專利名稱：野生茄子耐鹽基因StBADH基因及其植物表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及了一個(gè)野生茄子耐鹽基因^坊^^ 基因及其植物表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
土壤鹽漬化對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的威脅是一個(gè)全球性的熱點(diǎn)問(wèn)題，也是當(dāng)前我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì) 發(fā)展所面臨的生態(tài)危機(jī)之一。而且由于受全球氣候變暖、工業(yè)污染加劇和化肥施用不當(dāng)?shù)?因素影響，每年鹽漬化和次生鹽漬化都在不斷加重，農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。如 何提高農(nóng)作物耐鹽性，增加農(nóng)作物的產(chǎn)量和提高農(nóng)作物的品質(zhì)，已經(jīng)成為一個(gè)世界性的熱 點(diǎn)問(wèn)題。在鹽等滲透脅迫條件下，許多植物如甜菜、菠菜，都積累甜菜堿(Betaine)。甜菜 堿被認(rèn)為是植物抗?jié)B透脅迫最有效的滲透調(diào)節(jié)劑(參考文獻(xiàn)Aarczynski M C, Jensen R G. Stress protection of transgenic tobacco by production of the osmolyte mannitol. Science. 1993，259: 508-510)。作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，甜菜堿在植物體內(nèi) 由膽堿經(jīng)兩步不可逆的氧化合成，催化這兩步反應(yīng)的酶分別是膽堿單氧化物酶(Choline Monooxyge-nase, CM0)禾口舌甘菜石jtH月兌fiBl (Betaine Aldehyde Dehydrogenase, BADM)； 其中BADH是合成甜菜堿的關(guān)鍵酶，催化甜菜堿醛氧化為甜菜堿(參考文獻(xiàn)Rhodes D, Hanson A D. Quarternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1993， 44: 357-384)。由于植物體內(nèi)甜菜堿的合成途徑相對(duì)簡(jiǎn)單，進(jìn)行遺傳操作方便，在諸 多耐鹽基因中甜菜堿合成酶基因被看作是最有應(yīng)用價(jià)值的耐鹽基因之一(參考文獻(xiàn) Nakamura T， Nomura M， Mori H， Jagendorf A T， Ueda A， Takabe T. An isozyme of betaine aldehyde dehydrogenase in barley. Plant Cell Physiology. 2001, 42 (10): 1088-1092)。植物中導(dǎo)入耐鹽基因擬愿，其耐鹽性得到明顯提高已有諸多報(bào)道Zhang等 (2009)從菠菜中克隆了 BADH基因(GenBank登錄號(hào)AY156694)，構(gòu)建了組成型啟動(dòng) 子CaMV 35S啟動(dòng)的BADH基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯，結(jié)果顯示BADH酶活性增強(qiáng)， 對(duì)植株細(xì)胞膜通透性的保護(hù)能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性比對(duì)照植株顯著增強(qiáng)(參考文獻(xiàn) Zhang N, Si H J, Li L, Yang T, Zhang C F, Wang D. Drought and salinity tolerance in transgenic potato expressing the betaine aldehyde dehydrogenase gene. Acta Agronomica Sinica. 2009，35(6) : 1146-1150)。Jia 等(2002)構(gòu)建了含山菠菜甜菜堿酸 脫氫酶擬i擬基因的重組雙元植物表達(dá)載體pBin438，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)番茄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化， 120 mmol L"1 NaCl培養(yǎng)條件下，獲得轉(zhuǎn)基因番茄中的甜菜堿脫氫酶活性和擬I mRNA積 累量顯著高于野生型品種，轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)于高濃度鹽脅迫表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性(參考文獻(xiàn) Jia G X，Zhu Z Q，Chang F Q，Li Y X. Transformation of tomato with the BADH gene from Atrip lex improves salt tolerance. Plant Cell Reports. 2002，21: 141-146)。目前應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中選擇合適的植物表達(dá)載體至關(guān)重要?？寺∧望}基因并連接到適宜的植物表達(dá)載體，可 直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的耐鹽性，創(chuàng)造農(nóng)作物耐鹽新 種質(zhì)，對(duì)于進(jìn)一步培育耐鹽新品系提供重要理論基礎(chǔ)。野生茄子耐鹽基因^坊^擬植物表達(dá) 載體的構(gòu)建方法在提高農(nóng)作物耐鹽性育種方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決提高農(nóng)作物耐鹽性的問(wèn)題，提供一種新的野生茄子耐鹽基因 StBADH。本發(fā)明還提供該耐鹽基因擬的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。構(gòu)建的野生茄 子耐鹽基因^坊^擬植物表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制 耐鹽新種質(zhì)，提高鹽敏感農(nóng)作物的耐鹽性，可用于農(nóng)作物品種改良。本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題可通過(guò)如下技術(shù)方案解決
