，如玉米、甘蔗、高粱等；線粒體NAD-ME催化的NAD-ME型，如馬齒莧；以及胞質(zhì)磷 酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化的PCK型，如鼠尾草(Wyrich等1998)。PEPCK活性在NAD-ME型 C4單子葉植物中很低或可忽略，而在NADP-ME型C4單子葉植物中活性可差異很大。一些 NADP-ME型單子葉植物缺乏PEPCK活性，如高粱；而玉米等C4單子葉植物PEPCK活性較高 (Gutierrez et al. , 1974a ；Prendergast et al. , 1987 ；Dengler and Nelson, 1999 ；Kanai and Edwards，1999)。在玉米等C4植物中，PEPCK如同在C3植物中一樣是胞質(zhì)酶(Ku et al. 1980 ；Chapman and Hatch 1983 ；Watanabe et al. 1984)。在維管束鞘細(xì)胞中，CO2 釋 放方式取決于脫羧酶的類型，或是由PEPCK催化或是由NADP-蘋果酸酶催化，其中以PEPCK 催化產(chǎn)生OAA脫羧為最簡單的方式。在釋放CO2的同時(shí)產(chǎn)生的丙酮酸又由維管束鞘細(xì)胞轉(zhuǎn) 移到葉肉細(xì)胞的葉綠體中，在丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)的催化下生成無機(jī)碳的受體磷 酸烯醇式丙酮酸(PEP)，使光合反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行。一些學(xué)者提出，PEPCK-型的C4植物不僅有 高的PEPCK活性，而且有可觀的NAD-蘋果酸酶活性，而該型蘋果酸酶存在于線粒體中，推 測(cè)PEPCK-型的C4植物在維管束鞘細(xì)胞中同時(shí)采用PEPCK和NAD-蘋果酸酶(Burnell and Hatch 1988a, 1988b)進(jìn)行脫羧反應(yīng)，PEPCK活性所需的ATP來自于由NAD-蘋果酸酶催化 的蘋果酸脫羧產(chǎn)生的 NADH(Burnell and Hatch 1988b ；Carnal et al. 1993 ；Agostino et al. 1996)。
在一些NADP-ME型物種中PEPCK活性和調(diào)節(jié)性質(zhì)已有詳細(xì)的研究，并利用PEPCK 抗體檢測(cè)了維管束鞘細(xì)胞的蛋白質(zhì)量(Walker et al. , 1997 ；Wingler et al.，1999)。在玉 米維管束鞘細(xì)胞中NADP-ME催化蘋果酸釋放C02，PEPCK催化天門冬氨酸釋放C02，NADP-ME 和PEPCK聯(lián)合提供了磷酸核酮糖羧化所需的C02。玉米14CO2標(biāo)記試驗(yàn)得出，14CO2最初出現(xiàn)在 蘋果酸和天門冬氨酸的C-4位置上(分別為75%和25% )，其后標(biāo)記碳出現(xiàn)在其它代謝物 中。而且，蘋果酸脫羧速率可受天門冬氨酸和3-磷酸甘油酸刺激而提高數(shù)倍，是光依賴性 的；PEPCK催化天門冬氨酸脫羧受ATP刺激，依賴于草酰乙酸和錳離子，不依賴于光照，主要 產(chǎn)物是PEP，有少量丙酮酸產(chǎn)生(Wingler et al.，1999)。然而，關(guān)于不同C4植物中PEPCK 和它在光合作用中的作用仍待研究。C3和C4植物的PEPCK的活性因不同的發(fā)育過程和不同的細(xì)胞類型往往會(huì)出 現(xiàn)較大的差異。在一些類型的C3植物中可檢測(cè)到高水平的PEPCK活性。在C4禾草 Urochloapanicoides中，4個(gè)PEPCK基因差異表達(dá)，PEPCKl和PEPCK2在葉片中表達(dá)強(qiáng)度 高，推測(cè)在光合作用和CO2富集中起作用。PEPCK3和PEPCK4主要在正發(fā)育的根中表達(dá) (Finnegan et al.，1999)，可能在糖異生中起重要作用。植物PEPCK基因克隆的工作已有報(bào)道，其中代表性的工作有Furumoto等(1999) 克隆玉米PEPCKcDNA并進(jìn)行功能分析的工作和Kim等(2003)克隆黃瓜PEPCK基因并進(jìn) 行序列分析工作。在Furumoto等工作中，從玉米葉中分離了一個(gè)全長的ATP依賴性的 PEPCK (EC4. 1. 1. 49)cDNA，發(fā)現(xiàn)該基因RNA特異而高豐度的在維管束鞘細(xì)胞中表達(dá)，利用黃 瓜PEPCK抗體進(jìn)行的玉米PEPCK組織學(xué)定位也獲得了相同結(jié)果。由該cDNA推譯的蛋白質(zhì)序 列表明，在多肽鏈N端有一延伸，后者是植物PEPCK的特征。在14天的玉米小苗中，該基因 的轉(zhuǎn)錄本水平是白天大幅度高于夜間，然而在42天的植株中，這種晝夜巨變程度下降。在 大腸桿菌中表達(dá)玉米PEPCK，純化后用腸激酶(enterokinase)處理，蛋白被分解為二部分， 一部分有完整的N端，另一部分由于過度消化缺少N端的77個(gè)氨基酸。截頭蛋白表現(xiàn)的酶 活性比完整蛋白高2倍，可以被3-磷酸甘油酸(3-PGA)抑制(IQ:5 = 17. 5mM)。而完整的酶 蛋白對(duì)3-磷酸甘油酸抑制不敏感。這些結(jié)果表明，完整的N端延伸在植株體內(nèi)可能通過可 逆磷酸化參與PEPCK活性的調(diào)節(jié)。擬南芥基因組含有2個(gè)PEPCK基因(PCK1 and PCK2)，分別位于4號(hào)和5號(hào)染色體 上，推測(cè)它們編碼的蛋白分別為73，404和72，891Da,擬南芥中這2個(gè)PEPCK基因在大多數(shù) 組織中均有轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄本存在于葉、根、花、果實(shí)、正發(fā)育和正萌發(fā)種子的中。然而PCKlmRNA 呈現(xiàn)出豐度更高，存在于較多組織中。PEPCK在萌發(fā)后生長的子葉中PEPCK含量豐富，一致 于它在糖異生中的作用。PEPCK在庫組織如幼葉、發(fā)育中的花中也含量豐富。擬南芥5號(hào) 染色體上的PEPCK基因含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。從油菜冷馴化的黃化苗的cDNA文 庫中，S0ez-V0squez等(1995)分離出一個(gè)ATP依賴性的PEPCK基因。