專利名稱：一種分離植物或微生物總rna的試劑組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，涉及一種細胞總RNA的制備方法，具體涉及一種分離柑橘類植物、煙葉或梨腐爛病菌總RNA的試劑組合物及其制備方法。
背景技術：
RNA是參與細胞基因表達的主要成分，在整個遺傳信息的維持和表達過程中扮演著十分重要的角色。在現(xiàn)代分子生物學研究中，RNA分離已成為許多試驗不可或缺的技術手段。分離得到的RNA質量的高低也將直接影響后續(xù)試驗的進行。而RNA由于其自身的生物學特性，存在易降解、難保存的特點。提取過程中也容易被蛋白質、DNA和其他細胞代謝物污染。因此一種能夠分離得到完整高純度RNA的方法一直是分子生物學工作者所希望實現(xiàn)的目標，其對分子生物學研究亦具有重要意義。有關RNA的提取方法很多，依據(jù)RNA分離原理大致可以分為密度梯度離心，化學沉降和介質吸附三大類。密度梯度離心法對離心設備要求高，操作繁瑣且處理的樣品非常有限，已經基本不再使用；化學沉降類方法中主要包括CTAB法、SDS-酚法、異硫氰酸胍-酸酚-氯仿法。其中CTAB法和SDS-酚法在對植物、真菌等樣品的RNA提取中使用較多，其提取原理主要是利用CTAB、SDS等陰/陽離子去污劑裂解細胞膜，釋放核酸，同時抑制RNA酶的活性。TriS-HCl、EDTA緩沖體系維持溶液pH值，穩(wěn)定核酸。聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)則能有效與多酚類物質結合，防止其氧化產物——醌類物質對核酸的破壞。隨后經乙醇和LiCl兩輪沉降得到RNA。由于LiCl對RNA的沉降具有一定特異性，絕大部分多糖、次生代謝物等雜質便在沉降過程中被除去，從而得到較純的RNA。該方法在處理富含多糖多酚類復雜樣品時仍然可以得到令人滿意的結果，然而對于大量樣品的處理，此類方法仍嫌繁瑣， 操作時間也較長。并且CTAB法和SDS-酚法均無法用于動物組織總RNA的提取。異硫氰酸胍的應用使這一狀況得到改觀，由于異硫氰酸胍具有極強的蛋白質變性能力，能夠在裂解細胞的同時使RNA酶迅速失活，從而克服了以上方法裂解能力不足的問題，極大地保證了核酸的完整性。異硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法就是在此基礎上發(fā)展起來的一種快速分離 RNA的方法，首先由Chomczynski及其同事于1987報道，并歷經數(shù)次改進。該方法適用大多數(shù)動植物樣品，得到的RNA完整性好，并可在短時間內完成操作，幾乎成為常規(guī)RNA提取的標準方法，使用也最為廣泛。商業(yè)化的TRIzoI試劑及其分離方法就建立在此基礎之上， 它比常規(guī)的異硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法更為快捷和高效，然而其價格也較為昂貴，不利于常規(guī)大量樣品的處理。介質吸附類方法是近年來迅速崛起的RNA分離方法，其主要原理是利用核酸在高鹽低PH溶液環(huán)境下與硅膠膜表面-OH基團形成鹽橋從而使核酸結合于硅膠膜表面。經一系列洗滌過程除去蛋白質和溶液中的鹽，最后在低鹽高PH條件下將核酸從硅膠膜上洗脫，從而分離得到RNA。這種方法可在極短時間內完成RNA的分離，并且得到的 RNA純度高、質量好，因而得到越來越廣泛的應用。然而此種方法難以避免DNA的污染。由于是利用硅膠膜吸附溶液中的RNA，硅膠膜的吸附能力和吸附面積成為影響RNA得率的重要因素，不可避免的損失使得這種方法的得率并不優(yōu)于化學沉淀類方法。而且這種損失對于分子量小的RNA來說尤為嚴重。限制了其在一些生物學實驗中的應用，如小分子RNA干擾等。到目前為止，針對特殊樣品的RNA提取方法的研究從未終止，一種簡便、高效、廉價而又能夠適應廣泛樣品的RNA提取技術一直是研究者們所追求的目標。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)方法樣品選擇性強、操作繁瑣、效率較低等缺點，提供一種分離柑橘類植物、煙葉或梨腐爛病菌總RNA的試劑組合物及其制備方法。