野生茄子耐鹽基因份擬i私該基因的序列為SEQ ID NO. 1。野生茄子耐鹽基因^坊^擬植物表達(dá)載體，由本發(fā)明所述的野生茄子耐鹽基因 StBADH與植物表達(dá)載體構(gòu)成。其中，所述的植物表達(dá)載體優(yōu)選中間載體PCAMBIA1301-BI220，該載體是通過(guò)分別 覓Hind Ul/EcoR I雙酶切植物載體pBI220和pCAMBIA1301，回收pBI220中1250 bp的小 片段與PCAMBIA1301中11787 bp的大片段，連接所述兩個(gè)片段得到的。野生茄子耐鹽基因StBADH植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟
1)野生茄子耐鹽基因份擬/擬的克隆
選用野生茄子作為試驗(yàn)材料，取幼嫩葉片，提取總RNA，取其2 P g反轉(zhuǎn)錄cDNA，用 RNase 消化 cDNA 產(chǎn)物，根據(jù) NCBI 上公布的番茄lycopersicum、amadh2 序 f^tU、 設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行高保真聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，在合成的野生茄子葉片cDNA中擴(kuò)增含 I和fee I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的份擬I，PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收純化；
2)份擬i擬加多聚腺苷酸‘PolyA’尾反應(yīng)
按照DNA A-Tailing試劑盒說(shuō)明，以步驟1)得到的PCR純化產(chǎn)物為反應(yīng)底物，在份擬所 基因3，端加上多聚腺苷酸‘PolyA，尾-’StBADH%\ ‘PolyA，尾反應(yīng)的產(chǎn)物連入pMD19_T載 體中，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序驗(yàn)證，得到卿-StBADH ；
3)中間載體pCAMBIA1301-BI220的構(gòu)建
植物載體 PBI220 與 pCAMBIA1301 分別歷Ill (Promega) /EcoR I (Promega) 雙酶切，回收pBI220中1250 bp的小片段與pCAMBIA1301中11787 bp的大片段，用T4 DNA 連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取 純化，Hind III (Promega) /EcoR I (Promega)雙酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的中間載體 PCAMBIA1301-BI220 ；
4)份擬i擬植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-份擬i^-BI220的構(gòu)建
含Sma I和fee I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的pMD-份擬i擬與中間載體pCAMBIA1301-BI220 分別I (Promega)/5ac I (Promega)雙酶切，回收pMD-份擬i擬中1526 bp的小片段與 PCAMBIA1301-BI220中13029 bp的大片段，用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受 態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取純化，I (Promega)/5ac I (Promega)雙酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體PCAMBIA1301-份擬i^-BI220。有益效果
1.本發(fā)明提供的野生茄子耐鹽基因^坊^擬是一種新的耐鹽基因，該基因提高農(nóng)作物 耐鹽性。2.本發(fā)明構(gòu)建的野生茄子耐鹽基因^坊^份植物表達(dá)載體為野生茄子中首次報(bào) 道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)，提高鹽敏感農(nóng)作物 的耐鹽性，可進(jìn)行農(nóng)作物品種改良。3.本發(fā)明構(gòu)建的野生茄子耐鹽基因^^擬/擬植物表達(dá)載體，使得生物體能快速有 效的產(chǎn)生相應(yīng)的表型性狀，從而可確定對(duì)應(yīng)基因的功能，且具有特異性、高效性和廣泛性的 優(yōu)勢(shì)。四

圖1質(zhì)粒pBI220 Hind III / Ecor I雙酶切檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳分析 1 :pBI220/ Hind III/ Ecor I 2 :pBI220 質(zhì)粒
3:1 Kbp DNA Marker (TaKaRa)
圖2質(zhì)粒pCAMBIA1301 Hind III / Ecor I雙酶切檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳分析 1:1 Kbp DNA Marker (TaKaRa)
2:pCAMBIA1301/ Hind III/ Ecor I
3:pCAMBIA1301/ Hind III/ Ecor I
4:pCAMBIA1301 質(zhì)粒
圖3質(zhì)粒pMD-^^擬i擬及其pCAMBIA1301-BI220 1/ Sac I雙酶切檢測(cè)瓊脂糖凝膠 電泳分析
1 :DL2000 DNA Marker (TaKaRa)
2-.^m-StBADH/ Sma 1/ Sac I
3-.^m-StBADH/ Sma 1/ Sac I
4-.^m-StBADH/ Sma 1/ Sac I
5-.^m-StBADH/ Sma 1/ Sac I
6:pMD-份擬所質(zhì)粒
7:1 Kbp DNA Marker (TaKaRa)
8:pCAMBIA1301-BI220/ Sma 1/ Sac I