該基因?yàn)槔湔T導(dǎo)型 的，cDNA長1508核苷酸，編碼412個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列與酵母ATP依賴性PEPCK 的相似性為53 %，與大腸桿菌的為47 %，有相似的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Ca2+結(jié)合位點(diǎn)和催化位 點(diǎn)。Finnegan等(1999)從C4單子葉植物Urochloapanicoides的cDNA文庫中篩選出4個(gè) PEPCK基因，PEPCKl編碼一個(gè)68kD蛋白，PEPCK2編碼626個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量約68. 7kD， 與PEPCKl相似性高達(dá)96%?；蚪M片段分析表明，PEPCKl和PEPCK2是彼此緊密連鎖的 PEPCK基因，二者轉(zhuǎn)錄方向相同，PEPCK2位于PEPCKl上游。另有2個(gè)PEPCK基因被分別命名為PEPCK3和PEPCK4，PEPCK4位于PEPCK3上游，二者轉(zhuǎn)錄方向相同。Kim等(1994)建立了正處衰老階段的黃瓜子葉的cDNA文庫，從中篩選出一個(gè)編碼 ATP依賴性的PEPCK (EC 4. 1. 1. 49) cDNA克隆。該全長cDNA編碼約74. 4KD多肽，與細(xì)菌和 酵母的PEPCK相似性分別為43%和57%。該cDNA在大腸桿菌中表達(dá)，產(chǎn)生約74KD多肽。 利用該多肽制備抗體檢測(cè)黃瓜子葉、葉片和根的提取物，肯定了其特異性結(jié)合PEPCK。在黃 瓜種子吸漲后7天期，PEPCK mRNA和蛋白質(zhì)水平在子葉中增加，峰值分別在吸漲后的第2和 第3天。在衰老子葉中，PEPCK mRNA和蛋白質(zhì)又降低到低水平。這提示PEPCK在子葉糖異 生中起重要作用。以黃瓜PEPCKcDNA為探針，克隆基因組基因。經(jīng)過限制酶消化、Southern 雜交和核苷酸測(cè)序，確定了該基因長達(dá)9kb，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成。該基因的 外顯子數(shù)目和基因結(jié)構(gòu)相似于擬南芥4號(hào)染色體上的PEPCK基因和水稻基因組中的PEPCK 基因，后二者分別含有13個(gè)和12個(gè)外顯子。在黃瓜基因組中，只檢測(cè)出一拷貝的PEPCK基 因。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因啟動(dòng)子的研究較少，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國 協(xié)和醫(yī)科大學(xué)馮凱等(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，26(5) 562-565)在2004年報(bào)道構(gòu)建磷酸烯 醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因啟動(dòng)子調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，為評(píng)價(jià)PEPCK啟動(dòng)子轉(zhuǎn) 錄調(diào)控特性創(chuàng)造條件。他們從載體質(zhì)粒pPEPCK-int中截取大小為550bp的大鼠PEPCK啟 動(dòng)子片段，借助過渡載體質(zhì)粒PBR-PEPCK將PEPCK啟動(dòng)子片段插入pGL2-basic-Luc報(bào)告質(zhì) 粒。通過酶切鑒定及基因測(cè)序證明，PGL2-PEPCK: :Luc熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，并能夠 在體外體系中表達(dá)熒光素酶。PGL2-PEPCK: :Luc質(zhì)?？勺鳛轶w外研究大鼠PEPCK啟動(dòng)子轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié)特性的新手段。黃瓜PEPCK基因(CsPEPCK)啟動(dòng)子在開放讀碼框5，上游的2kb區(qū)域中存在保守 的植物特異順反式元件，幾個(gè)異檸檬酸裂解酶基因和蘋果酸合酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在的 普通異順反式元件也存在于黃瓜PEPCK基因啟動(dòng)子區(qū)，這些元件在植物發(fā)育過程中，特別 是種子萌發(fā)過程中對(duì)糖發(fā)生反應(yīng)起作用。CsPEPCK、異檸檬酸裂解酶基因和蘋果酸合酶基 因的啟動(dòng)子區(qū)域存在的保守元件有TATA signal (5’ -TATAAAT)(在CsPEPCK翻譯起始位 點(diǎn)-216bp處)、2個(gè)CAAT框(分別在5，TATA box上游的IObp (_226bp)和下游的24bp處 (-188bp)、一個(gè)富含AT的回文序列(與-1131bp _1092bp序列有90%相似性)、一對(duì)反 向重復(fù)序列(92%相似性，分別位于-1200bp -1173bp和_998bp _971bp)。在這3個(gè) 啟動(dòng)子近開放讀碼框區(qū)Ikb區(qū)段內(nèi)反式作用因子可結(jié)合的位點(diǎn)有GATA-motif (糖抑制反 應(yīng)元件)、水稻α-淀粉酶基因(Ramy3D)特異的順式作用元件、植物特異的Dof轉(zhuǎn)錄因子結(jié) 合的3個(gè)嘧啶框(5，-CCTT-I-D，存在于CsPEPCK啟動(dòng)子-412bp、_390bp和_301bp處)、蔗 糖誘導(dǎo)元件SURE (SURE2存在于CsPEPCK啟動(dòng)子_547bp處、SUREl存在于_541bp和_492bp 處，二者部分重疊；另有4個(gè)SURE2元件分別位于-939bp、_794bp、_755bp和_712bp處) (Crierson et al.，1994)、2個(gè)可對(duì)光和鈣/鈣調(diào)素反應(yīng)的GT-I框(5，-C ；GTI-AA,處于2 個(gè)嘧啶框之間)、一個(gè)5，-CAACA序列(存在于CsPEPCK啟動(dòng)子_826bp (可被DNA結(jié)合蛋白 RAVl 識(shí)別，Kagaya et al.，1999)、一個(gè) ACCT 框(存在于 CsPEPCK 啟動(dòng)子 _576bp 處，bZIP 蛋白識(shí)別序列)、2個(gè)IMH相關(guān)序列(IMH2同源于Myb結(jié)合序列ACCA/TACC，IMHI可能同源 于萌發(fā)反應(yīng)核心序列TCTrCT，分別位于CsPEPCK啟動(dòng)子_124bp和-ISObp處)、糖反應(yīng)相關(guān) 順式作用序列AMY-boxI、I-Box和SP8 (結(jié)合WRKY家族中SPFl-型蛋白)。