本發(fā)明的核心是建立一種快速、高效而又廉價的RNA提取方法。該方法適合分離柑橘類植物、煙葉或梨腐爛病菌總RNA的方法，由于該方法向RNA提取試劑中添加了糖原作為核酸沉淀劑，故與同類型試劑相比，核酸的沉降效率大為提高，對組織樣品中含量很低的核酸成分亦能夠有效分離得到。同時使核酸沉降過程在短時間內即可完成，免除了 -20°C沉降數(shù)小時的過程，大大縮短了操作時間。該方法適用樣品廣泛，且比商業(yè)化TRIzol試劑更為廉價。樣品勻漿后若不立即進行RNA提取可放于-20°C保存至少3天。申請人:經過大量研究和對比試驗，優(yōu)選出滿足本發(fā)明目的的RNA提取試劑組合物及方法。本發(fā)明的RNA純化試劑組合物包括以下組分
1)溶液A
a.按重量/體積計異硫氰酸胍50% ；
b.醋酸鈉0. lmol/L
C.氯化鈉 0. 25mol/L ；
d.氯化鎂IOmmol/L ；
e.按重量/體積計十二烷基肌氨酸鈉0. 7% ；
f.糖原 60 μ g/ml
g·按體積/體積計β -巰基乙醇0. 5%
2)溶液B 水飽和酚(ρΗ4· 0-5. 0)；
3)裂解液
a.按體積/體積計，溶液A 50% -55% ；
b.按體積/體積計，溶液B 50% -45% ；
C.按重量/體積比計甲基紅0. 2%ο ；
將溶液A和溶液B按照體積比1 1混合后，加入甲基紅固體粉末使溶液呈玫瑰
紅色為裂解液，即得到本發(fā)明所述的試劑組合物。2、申請人建立了一種從柑橘類植物、煙葉或梨腐爛病菌中提取總RNA方法，其步驟包括按照前述的配方量制備RNA純化試劑組合物(配方見上所述)，備用。(1)樣品裂解根據(jù)樣品稱重，按照每0. Ig樣品添加Iml裂解液的比例吸取裂解液于離心管中，將樣品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的離心管中劇烈震蕩，樣品勻漿后在室溫下放置5min，然后置于冰上直至所有樣品勻漿完成。不立即進行RNA提取的樣品可將勻漿置于-20°C保存；(2)抽提
按每Iml裂解液添加200 μ 1氯仿的比例向勻漿中加入氯仿，劇烈震蕩使溶液呈乳濁狀，冰上靜置5min后于4°C下離心，離心后吸取上層水相于新離心管中并加入等體積氯仿再次抽提，離心，除去水相中殘余的酚；(3)沉降 RNA吸取上層水相于新離心管中，加入等體積異丙醇，冰上至室溫25°C放置IOmin后， 離心回收RNA ；(4)洗滌溶解RNA在室溫條件下，用濃度為75%的乙醇使RNA沉淀懸浮，洗滌1_2次后，將其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的去離子水中。本發(fā)明的特點在于以異硫氰酸胍、苯酚為主要成分，以NaCl、MgC12等提供陽離子，以醋酸鈉-醋酸緩沖系統(tǒng)穩(wěn)定溶液PH值，經氯仿簡單抽提后，即可得到高質量的RNA。 由于本發(fā)明的RNA提取試劑中添加了糖原作為核酸沉淀劑，故與同類型試劑相比，核酸的沉降效率大為提高，對組織樣品中含量很低的核酸成分亦能夠有效分離得到。同時使核酸沉降過程在短時間內即可完成，免除了 -20°C沉降數(shù)小時的過程，大大縮短了操作時間。該方法快捷、高效，適用樣品廣泛，且比商業(yè)化TRIzol試劑更為廉價。克服了傳統(tǒng)方法樣品選擇性強、操作繁瑣、效率較低等缺點。且操作更為靈活，樣品勻漿后可于_20°C保存3天再進行RNA的提取。本發(fā)明的效果是1、能夠在短時間內從樣品中分離得到高純度的RNA。2、操作步驟簡單，易于大量樣品的處理。3、適用樣品廣泛，對大部分植物、微生物及部分動物樣品均有較好的提取效果。更詳細的技術方案見《具體實施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO :1是來源于毛果楊(Populus trichocarpa)的Actin 9基因的 mRNA片段，序列全長為17^bp。序列表SEQ IDNO 2和SEQ IDNO 3是擴增Actin 9基因的引物對。