專利名稱：一種乙酰膽堿酯酶的提取方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙酰膽堿酯酶的提取方法及其應(yīng)用，更具體地說是涉及一種用于 果蔬農(nóng)藥殘留量測定的乙酰膽堿酯酶的提取方法。
背景技術(shù)：
有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥因具有高效和低殘留的優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于果蔬生 產(chǎn)中，但果蔬中農(nóng)藥殘留可引起人急性中毒死亡，微量積累又會造成慢性中毒如致癌、致 畸、致突變等，嚴重危害人們的身體健康。目前檢測農(nóng)藥普遍采用的有色譜法、波譜法和酶 抑制法等。色譜法檢測準確，但成本高，檢測時間長，需要具備一定技術(shù)水平的專業(yè)人員才 能進行操作，只適合在實驗室進行；波譜法干擾因素多，靈敏度不高，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，一 般只能作為鑒別方法粗選；酶抑制法具有操作簡便，速度快，適合現(xiàn)場檢測和大批樣品篩選 檢測的特點，且不需昂貴的儀器，因此作為一種檢測農(nóng)藥的常用方法得到廣泛應(yīng)用。但目前 廣泛使用的快速測定產(chǎn)品一農(nóng)藥速測試紙，其主要原料乙酰膽堿酯酶依由于制備過程中 產(chǎn)品原料和制備工藝復(fù)雜的原因，價格昂貴，使對果蔬中農(nóng)藥殘留的快速測定產(chǎn)品難以普 及應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種能用于果蔬中農(nóng)藥殘留量快速測定的，工藝簡單且生產(chǎn) 成本低廉的乙酰膽堿酯酶提取方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明為一種從家蠶頭部中提取乙酰膽堿酯酶的方法，包括以下工藝步驟
(1)、將家蠶饑餓18-24h后，洗凈并吸干表面水分，以1:5的比例剪取家蠶頭部于 PH7. 5 8. 0磷酸緩沖液中，冰浴勻漿，勻漿液于4°C、5000-15000 r. p. m離心，取其上清液， 即得乙酰膽堿酯酶粗提液；
(2)、用硫酸銨沉淀法純化乙酰膽堿酯酶
a、在冰浴中邊緩慢攪拌乙酰膽堿酯酶粗提液，邊加入硫酸銨，使酶液中硫酸銨的飽和 度在30-80%的范圍內(nèi)；
b、上述所得溶液于0 4°C、5000 15000r. p. m冷凍離心，保留沉淀；
C、再加入pH7. 5-8. 0的磷酸緩沖液小心溶解沉淀，并用pH 7. 5-8. 0磷酸緩沖液稀釋 2-10 倍；
(3)、用透析法脫硫酸銨
將步驟(2)經(jīng)過硫酸銨沉淀純化后的乙酰膽堿酯酶的酶液裝入透析袋中，用其體積 20-30倍的蒸餾水透析，直至透析液不產(chǎn)生沉淀為止；
(4)、將步驟(3)所得的酶液濃縮，干燥，即得已純化的乙酰膽堿酯酶制品。。本發(fā)明用于提取乙酰膽堿酯酶的原料采用四齡家蠶或五齡家蠶。所述方法中的步驟(2)步，即用硫酸銨沉淀法純化乙酰膽堿酯酶的工藝，經(jīng)試驗表明，使酶液中硫酸銨的飽和度在40-60%的范圍內(nèi)的效果較好。所述方法中的步驟(4)，可采用真空冷凍干燥機，在0-4°C條件下濃縮酶液至固 體。也可采用透析法濃縮酶液，將酶液裝入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥劑，于0-4°C 下濃縮酶液。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明所提供的提取乙酰膽堿酯酶的方法，其原料來源廣泛，制備簡單穩(wěn)定，生產(chǎn)成本 較低。用本發(fā)明方法所制備的乙酰膽堿酯酶產(chǎn)品，產(chǎn)品純度高，用于對殘留農(nóng)藥的檢測，具 有較高靈敏度，經(jīng)測定檢出極限為95 IOOyg / mL，且經(jīng)本發(fā)明純化后的乙酰膽堿酯酶靈 敏度比酶粗提液提高4倍以上。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進一步闡述，但并不限制本發(fā)明。乙酰膽堿酯酶的活性測定方法乙酸_ β _萘酯顯色法；
即在含有l(wèi)mL，16mmol/mL底物(乙酸-β-萘酯的丙酮溶液)的試管中，加入經(jīng)硫酸 銨沉淀純化后的酶液5mL，再加入500、250、100、50 μ g/mL的甲胺膦溶液lmL，對照加ImL PH7. 5磷酸緩沖液，混合均勻，在30°C恒溫水浴中保溫反應(yīng)5分鐘后，加入顯色劑0. 5ml (0.8%固蘭B的3. 6% SDS)溶液混合均勻，使其反應(yīng)5分鐘，觀察顏色變化，呈紅色為完全 不被甲胺膦抑制，退色為部分抑制，呈無色為完全被抑制。實施例1