6
從已有資料看來，玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因啟動(dòng)子的克隆、分析和利用 研究未見報(bào)道，該啟動(dòng)子啟動(dòng)的基因表達(dá)可高確定出現(xiàn)在玉米維管束鞘細(xì)胞內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一個(gè)高效表達(dá)的啟動(dòng)子玉米磷酸烯醇 式丙酮酸羧激酶基因啟動(dòng)子(PZmPEPCK)并將其應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因，產(chǎn)生性狀改變的工程 植物。本發(fā)明所述的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因啟動(dòng)子的克隆及應(yīng)用方法是，將 從玉米中克隆PZmPEPCK序列，以全長(1500bp)或部分序列為啟動(dòng)子重組到目標(biāo)基因編碼 框(以正義形式或反義形式)或RNAi結(jié)構(gòu)之前，構(gòu)建融合基因，然后將融合基因插入到植 物表達(dá)載體中，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株；通過檢測(cè)轉(zhuǎn)基 因表達(dá)和對(duì)植株進(jìn)行性狀鑒定，從中篩選出目標(biāo)性狀明顯改變的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，創(chuàng) 造出在植物育種中具有應(yīng)用前景的新種質(zhì)和新品種。其中，所述的PZmPEPCK序列來自普通栽培玉米和玉蜀黍?qū)俚挠衩捉壏N或亞種， 也可是人工合成的序列一致和相近DNA片段。其中，所述用于構(gòu)建融合基因的PZmPEPCK序列可為全長序列，也可以為部分序 列，也可以為根據(jù)部分序列人工合成的脫氧多核苷酸鏈。其中，所述應(yīng)用方法是通過融合基因及植物表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)用PZmPEPCK序列， 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得性狀發(fā)生變化的轉(zhuǎn)基因植株及后代。本發(fā)明所說的植物為高等植物，包括被子植物和裸子植物；包括單子葉植物和雙 子葉植物；包括草本植物和木本植物。本發(fā)明所說的融合基因由PZmPEPCK序列和目標(biāo)基因編碼序列(以正義形式或反 義形式)或RNAi結(jié)構(gòu)及植物基因的3'尾巴區(qū)構(gòu)成。融合基因能在植物細(xì)胞中有效表達(dá)。本發(fā)明克隆出玉米PEPCK基因啟動(dòng)子并進(jìn)行了序列，檢測(cè)了 PEPCK基因在根系和 葉片中的表達(dá)強(qiáng)度；將該啟動(dòng)子和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因或Bt毒蛋白基因分別融合，構(gòu)建植物表 達(dá)結(jié)構(gòu)；再將后者重組到植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系，獲得了抗蟲玉米。玉米PEPCK基因表達(dá)強(qiáng)度的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)玉米PEPCK基因在玉米根和葉片中的表達(dá)強(qiáng)度，以 Actin 1為內(nèi)參。在玉米根中，該基因表達(dá)強(qiáng)度約為Actin 1的70倍，在玉米幼葉和老葉中 的表達(dá)強(qiáng)度分別約為Actin 1的76倍和60倍，即在玉米植株?duì)I養(yǎng)器官中玉米PEPCK基因 表現(xiàn)出很高的表達(dá)強(qiáng)度。玉米PEPCK基因啟動(dòng)子(PZmPEPCK)的克隆以玉米PEPCK基因編碼區(qū)序列為探針，篩選玉米基因組文庫，獲得了一個(gè)帶有開 放讀碼框5、上游1500bp的克隆，采用PCR方法克隆出該啟動(dòng)子區(qū)段。該區(qū)段對(duì)應(yīng)于玉米 自交系B73染色體1的BAC克隆ZMMBBb-342D19和ZMMBBb0342D19 (GeneBank數(shù)據(jù)庫，登陸 號(hào)AC190759. 3)中的一段序列。全長序列如下(SEQ ID No. 1)CCATATGGCATTAGGGGCCCTAGGGATCCAGATCGTTGATCAATGCTACGGGGTACAAGGCTCCTCGAG GACCTGGATGATTTAATCTTAGGTGTCTCGGAGTGCTAGGAGCATCAGGTTTAGAGCGCCATAGGGCATTAAGGTCC ATGGGGACCAAGATCATTGAT °C ACTGCTATGGGGTAAAATGCTCCTCAAGAACTTACCTGATTTTATCCTAGGTTGTCCCGAAGTGTTAGTAGCACTAGGCCTTAGAGCGTCGTGAGGCCCAAAGGGCCCCCGGGGGCTTGTAACATGTCCAT ATAAGACTTAGTAGTTTGTATTACATTATTATGTTAACTGATGTTAAACCTCTCTCTAGCCGAGACCAAGAGAGATT TTCGAGGCATGAGGCCTCGAGAGCACAGCATGGTGTATGTGTATCGTTATCCTTGAATACATCTTGCTCCTTGTTTT GAAAACCAATAGTGGTGTCGGCGCAGTCTGGCAACTGACATACCTTAAGTTTTAAAACCTTCGTATCTTTCTTTGTA ATTACTAAGCTATGTGTGCAGCGGCCACACTTTACCACTTGAATCTGTAGGTTGCGTGTTCTATTTCTGCCATCCAT ACCTTATTTTCTTTCTTTTGTTCTCCGCCACTGGAACCATGAAATCTCCATCGTTTTCATTCTTTCCCAAGGGGCCG CGACACCAAAATGACCGAACATCAGTCGAAACCACTGCAACCTGACCAATGTACCCTATTTCTACTTGCAATTCACT