序列表SEQ ID NO :4是來源于毛果楊(Populus trichocarpa)的Actin 1基因的 mRNA片段，序列全長為1819bp。序列表SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6是擴增Actin 1基因的引物對。圖1為墨西哥株檬(Citrus aurantifolia)葉片總RNA非變性瓊脂糖電泳效果 (IXTAE, 1. 2% )，圖中1為分子量標準(TIANGEN, MD103-02)，2-5為實驗重復。圖2為本氏煙(Nicotiana benthamiana)葉片總RNA非變性瓊脂糖電泳效果 (1ΧΤΑΕ，1·2% )，圖中1為分子量標準(TIANGEN，MD103-02)，2-3為實驗重復。圖3為梨腐爛病菌(Valsa ambiens (Pers)Fr)菌絲總RNA非變性瓊脂糖電泳效果(ΙΧΤΑΕ,Ι. 2% )，圖中1為分子量標準(TIANGEN，MD103-02)，2-5為實驗重復。圖4為不同方法提取得到的墨西哥株檬葉片總RNA非變性瓊脂糖電泳效果 (IXTAE, 1. 2% )，圖中 1 為分子量標準(TIANGEN, MD103-02) ,2 為=CTAB-LiCl 法得到的總RNA，3為本方法得到的總RNA，4為使用RNAisoReagent試劑(TaKaRa，D312)得到的總RNA，5為SDS-酚法得到的總RNA，6為使用Trizol試劑得到的總RNA，7為異硫氰酸胍-酸酚法得到的總RNA圖5為=RT-PCR擴增墨西哥株檬Actin基因片段瓊脂糖電泳效果(1XTAE，2% )， 圖中1為分子量標準(TIANGEN，MD109-02)，2-5為引物β-Actin(T52)擴增產物，6_9為 引物β -Actin(Τ60)擴增產物圖6為試劑性狀，左為Iml溶液于1. 5ml離心管中效果，右為加入氯仿分層后的效果。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明的應用實施例應用RT-PCR擴增墨西哥株檬(Citrus aurantifolia) Actin S13Jn S本實施例中墨西哥株檬葉片采集于華中農業(yè)大學國家果樹脫毒種質資源室內保存中心，墨西哥株檬植株為溫室盆栽植株。該品種為商業(yè)化品種和生產上廣泛應用的品種 (材料)，公眾如果需要，華中農業(yè)大學國家果樹脫毒種質資源室內保存中心可以對外發(fā)放該品種的材料。一、RNA提取使用的試劑組合物的配制1)糖原溶液(10mg/ml)用DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過的去離子水將糖原粉末溶解后，定容于15mg/ml。 依次先后用DNA酶(購自寶大連生物工程有限公司，即TaKaRa公司)、RNA酶(購自寶生物工程大連有限公司)及蛋白酶K(購自寶生物工程大連有限公司)進行消化處理，除去藥品中的DNA、RNA及蛋白質污染。使用等體積水飽和酚抽提一次，用等體積氯仿異戊醇(體積比為M 1)抽提兩次后，用DEPC處理過的去離子水將糖原溶液稀釋至10mg/ml，分裝于小份，-20°C保存。2)溶液 A a.按重量/體積計異硫氰酸胍50 % ；b.醋酸鈉 0. lmol/L ；c.氯化鈉 0. 25mol/L ；d.氯化鎂 IOmmol/L ；e.按重量/體積計十二烷基肌氨酸鈉0. 7% ；f.糖原 60 μ g/mlg.按體積/體積計β -巰基乙醇0. 5 %將以上固體粉末準確稱量并溶解后，加入已配制好的10mg/ml糖原溶液使其在溶液中的終濃度達到60 μ g/ml。添加β-巰基乙醇后用冰醋酸調節(jié)溶液pH至4. 6左右。最后用DEPC處理過的去離子水定容。3)溶液B 水飽和酚(ρΗ5· 0)4)裂解液 a.按體積/體積計溶液A 50 % -55 %b.按體積/體積計溶液B 50% -45%c.按重量/體積計甲基紅0. 2%o將溶液A和溶液B按照體積比1 1混合后，加入甲基紅固體粉末使溶液呈玫瑰紅色為裂解液，即得到本發(fā)明所述的試劑組合物。二、提取墨西哥株檬葉片總RNA1、準確稱取0. Ig墨西哥株檬(該品種是一個公開使用的商業(yè)化品種)葉片樣品， 液氮研磨后迅速加入含Iml裂解液的離心管中，劇烈震蕩勻漿。