9:pCAMBIA1301-BI220/ Sma 1/ Sac I
10:pCAMBIA1301-BI220 質(zhì)粒
圖4野生茄子耐鹽基因^^擬/擬植物表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜。五具體實(shí)施例方式
1.野生茄子耐鹽基因^坊^擬植物表達(dá)載體的構(gòu)建 1)野生茄子耐鹽基因份擬/擬的克隆
選用野生茄子腫torvum Swartz) ‘Torvum Vigor’(為日本砧木品種，購(gòu)自日本 Takii種苗株式會(huì)社)作為試驗(yàn)材料，幼苗長(zhǎng)至4-5片真葉時(shí)，進(jìn)行100 mmol化―1 NaCl脅迫 處理，連續(xù)處理5天，取幼嫩葉片，按照Total RNA提取試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明提取總RNA，按照東洋紡(上海)生物技術(shù)有限公司cDNA合成試劑盒Tfe^r斤a lei-i說(shuō)明取2 y g總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase (TaKaRa)消化cDNA產(chǎn)物。根據(jù)NCBI上公布的番茄的序 列信息(GenBank 登錄號(hào)FJ228482. 1 )，經(jīng) Primer PREMIER 5 軟件(加拿大 Premier 公司) 分析設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 2，下游引物序列為SEQ ID NO. 3，進(jìn)行高 保真PCR反應(yīng)，在野生茄子葉片cDNA中擴(kuò)增含Sim I和Sac I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的StBADH0高保真PCR 擴(kuò)增體系cDNA 模板 1. 0 u L (60 ng),5XPrime STAR Buffer 4.0 U L (Mg2+ plus, 5XMg2+濃度為 5 mmol I71)，dNTP Mixture 1.6 ii L (各 2. 5 mmol O， Ml 1.0 uL (10 umol L_1),M2 1.0 uL (10 ii mol L-1)，Prime STAR HS Enzyme 0.4 u L, ddH20 11 u L ；
高保真PCR擴(kuò)增程序95°C預(yù)變性5 min，98°C變性10 s，55. 0°C退火15 s，72°C延伸 1 min 40 s，30個(gè)循環(huán)后，72°C總延伸5 min ;PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純 化；
2)S^A擬加多聚腺苷酸‘Poly (A)’尾反應(yīng)
按照DNA A-Tailing試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明，以步驟1)回收純化得到的PCR產(chǎn)物為反 應(yīng)底物，
反應(yīng)體系10 X A-Tailing Buffer 2 u L, dNTP Mixture 1.6 ii L (各 2. 5 mmol O， A-Tailing Enzyme 0. 2 u L, ^^擬愿回收液 10 u L (2 u g), ddH20 6. 2 u L ；
反應(yīng)程序?yàn)?2°C反應(yīng)20 min，冰中靜置2 min ；
StBADHtW ‘Poly (A)，尾反應(yīng)的產(chǎn)物連入pMD19_T載體(TaKaRa)中，連接反應(yīng)體系(10 ？ L) :pMD19-T 載體 1 ii L，份擬i擬加 ‘Poly (A)，尾反應(yīng)的產(chǎn)物 4 u L, Solution I 5 UL;16 °C過(guò)夜反應(yīng)，取10 ？ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞(南京天為生物技術(shù)有限公 司)，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-D-硫代半乳糖苷(X-Gal)、異丙基-硫代-D-半 乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板培養(yǎng)基(南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司) 上37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆(白色菌落)，在含有氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基 (南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)中37 °C過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)后，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小 量試劑盒(AXYGEN)提取純化，測(cè)序驗(yàn)證，得到_-StBADH ；
3)中間載體pCAMBIA1301-BI220的構(gòu)建。植物載體pBI220 (北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)與PCAMBIA1301 (澳大利 亞國(guó)際農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心)分別歷it/ III (Promega) /EcoR I (Promega)雙酶切， 回收pBI220中的小片段(1250 bp)與pCAMBIA1301中的大片段(11787 bp)，按4 :1的比例 用1\ DNA連接酶(TaKaRa)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞(南京天為生物技術(shù)有限 公司)，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AXYGEN)提取純化，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證