TCTCCAGGTAATAACACGTGAGTAGGGTAGTACAATTCAGGGCGTGTAGACAAATCAGTGGAGCCGATAAGTTTATG CATAAGAAAAGTCAGTGATTTTATTAACTACTTTCTCTCCCAGAACAAACTTCGCAAGGCACAGCTGTCGCAGTCAC ACCGATTTGGCTAGCCTCCCTCCGGTTAGCAACTTTGGAGTATTAGCAAGCATACAGGAGTAAACAAGTAGCTAAGC AAATGCAGATTCAGAATAATGCAAATATTGTGTTAAGCCGGAACGAAAGAATAAGCTCCACTGCTGCTCCTGCAGAG TGCAAAAACCCAAACCCAACCCGGAACGAAAGCGCCGCCGCCGTTGAATGGTCGGGTAGAGGACGTAACCATGGTTC ACTGCCGGGCCCTTTAAAAGCCGAGCCGGGCTCGTCCCATCCGCCCCACGACCGCTTGGCGCTTCATCACTCGTTCC CTTTCGAAAGCCCGCGCACGCACGTCGGTCGTCCCGTACGTGTGCCCGTCTATCTATCCTCCTCGACTCCGTCGTGT CTCTTCAACTCCGTCGTGTCGTGTGCAATCGTTGCATGCGGCGAACGCTATACATGGTGCTCCGAGAGTGTCCGGGA GCAGAGAGCATCGATCAATGGCGGGGTTTGGTCTGGTCTGGTCTGGTCCCATCCCAGCAGGGTCGCTAATGCGCGCT CGCTGCTGCTTCTCTCTCTGCAGGAGCAGGACCTCGATCGGCCGAGATGGCGACGCCGAACGGGCT玉米PEPCK基因啟動(dòng)子(PZmPEPCK)序列的基本特征在該啟動(dòng)子區(qū)域中，存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，有15個(gè)CAAT-box，分別位 于-1456 (P，即正義鏈)、-1037 (P)、-766 (P)、-171 (P)、-104 (P)、-1335 (N，即反義鏈)、_ 478 (N)、-685 (P)、-505 (P)、-482 (P)、-576 (N)、-1037 (P)、-766 (P)、-743 (P)和-703 (P)； 9 個(gè) G-Box,分別位于-719 (P)、-235 (N)、-235 (P)、-236 (P)、-302 (P)、-1239 (N)、-201 ( N)、-182 (N)禾Π -177 (N) ；3 個(gè) AAGAA 基序，分別位于-457 (P)、-827 (N)、-878 (N) ；3 個(gè) MBS (MYBbinding site)元件，分別位于-1161 (P)、_1010 (P)和-799 (N) ；2 個(gè) ABRE 元件，分 別位于-235 (P)、-719 (P) ；ARE 元件 2 個(gè)，分別位于-782 (N)、-1039 (N) ；2 個(gè) Spl 元件，分 別位于-308 (N)、-565 (P) ；2 個(gè) GC-基序，分別位于-1217 (N)、-1221 (P) ；3-AF1 結(jié)合位點(diǎn)、 AuxRR-core、CAT-box、CCAAT-box、CG-基序、MNFl、chs-Unitlm USkn-I 基序、GATA 基序和 Box I 元件各 1 個(gè)，分別位于-1123 (P) ,-1352 (P)、-861 (P)、-1012 (N)、-1221 (P)、-230 (P)、-407 (P)、-801 (N)、-1070 (N)和-1043 (N)。玉米PEPCK基因啟動(dòng)子(PZmPEPCK)與目標(biāo)基因的重組采用常規(guī)的分子克隆技術(shù)將玉米PEPCK基因啟動(dòng)子全長或部分序列連接到目標(biāo) 基因編碼框(以正義形式或反義形式)或RNAi結(jié)構(gòu)之前，構(gòu)建融合基因，然后將融合基因 重組到與PR0K2或pCam系列等植物表達(dá)載體中獲得重組質(zhì)粒；也可將玉米PEPCK基因啟動(dòng) 子全長或部分序列直接插入到植物表達(dá)載體中的目標(biāo)基因的編碼框之前，形成完整的可在 植物細(xì)胞中有效表達(dá)的融合基因?？筛鶕?jù)受體植物和所需基因的表達(dá)強(qiáng)度及可調(diào)控程度， 融合基因中可加入分別適合于單、雙子葉植物或其它植物的增強(qiáng)子或抑制子或?qū)μ攸c(diǎn)信號(hào) 發(fā)生反應(yīng)的序列(順式作用元件)。融合基因的;T端可選用不同基因的3'尾巴區(qū)，也可 插入增強(qiáng)子序列。在融合基因中，也可在編碼區(qū)插入不同內(nèi)含子。重組質(zhì)粒可導(dǎo)入大腸桿 菌和農(nóng)桿菌中增殖或/和保存。
用含有玉米PEPCK基因啟動(dòng)子(PZmPEPCK)的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物根據(jù)轉(zhuǎn)基因受體材料的特定選用不同的轉(zhuǎn)基因方法獲得轉(zhuǎn)基因植物。常用的轉(zhuǎn)化方法有3類1)直接轉(zhuǎn)化法，即提取重組質(zhì)粒DNA，采用基因槍轟擊法、 聚乙二醇誘導(dǎo)法、電融合法、硅碳纖維法等將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞。2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳化方 法。3)種系轉(zhuǎn)化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，還有將不同類方法組合使用 的轉(zhuǎn)化程序，如將基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌結(jié)合使用以提高轉(zhuǎn)化效率。以下以玉米自交系胚 性愈傷組織為材料采用基因槍轟擊法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。玉米(Zea mays L.)自交系植株在自交授粉后9-15天，取果穗剝?nèi)グ~后于70% 酒精中浸泡5min，無菌條件下挑取約1. 0-1. 5mm大小的幼胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4_6 周得到松脆、淡黃色的II型愈傷組織，然后繼代培養(yǎng)基每10-15天繼代培養(yǎng)一次。