采用四齡家蠶提取乙酰膽堿酯酶的方法步驟如下
(1)、將家蠶饑餓24h后，洗凈并吸干表面水分，以1:5的比例剪取家蠶頭部于PH7. 5磷 酸緩沖液中，冰浴勻漿，勻漿液于4°C、6000 r.p.m離心30分鐘，取其上清液，即得乙酰膽 堿酯酶粗提液；
(2)、用硫酸銨沉淀法純化乙酰膽堿酯酶
a、取在乙酰膽堿酯酶粗提液10mL，冰浴中邊緩慢攪拌乙酰膽堿酯酶粗提液，邊加入硫 酸銨3. 26克(根據(jù)硫酸銨飽和度用量表)；
b、上述所得溶液于0°C、10000r. p. m冷凍離心lOmin，棄上清液，得到硫酸銨飽和度為 55%的沉淀；
C、加入pH7. 5的磷酸緩沖液ImL小心溶解沉淀，并用pH 7. 5磷酸緩沖液稀釋4倍；
(3)、用透析法脫硫酸銨將上步經(jīng)過硫酸銨沉淀的酶液裝入透析袋中，用其體積25倍 的蒸餾水透析24h，期間換水4次，直至用BaCl2檢測透析液不產(chǎn)生沉淀為止；
(4)、濃縮乙酰膽堿酯酶用真空冷凍干燥機，在4°C條件下濃縮酶液至固體，然后干燥 即得純化的乙酰膽堿酯酶產(chǎn)品。所得的乙酰膽堿酯酶產(chǎn)品密封后于低溫下(0°C)保存。按本實施例提取方法制備的純化乙酰膽堿酯酶產(chǎn)品根據(jù)乙酸_萘酯顯色法， 其活性經(jīng)測定為0.412。對該乙酰膽堿酯酶的靈敏度測定，測定結(jié)果表明由55%硫酸胺飽和度純化的乙 酰膽堿酯酶液的檢出極限為IOOyg / mL。經(jīng)純化的的乙酰膽城酯酶靈敏度比酶粗提液提
高4倍。實施例2采用五齡家蠶提取乙酰膽堿酯酶的工藝步驟如下
(1)、將家蠶饑餓18h后，洗凈并吸干表面水分，以1 :5的比例剪取家蠶頭部于pH7. 8磷 酸緩沖液中，冰浴勻漿，勻漿液于4°C、8000 r.p.m離心20分鐘，取其上清液，即得乙酰膽 堿酯酶粗提液。(2)、用硫酸銨沉淀法純化乙酰膽堿酯酶
a、取在乙酰膽堿酯酶粗提液10mL，冰浴中邊緩慢攪拌乙酰膽堿酯酶粗提液，邊加入硫 酸銨3. 61克(根據(jù)硫酸銨飽和度用量表)；
b、上述所得溶液于0°C、11000r. p. m冷凍離心lOmin，棄上清液，得到硫酸銨飽和度為 60%的沉淀；
C、加入pH7. 8的磷酸緩沖液ImL小心溶解沉淀，并用pH 7. 8磷酸緩沖液稀釋4倍；
(3)、用透析法脫硫酸銨將上步經(jīng)過硫酸銨沉淀的酶液裝入透析袋中，用其體積30倍 的蒸餾水透析24h，期間換水5次，直至用BaCl2檢測透析液不產(chǎn)生沉淀為止；
(4)、濃縮乙酰膽堿酯酶采用透析法濃縮酶液，將酶液裝入透析袋中，用聚乙二醇 6000作干燥劑，用量為5毫升/克(W/V)，于4°C下濃縮酶液，然后將濃縮液干燥即得純化的 乙酰膽堿酯酶產(chǎn)品。所得的乙酰膽堿酯酶產(chǎn)品密封后于低溫下(0°c)保存。按本實施例提取方法制備的純化乙酰膽堿酯酶產(chǎn)品根據(jù)乙酸_萘酯顯色法， 其活性經(jīng)測定為0. 409。對該乙酰膽堿酯酶的靈敏度測定，測定結(jié)果表明由60%硫酸胺飽和度純化的乙 酰膽堿酯酶液的檢出極限為95yg / mL。經(jīng)純化的的乙酰膽城酯酶靈敏度比酶粗提液提高 3. 8 倍。應(yīng)用實施例1
果蔬產(chǎn)品取市售空心菜；
根據(jù)國家標準糧食、水果和蔬菜中有機磷農(nóng)藥測定氣相色譜法(GB/T 14553-2003)，經(jīng) Agilent 6890N氣相色譜儀檢測該空心菜中甲胺磷含量達1. 38mg/kg (檢測條件恒定流 量3. OmL/min ；進樣口溫度250°C ；采用程序升溫方式100°C保持lmin，以10°C /min升至 1800C ；檢測器溫度250°C ；氫氣和空氣流量分別為75mL / min和IOOmL / min ；進樣量 1. O μ L ；以保留時間定性，以峰面積定量)。采用本發(fā)明的方法所得的乙酰膽堿酯酶進行酶法檢測
乙酰膽堿酯酶采用實施例2所得的從五齡家蠶提取的乙酰膽堿酯酶。用實施例2所得的從五齡家蠶提取的乙酰膽堿酯酶進行上述市售空心菜產(chǎn)品中 甲胺磷含量的酶法檢測，檢測方法如下