2、室溫下放置5分鐘后，將離心管置冰上，直至所有樣品勻漿完畢。3、在 4°C，12000g 下離心 5 分鐘。4、將上清轉移至新離心管，棄去管底殘渣。5、向每個離心管中加入200 μ 1氯仿，劇烈震蕩20秒使溶液呈乳狀。6、冰上放置10分鐘后于4°C，不低于12000g下離心15分鐘。7、小心吸取上層無色水相至新離心管中，加入等體積氯仿再抽提一次。8、4°C，不低于12000g下離心10分鐘。9、小心吸取上層水相于新離心管中，加入等體積異丙醇。冰上放置10分鐘。10、在4°C，8000g下離心10分鐘后回收RNA沉淀。11、倒掉上清，加入Iml 75%乙醇使沉淀懸浮，洗滌沉淀。12、在8000g室溫離心5分鐘回收沉淀。13、重復步驟 11-13。14、完全除去上清，室溫靜置15-20分鐘使RNA沉淀干燥。15、將沉淀溶于DEPC處理過的去離子水中，于_80°C下保存本實施例經4次重復得到的總RNA得率平均為3090 μ g/g組織，4次重復分離得到的總RNA其A26(1/28(1值均在2. 06-2. 10之間，其A26(1/23(1比值均在2. 09-2. 19之間，電泳條帶正常(見圖1)。三、cDNA合成使用DNase I試劑(購自寶生物工程大連有限公司)對提取得到的總RNA進行消化，具體步驟參照該公司的產品說明書進行。利用Oligo dT引物進行cDNA的合成，具體步驟如下1、取2μ g消化后的總RNA，加入1μ 1 Oligo (dT) 12_18 (100 μ Μ)(上述材料或試劑均購自！^ermentas公司產品)引物后，加入DEPC水至總體積10 μ 1。2、70°C水浴IOmin后迅速在冰上急冷5min。3、瞬時離心后在離心管中加入反轉錄反應溶液5μ 1 5XM-MLV Reaction BufferU μ 1 M-MLV (200U/ μ 1)(購自 Promega 公司產品)、6μ 1 dNTP(10mM.)(購自 Roche 公司產品)、0. 5μ 1 RRI RNase inhibibtor (40U/μ 1)(寶生物工程大連公司產品)、2. 5 μ 1 DEPC-H2O。4、42°C水浴1小時后70°C處理IOmin使反轉錄酶失活。5、5倍稀釋后分裝成小分保存于-20°C四、PCR擴增Actin基因片段RT-PCR擴增內參基因Actin片段，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的Actin 9基因序列 (基因登錄號XM_002331844)設計如下的一對引物，其DNA序列如下β -Actin (Τ52)-F :5，-TCTATTCCAGCCATCTCTC-3，(序列表編號 SEQ ID NO 2)，β -Actin (Τ52)-R :5，-GACCCTCCAATCCAAAC-3，(序列表編號 SEQ ID NO 3)。
序列全長為1726bp，其物種為毛果楊(Populus trichocarpa)，楊屬植物，其mRNA 片段如下所示(序列表編號SEQ ID NO 1)CTCTCTCTCTCTTTCTCTCTCGCACCAGCAACCGCAATACAAACAAGCAATTTAGGCCAGGCCACGTCT ATAGCTAGATTTGGCTTGGTTCGTTCTCTGATTATTCTCTCTTATACTTTTTTTGCACAGAACTTGTAGAAAATGGCCGATTCTGAGGATA TTCAGCCCCTTGTCTGCGACAATGGAACTGGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGCTGGGGATGATGCTCCCAGGGCAGTGTTTCCAAGTATTGT GGGTAGACCAAGACACACTGGTGTCATGGTTGGAATGGGGCAGAAGGATGCTTATGTTGGTGACGAAGCACAATCTAAGAGAGGTATCTTG ACCTTGAAATACCCTATTGAGCATGGTATTGTTAGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATTTGGCATCACACTTTCTACAATGAGCTTCGTG