所得到 的II型愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。采用常規(guī)方法制備基因槍彈丸。即稱取1. 0 μ m大小的金粉，經(jīng)70 %乙醇洗滌后 靜置15分鐘，離心去除上清液；再用無菌水徹底清洗3次，然后50%滅菌甘油(終濃度為 60mg/ml微彈)貯存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)渦旋5分鐘打破金粉凝集，依次加入5 μ 1質(zhì)粒DNA (1 μ g/ μ1)、50μ1 12. 5Μ CaC12、20yl 0. IM亞精胺，邊加樣邊旋渦。然后，繼續(xù)旋渦2 3分鐘， 靜置1分鐘。離心棄上清液后，加70%乙醇靜置。然后離心棄上清液，再用無水乙醇重懸， 取樣加在微彈載體上。微彈用量為每彈0.5mg。在直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入0. 4cm厚的培養(yǎng)基，然后將愈傷組織高密度放入培養(yǎng) 皿中每皿轟擊一次。轟擊參數(shù)取可裂圓片與載體的距離為2. 5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為 0.8cm，微彈飛行距離6--9cm。其它參數(shù)按使用說明書取值。轟擊后材料在暗中恢復(fù)培養(yǎng)3 天，然后將材料轉(zhuǎn)入成分不變的新培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，使轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因充分表達(dá)。將材料 轉(zhuǎn)入加有選擇劑(如l_5ppm除草劑綠黃隆)的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。連續(xù)篩選三代，每代15 天。繼代時(shí)淘汰變褐死亡的組織塊。經(jīng)過篩選的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入不加篩選劑的培養(yǎng)基上 在光照16小時(shí)/天下恢復(fù)培養(yǎng)1代后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上分化小苗。愈傷組織產(chǎn)生的小苗 在生根培養(yǎng)基中生根，壯苗后移入花盆，長至約IOcm高時(shí)栽到大田中，自交結(jié)實(shí)。轉(zhuǎn)基因植 株采用PCR檢測(cè)法篩選，Southern blotting驗(yàn)證。通過數(shù)代分子檢測(cè)和自交結(jié)實(shí)產(chǎn)生純 系，在通過抗性鑒定和田間選擇獲得轉(zhuǎn)基因優(yōu)異材料。轉(zhuǎn)基因玉米植株的性狀檢測(cè)及利用將轉(zhuǎn)有玉米PEPCK基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的融合基因的玉米和未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照自交系 種子播在的花盆和大田，分別在苗期(3 7葉期)、雌雄穗發(fā)育期(9 13葉期)、開花授 粉期和成熟期進(jìn)行轉(zhuǎn)基因性狀和植株生理指標(biāo)的檢測(cè)。綜合多方面的測(cè)試結(jié)果，選出優(yōu)異 的轉(zhuǎn)基因植株套袋自交純合，并進(jìn)行配合力測(cè)定，選擇配合力與供體自交系相同或有提高 的轉(zhuǎn)基因自交系用于玉米單交種選育。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 轉(zhuǎn)PZmPEPCK: :Bt毒蛋白基因創(chuàng)造玉米抗蟲自交系及應(yīng)用1)受體系統(tǒng)的建立以我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上所用的骨干自交系為材料，如鄭58、昌7-2、 DH4866等的自交種子。離體培養(yǎng)誘導(dǎo)莖尖產(chǎn)生叢生芽塊，以叢生芽塊為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。 所用培養(yǎng)基有
種子萌發(fā)培養(yǎng)基KN031900mg/l，NH4N031650mg/l,CaCl2 · 2H20 440mg/l, MgSO4 · 7H20 370mg/l，KH2PO4 · H2O 170mg/l，F(xiàn)eSO4 · 7H20 27. 8mg/l，ZnSO4 · 7H20 10mg/l, MnSO4 · 4H20 22. 3mg/l, H3B0310mg/l, KIO. 83mg/l, Na2MoO4 · 2H20 0. 5mg/l, CuSO4 · 5H200. 025mg/l，CoCl2 · 6H20 0. 025mg/l，鹽酸硫胺素 10. Omg/1，鹽酸吡哆醇 1. Omg/ 1，煙酸1. Omg/1，甘氨酸2. Omg/1，肌醇100. Omg/1，生物素0. 05mg/l，酪蛋白水解物500mg/ 1，蔗糖30g/l，瓊脂粉7g/l，pH 5. 8 6. O。用于種子萌發(fā)。液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。A培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 4. 5 9. O μ mol/1和2，4-D 1. O 3. O μ mol/Ι，用于誘導(dǎo)離體培養(yǎng)芽尖產(chǎn)生叢生芽組織塊和叢生芽組織塊繼代培養(yǎng)。B培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 4. 5 μ mol/Ι和IBA (吲哚丁酸)1. 8 μ mol/Ι， 用于叢生芽組織塊分化小苗。成苗培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加6-BA 2. 25 μ mol/Ι和IBA 3. 6 μ mol/1，用于叢 生小芽發(fā)育成小苗。生根培養(yǎng)基種子萌發(fā)培養(yǎng)基附加IBA 2. 8 3. 6 μ mol/1，用于無根小苗生根?；九囵B(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅 菌，在培養(yǎng)基滅菌后加入。