①取植物載體PBI220與pCAMBIA1301各15 ？ L，分別用歷Ill (Promega)和 EcoR I〔Promega)雙酶切，50 ？ L酶切反應(yīng)體系10XE Buffer 5 u L, 100XBSA 0.5 u L, 質(zhì)粒 pBI220 或 pCAMBIA1301 15 u L 1 u g), Hind III 1. 25 u L, EcoR I 1. 25 u L, 補(bǔ)ddH20至50 iiL，37°C反應(yīng)3 h ；酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖廣2)，用凝膠回收 試劑盒(AXYGEN)回收pBI220中的小片段與pCAMBIA1301中的大片段；
②用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收pBI220中的小片段(1250 bp)與pCAMBIA1301中的 大片段(11787 bp)，按4 :1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，連接反應(yīng)體系(25 ？ L)10XT4 ligase Buffer 2.5 ？ L，pBI220 小片段 8 ？ L，pCAMBIA1301 大片段 2 ？ L，T4 DNA 連接酶1 ？ L，ddH20 11.5 ？ L ； 16 °C過(guò)夜連接反應(yīng)，取10 ？ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受 態(tài)細(xì)胞(南京天為生物技術(shù)有限公司)，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-D-硫代半乳糖苷 (X-Gal)、異丙基-硫代-D-半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板培養(yǎng)基 (南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)上37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆(白色菌落)，在含有 氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基(南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)中37 °C過(guò)夜擴(kuò)大培 養(yǎng)后，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AXYGEN)提取純化，歷III (Promega)/feo7 I (Promega)雙酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的中間載體pCAMBIA1301-BI220 ； 4)植物表達(dá)載體pCAMBIAlSOl-^^^^/Y-BUZO的構(gòu)建 含Sma I和fee I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的pMD-^t^i擬與中間載體pCAMBIA1301-BI220分 別 I (Promega)/fee I (Promega)雙酶切，回收 pMD-^^^i擬中的小片段(1526 bp)與 PCAMBIA1301-BI220中的大片段(13029 bp)，按4 :1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞(南京天為生物技術(shù)有限公司)，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA 小量試劑盒(AXYGEN)提取純化，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證
①取質(zhì)粒 vm-StBADH與 pCAMBIA1301-BI220 各 15 ？ L,分別用 Sma I (Promega) / Sac I (Promega)雙酶切，50 ？ L 酶切反應(yīng)體系Multi_Core Buffer 5 u L, 100XBSA 0.5 y L，質(zhì)粒pMD-S^^^或pCAMBIA1301-BI220 15 u L (彡 1 u g) ,Sma I 1. 25 yL，補(bǔ)ddH20 至50 iiL，25°C反應(yīng)3 h ；65 °C保溫10 min，待冷卻后再加入fee I 1.25 iiL，37°C反應(yīng)3 h ；酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖3)，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收pMD-^^^/Y 中的小片段與PCAMBIA1301-BI220中的大片段；
②用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收卿-StBADH中的小片段(1526 bp)與 PCAMBIA1301-BI220 中的大片段(13029 bp)，按 4 :1 的比例用 T4 DNA 連接酶(TaKaRa)連 接，連接反應(yīng)體系(25 ？ L) :10XT4 ligase Buffer 2.5 ？ L，pMD-St^i擬小片段 8 ？ L, PCAMBIA1301-BI220 大片段 2 ？ L, T4 DNA 連接酶 1 ？ L，ddH20 11.5 ？ L ； 16 °C過(guò)夜連 接反應(yīng)，取10 ？ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞(南京天為生物技術(shù)有限公司)，在含有 5_溴-4-氯-3-吲哚-3-D-硫代半乳糖苷(X-Gal)、異丙基-硫代-3-D-半乳糖苷(IPTG)、 氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板培養(yǎng)基(南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)上37 °C過(guò)夜 培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆(白色菌落)，在含有氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基(南京基天 生物技術(shù)有限責(zé)任公司)中37 °C過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)后，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒 (AXYGEN)提取純化，I (Promega) /Sac I (Promega)雙酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的植 物表達(dá)載體pCAMBIAnOl-^^^^/Y-BUZO，圖譜見(jiàn)圖4。 綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建的野生茄子耐鹽基因^坊義擬基因及該基因的植物表達(dá)載 體PCAMBIA1301-份擬i^-BI220為野生茄子中首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鹽敏感 農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，提高鹽敏感農(nóng)作物耐鹽性，消除鹽堿地逆境對(duì)鹽敏感農(nóng)作物的危害，可進(jìn) 行農(nóng)作物品種改良。
權(quán)利要求
1.野生茄子耐鹽基因份擬i私其特征在于該基因的序列為SEQID NO. 1。
2.野生茄子耐鹽基因^^擬/擬植物表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的野生茄子 耐鹽基因份擬i擬與植物表達(dá)載體構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的野生茄子耐鹽基因^坊^擬植物表達(dá)載體，其特征在于所述 的植物表達(dá)載體為分別用Hind Ul/EcoR I雙酶切植物載體PBI220和pCAMBIA1301，回收 PBI220中的1250 bp的小片段與pCAMBIA1301中的11787 bp的大片段，連接得到的中間載 體PCAMBIA1301-BI220。
4.權(quán)利要求2所述的野生茄子耐鹽基因^坊^擬植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于 包括如下步驟1)野生茄子耐鹽基因份擬/擬的克隆選用野生茄子作為試驗(yàn)材料，取幼嫩葉片，提取總RNA，取其2 P g反轉(zhuǎn)錄cDNA，用 RNase消化cDNA產(chǎn)物，根據(jù)NCBI上公布的番茄〔Solanum lycopersicum)amadh2序列信息 設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行高保真聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，在合成的野生茄子葉片cDNA中擴(kuò)增含 I和fee I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的份擬I，PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收純化；2)份擬i擬加多聚腺苷酸‘PolyA’尾反應(yīng)按照DNA A-Tailing試劑盒說(shuō)明，以步驟1)得到的PCR純化產(chǎn)物為反應(yīng)底物，在份擬所 基因3，端加上多聚腺苷酸‘PolyA，尾-’StBADH%\ ‘PolyA，尾反應(yīng)的產(chǎn)物連入pMD19_T載 體中，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序驗(yàn)證，得到卿-StBADH ；3)中間載體pCAMBIA1301-BI220的構(gòu)建植物載體 PBI220 與 pCAMBIA1301 ‘?dāng)[ Hind Ul/EcoR I 雙酶切，回收 pBI220 中 1250 bp的小片段與pCAMBIA1301中11787 bp的大片段，用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒用AxyPr印質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取純化，Hind Ul/EcoR I雙酶 切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的中間載體PCAMBIA1301-BI220 ；4)份擬i擬植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-份擬i^-BI220的構(gòu)建含Sma I和Sac I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的\m-StBADH與中間載體pCAMBIA1301_BI220分 別 Sma l/Sac I 雙酶切，回收 _-StBADH 中 1526 bp 的小片段與 pCAMBIA1301_BI220 中 13029 bp的大片段，用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒用AxyPr印 質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取純化，l/Sac I雙酶切驗(yàn)證，得到構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體 pCAMBIAl 301 -StBADH-込 1220。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及野生茄子耐鹽基因StBADH及其植物表達(dá)載體。本發(fā)明所述的野生茄子耐鹽基因StBADH序列為SEQIDNO.1。該基因的植物表達(dá)載體是將該StBADH插入到由pBI220中的小片段與pCAMBIA1301中的大片段連接得到中間載體pCAMBIA1301-BI220的SmaI/SacI酶切位點(diǎn)間得到的。將該植物表達(dá)載體用于農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化，大量合成甜菜堿生物合成的關(guān)鍵酶，將會(huì)提高其耐鹽堿能力。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102002504SQ201010506900
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者朱月林, 楊立飛, 蓋鈞鎰, 陳罡 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)