在含有l(wèi)mL，16mmol/mL底物(乙酸-β-萘酯的丙酮溶液)的試管中，加入純化后的酶 液511^，再加入500、250、100、5(^8/1^的甲胺膦溶液11^，對照加ImL ρΗ7. 5磷酸緩沖液，混 合均勻，在30°C恒溫水浴中保溫反應(yīng)5分鐘后，加入顯色劑0. 5ml (0.8%固蘭B的3.6% SDS)溶液混合均勻，使其反應(yīng)5分鐘，在595 nm處測其溶液吸光度，繪制標準曲線。將空心 菜打漿后，過濾，濾液經(jīng)稀釋后，采用同樣方法檢測，對比標準曲線，最終測定該空心菜中的 甲胺磷含量為1.45mg/kg，與氣相色譜檢測基本一致。從上述的氣相色譜檢測法和本發(fā)明所得的乙酰膽堿酯酶進行酶法檢測的方法所 得的最終結(jié)果進行對比，結(jié)果表明用本發(fā)明所得的乙酰膽堿酯酶進行果蔬中農(nóng)藥殘留量酶法檢測，具有檢測方法簡單，檢測靈敏度高，檢測成本低，檢測速度快等方面的優(yōu)點。
以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任 何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種乙酰膽堿酯酶的提取方法，其特征在于包括下列步驟(1)、將家蠶饑餓18 24h后，洗凈并吸干表面水分，以15的比例剪取家蠶頭部于pH7.5～8.0磷酸緩沖液中，冰浴勻漿，勻漿液于4℃、5000 15000r.p.m離心20～30min，取其上清液，即得乙酰膽堿酯酶粗提液；(2)、用硫酸銨沉淀法純化乙酰膽堿酯酶a、在冰浴中邊緩慢攪拌乙酰膽堿酯酶粗提液，邊加入硫酸銨，使酶液中硫酸銨的飽和度在30 80％的范圍內(nèi)；b、上述所得溶液于0～4℃、5000～15000r.p.m冷凍離心10min，保留沉淀；c、再加入pH7.5 8.0的磷酸緩沖液小心溶解沉淀，并用pH7.5 8.0磷酸緩沖液稀釋2 10倍；(3)、用透析法脫硫酸銨將步驟(2)經(jīng)過硫酸銨沉淀的酶液裝入透析袋中，用其體積20 30倍的蒸餾水透析，直至透析液不產(chǎn)生沉淀為止；(4)、將步驟(3)所得的酶液濃縮，干燥，即得已純化的乙酰膽堿酯酶制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰膽堿酯酶的提取方法，其特征在于用于提取乙酰 膽堿酯酶的原料采用四齡家蠶或五齡家蠶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰膽堿酯酶的提取方法，其特征在于步驟(1)中所述的勻漿液離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選6000-8000r. p. m ；步驟(2 )中用硫酸銨沉淀法純化 乙酰膽堿酯酶，酶液中硫酸銨的飽和度優(yōu)選40-60%，其中所用的磷酸緩沖液pH優(yōu)選為 7. 5-7. 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙酰膽堿酯酶的提取方法，其特征在于步驟(2)中用硫酸銨 沉淀法純化乙酰膽堿酯酶，酶液中硫酸銨的飽和度優(yōu)選55-60%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰膽堿酯酶的提取方法，其特征在于步驟(4)中所 得的酶液濃縮、干燥，即采用真空冷凍干燥機，在0-4°C條件下濃縮酶液至固 體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰膽堿酯酶的提取方法，其特征在于步驟(3)中所 述的采用透析法濃縮酶液，即將酶液裝入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥劑，于4°C下濃縮酶液。
7.如權(quán)利要求1 6任一所述的乙酰膽堿酯酶的提取方法所得的乙酰膽堿酯酶可用于 果蔬中農(nóng)藥殘留量測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙酰膽堿酯酶的提取方法，本發(fā)明以家蠶為酶源，其工藝步驟包括從酶源中提取乙酰膽堿酯酶粗提液，以及用硫酸銨沉淀法純化乙酰膽堿酯酶和用透析法脫硫酸銨，再將酶液濃縮，干燥，即得已純化的乙酰膽堿酯酶制品。本發(fā)明所提供的乙酰膽堿酯酶的提取方法，其家蠶原料來源廣泛，制備工藝簡單穩(wěn)定，生產(chǎn)成本較低。用本發(fā)明方法所制備的乙酰膽堿酯酶產(chǎn)品，產(chǎn)品純度高，用于對殘留農(nóng)藥的檢測，具有較高靈敏度，經(jīng)測定檢出極限為95～100μg／mL，且經(jīng)本發(fā)明純化后的乙酰膽堿酯酶靈敏度比酶粗提液提高4倍以上。
文檔編號C12Q1/44GK101974498SQ20101050915
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月18日
發(fā)明者宋慶, 張赟彬, 郭媛 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院