種子滅菌和萌發(fā)玉米種子用70 %乙醇浸泡10分鐘，再用0. 1 %氯化汞浸泡 10-15分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少 量(30—40毫升/250毫升三角瓶)無菌水，封口后放在黑暗條件(23—30°C )下1一2 天。萌動(dòng)(露白)后種子放在基本培養(yǎng)基上于黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。莖尖培養(yǎng)和叢生芽組織塊誘導(dǎo)、繼代、分化萌發(fā)種子的胚芽伸長止3—5厘米 時(shí)，剝離胚芽鞘及幼葉，切取長約5毫米左右的上胚軸及莖尖，接種到A培養(yǎng)基上于黑暗下 (24-270C )培養(yǎng)，并及時(shí)切去伸長的胚軸和剝?nèi)ビ兹~。培養(yǎng)6-10天后，莖尖開始不規(guī)則 膨大生長，在膨大的分生組織上出現(xiàn)數(shù)個(gè)瘤狀或指狀突起。20天后，在瘤狀或指狀突起的表 面開始形成不定芽及胚狀體。一般每4周繼代培養(yǎng)一次。在繼代培養(yǎng)中，若叢生芽組織塊 叢生小芽偏多，2，4-D濃度取3. 0 μ mol/1 ；若叢生芽組織塊愈傷組織化較重，雖有大量的分 生細(xì)胞團(tuán)，但表面很少出現(xiàn)不定芽，可將2，4-D濃度降為Ι.ΟμπιοΙ/l，繼續(xù)培養(yǎng)則重新產(chǎn)生 大量瘤狀或指狀突起。A培養(yǎng)基上的叢生芽組織塊，少數(shù)有不定根的產(chǎn)生。與幼葉存在一 樣，不定根也影響組織塊的膨大生長及胚狀體和叢生小芽的產(chǎn)生，需要及早去掉。叢生芽組 織塊在轉(zhuǎn)移到B培養(yǎng)基上2-3天后，色澤逐漸變黃，質(zhì)地較柔韌，5-6天后表面出現(xiàn)微小突 起。掃描電鏡下觀察可見各期胚狀體及不定芽。胚狀體及不定芽迅速發(fā)育，在組織塊表面 形成叢生小芽。2)以叢生芽組織塊為受體的轉(zhuǎn)化和植株再生將帶有雙元載體(Mini—Ti質(zhì)粒帶有選擇劑抗性基因和PZmPEPCK: :Bt毒蛋白基 因)的根瘤農(nóng)桿菌(如AGLO和LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含胰化 蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，熱壓滅菌)中28°C下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為 IlOrpm(轉(zhuǎn)/分)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期。然后在3000rpm下離心10分鐘，棄上清液。菌 體用1/2濃度的液體種子萌發(fā)培養(yǎng)基(即種子萌發(fā)培養(yǎng)基成分減半，去掉瓊脂粉)洗滌，再 離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮(aCetOSyringOne，AS)100ymOl/l的濃度的液 體叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
10
取繼代后培養(yǎng)13-20天的叢生芽組織塊為轉(zhuǎn)基因受體。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn) 化，轉(zhuǎn)化后材料在暗中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。農(nóng)桿菌感染的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有頭孢 霉素(Cefotaxime) 250mg/l或羧芐青霉素(Carb) 500mg/l的培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)7—12 天，抑制細(xì)菌生長。恢復(fù)培養(yǎng)后或抑菌培養(yǎng)后的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有選擇劑的 培養(yǎng)基上連續(xù)篩選3-4代，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及小芽。在篩選培養(yǎng)中絕大數(shù)叢生芽組織塊逐 漸死亡。將存活的組織塊轉(zhuǎn)移到無選擇劑的去掉2，4-D的A培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)后產(chǎn)生小芽。將小芽放在成苗培養(yǎng)基上照光下生長，光強(qiáng)2000-30001χ，光照14_15小時(shí)/天。 小苗長到3-4片葉時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。培養(yǎng)15天左右，約40%的小苗產(chǎn)生新根。對(duì) 于未生根苗，切傷其基部，轉(zhuǎn)移到新的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天后大多數(shù)植株產(chǎn)生根系。生 根苗洗去培養(yǎng)基后，移栽到以蛭石為栽培介質(zhì)的花盆中生長。植株在自然光照下生長，日溫 22-280C，夜溫15-21°C，隔天澆灌1/2濃度的種子萌發(fā)培養(yǎng)基的無機(jī)鹽成分。生長2周左 右，移植苗產(chǎn)生發(fā)達(dá)根系，然后定植于田間。3)轉(zhuǎn)基因植株的抗性檢測(cè)和選擇利用取移栽成活植株的葉片進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)確定轉(zhuǎn)基因植株。而后將轉(zhuǎn)基因植株 (TO)套袋自交結(jié)實(shí)。將來自不同TO植株的Tl種子播在溫室或具有防護(hù)設(shè)施的田間，出苗 后取葉片采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法測(cè)定Bt毒蛋白表達(dá)量，然后人工接種亞洲玉米螟卵塊，觀 測(cè)植株抗蟲性。Bt毒蛋白檢測(cè)和人工接蟲試驗(yàn)采用本領(lǐng)域所用的常規(guī)技術(shù)和試劑盒。Tl 代篩選出的抗蟲植株繼續(xù)套袋自交，對(duì)其子代繼續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和抗蟲性檢測(cè)。通 過數(shù)代自交純合和抗性檢測(cè)及選擇，最終獲得抗蟲玉米自交系。該自交系可用于配制玉米 抗蟲雜交種。實(shí)施例2 轉(zhuǎn)PZmPEPCK: TPTl基因創(chuàng)造玉米高光效育種材料植物細(xì)胞質(zhì)與葉綠體基質(zhì)間的糖/磷轉(zhuǎn)運(yùn)主要是由磷酸丙糖/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 (Triose-phosphate/phosphate translocator, TPT)來負(fù)責(zé)，該轉(zhuǎn)運(yùn)體可以將磷由細(xì)胞質(zhì) 轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中，同時(shí)，等摩爾的磷酸丙糖3-PGA從葉綠體基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。而當(dāng)細(xì)胞 質(zhì)的磷濃度降低時(shí)，TPT轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性受到抑制，從而導(dǎo)致代謝物在葉綠體中的積累，影響 葉片光合速率。ZmTPTl是從玉米中克隆的一個(gè)磷酸丙糖/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，對(duì)底物親和力 高，通過構(gòu)建融合基因?qū)崿F(xiàn)該基因在玉米維管束鞘細(xì)胞中高強(qiáng)度表達(dá)，有利于玉米葉片保 持高的光合速率。該實(shí)例通過PZmPEPCK: :TPT1基因構(gòu)建和該基因轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系來 實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。1.玉米無菌苗獲得玉米優(yōu)良自交系的種子，用70%乙醇浸泡8分鐘，再用0. 氯化汞浸泡8-12分 鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子 放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，瓶內(nèi)放入少量無菌水于黑暗條件(25-28°C )下1-2天。待種子萌 動(dòng)(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗條件下萌發(fā)。待胚芽伸長止3-4厘米時(shí)， 剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖頂端生長錐。2.農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑抗性基因bar和PZmPEPCK: :TPT1融 合基因)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基中28°C下震蕩培養(yǎng)， 震蕩速率為llOr/min，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加ΙΟΟμπιοΙ/l乙酰丁香酮的 1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。3.玉米無菌苗轉(zhuǎn)化(1)將菌液倒在4. 5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，使露出莖尖生長錐的無菌 苗浸泡在菌液中，在0. 5 X IO5Pa大氣壓下處理8-12分鐘。(2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，萌發(fā)種子放在改良MS培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng) 2-3天，培養(yǎng)溫度為22-24°C。然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。(3)將照光培養(yǎng)后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆 蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28°C，夜溫15-21°C，隔天澆灌1/2改 良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。4.轉(zhuǎn)化植株篩選與定植轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑除草劑Finale (Hoechst Schering AgrEvo GmbH, 含有除草劑glufosinate ammonium)水溶液，濃度為9. 6ml_10. 8ml FinaleVL，以植株掉 液滴為宜。未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株在噴灑后4天后停止生長，9天后開始死亡。轉(zhuǎn)化植株在噴灑 后，一些個(gè)體變化同對(duì)照植株相似，另一些個(gè)體持續(xù)生長，變化不明顯。待存活植株長到5 葉時(shí)，將其定植到田間，套袋自交結(jié)籽。5.轉(zhuǎn)基因植株子代分析Tl代植株長到3葉期用10. 8ml FinaleVL水溶液處理，觀察統(tǒng)計(jì)抗性和敏感性個(gè) 體比例；采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因，并統(tǒng)計(jì)外源基因在子代植株中的分離比例。存活植 株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交結(jié)籽外，采用PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因進(jìn)行 Southern blotting驗(yàn)證，并采用RT-PCR技術(shù)檢查轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng)度。對(duì)于入選的轉(zhuǎn)基因株 系測(cè)定植株在不同光強(qiáng)和溫度下凈光合速率的變化，測(cè)定3-7葉期小苗生長速率，測(cè)定單 株產(chǎn)量和生物量，并以未轉(zhuǎn)基因植株為對(duì)照。選出優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因株系后在大田栽培條件下 進(jìn)行玉米產(chǎn)量性狀的觀測(cè)和比較，選擇高光效高產(chǎn)株系進(jìn)入生物安全性試驗(yàn)和玉米育種實(shí) 驗(yàn)。
權(quán)利要求
一種玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK基因啟動(dòng)子序列克隆和應(yīng)用，其特征是，從玉米基因組中克隆出玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列，與目標(biāo)基因編碼區(qū)或其RNAi結(jié)構(gòu)融合，構(gòu)建植物表達(dá)結(jié)構(gòu)，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因植株；通過檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)和對(duì)植株性狀的選擇，獲得抗逆性或經(jīng)濟(jì)性狀明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，創(chuàng)造出在植物育種中具有應(yīng)用前景的新種質(zhì)和新品種。
2.如權(quán)利要求1所述玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列克隆和構(gòu)建融合基因改變植物性性狀 的應(yīng)用，其特征是，所述應(yīng)用是通過轉(zhuǎn)入由玉米PEPCK基因啟動(dòng)子啟動(dòng)目標(biāo)基因或其RNAi 結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的。
3.如權(quán)利要求1所述玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列克隆和應(yīng)用，其特征是，所述玉米 PEPCK基因啟動(dòng)子序列與目標(biāo)基因的編碼序列以反義形式或正義形式構(gòu)建成融合基因，或 與目標(biāo)基因的RNAi結(jié)構(gòu)連接形成融合基因，產(chǎn)生植物表達(dá)結(jié)構(gòu)，并用于轉(zhuǎn)入植物內(nèi)改變植 物性狀。
4.如權(quán)利要求1所述玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列克隆和應(yīng)用，其特征是，所述玉米 PEPCK基因啟動(dòng)子序列來自普通栽培玉米和玉蜀黍?qū)俚慕壱吧牧希瑔?dòng)子序列來自 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和玉米基因組文庫。
5.如權(quán)利要求3所述轉(zhuǎn)玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列融合基因改變植物性狀的應(yīng)用，其 特征是，用于構(gòu)建融合基因的玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列為SEQ ID No. 1所示的1500bp的 全長或長度不同的部分序列，或根據(jù)玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列人工合成的脫氧多核苷酸 鏈。
6.如權(quán)利要求1或2所述玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列克隆和應(yīng)用，其特征是，所述植物 性狀包括抗蟲性、耐旱性、耐鹽性、抗病性、抗除草劑特性、糖代謝和糖轉(zhuǎn)運(yùn)特性、磷轉(zhuǎn)運(yùn)特 性、氮代謝特性。
7.如權(quán)利要求1所述玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列克隆和應(yīng)用，其特征是，所述植物包括 單子葉植物和雙子葉植物。
8.如權(quán)利要求1或7所述玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列克隆和應(yīng)用，其特征是，將一種玉 米PEPCK基因啟動(dòng)子序列與Bt毒蛋白基因融合構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基 因抗蟲玉米。
9.如權(quán)利要求1或7所述玉米PEPCK基因啟動(dòng)子序列克隆和應(yīng)用，其特征是，將一種玉 米PEPCK基因啟動(dòng)子序列與磷酸丙糖/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因TPT融合構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過 遺傳轉(zhuǎn)化獲得高光效轉(zhuǎn)基因玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因啟動(dòng)子克隆和應(yīng)用，其方法是，將從玉米中克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因啟動(dòng)子，與目標(biāo)基因編碼區(qū)或其RNAi結(jié)構(gòu)融合，構(gòu)建植物表達(dá)結(jié)構(gòu)，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株；通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)性狀的選擇，獲得抗逆性或經(jīng)濟(jì)性狀明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，創(chuàng)造出在植物育種中具有應(yīng)用前景的新種質(zhì)和新品種。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101979550SQ201010500388
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者張舉仁, 張廣峰, 李坤朋, 李朝霞 申請(qǐng)人:山東大學(xué)