TTGCTCCTGAGGAGCACCCAGTCCTCCTTACAGAGGCTCCTCTTAACCCTAAGGCTAACAGAGAGAAGATGACTCAAATCATGTTTGAGAC CTTCAATGTGCCTGCAATGTATGTTGCTATCCAGGCTGTCCTTTCCCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACTGGTATTGTGCTGGATTCTGGT GATGGTGTGTCTCACACTGTGCCCATCTATGAAGGGTATGCCCTTCCACATGCCATCCTTCGTTTGGATCTTGCTGGTCGTGATCTCACTG ATGCTTTGATGAAGATCCTCACCGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACGGGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAACTTGC ATATGTTGCCCTTGACTATGAGCAGGAGCTTGAGACTGCCAAGAGTAGCTCCTCTGTTGAGAAGAACTATGAGCTACCTGATGGTCAGGTC ATCACCATTGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTCTCATCGGAATGGAAGCTGCTGGTATCCACGAGACTA CTTACAATTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATATCAGAAAGGATCTATATGGTAATATTGTGCTCAGTGGTGGTTCCACTATGTTCCCTGG TATTGCTGACCGTATGAGCAAGGAAATCACTGCCCTTGCCCCAAGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTTGCACCACCAGAGAGAAAATACAGT GTCTGGATTGGAGGGTCAATCCTTGCATCTCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTTCCAAGGGTGAGTACGACGAGTCTGGCCCATCCA TCGTCCACAGGAAGTGCTTCTAAGTTCCGAACAGTGCGGTGATGGTGAGTTCTTTCTTTCTATTTAGTTGGCTTTTTTCGTGTCAAGGTGT CATGAACTCAAAGTCCTAGTTGATATGGAGAATTTGTTGAGGTGGGGGTCATTGAAGGAGGGAACATTCTGATATTCAATGTATCGAATAG GCTTGTGATTCGATGTTGTTATTGCTGCTTTTTAAGATGCGCAACTGTAATGGTCCTCCCTCTCGATGTGGTGGTCAGACACTTTGGTAGT CAAGCTCTTTGCTTTCTTCCACATCATCTGTGGTTCAACCTTGCGTCTTTTTAGTAGGATGCTTGTAGACGGAGAGTGGTTGTGATGATGC
rp rp rp rp rp rpy^rp rp rp rp rpy^rp rp rp rp rp rp rp rp rpCCATCTCAACATTTGAAGGTGTTTTTTTCCTTGGGAACATTAATGTTAATAGTTATTGTATGAGAAATTTTGTGTTAGTGTCAATTTG根據(jù)登錄號XM_002^8674報道的Actin 1基因序列作為RT-PCR擴增內參基因 Actin片段，設計了如下另一對引物對，其DNA序列如下β -Actin (Τ60)-F :5，-ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG-3，(序列表編號 SEQ ID NO 5)，β -Actin (Τ60)-R :5，-CCAAGCAGCATGAAGATCAA-3，(序列表編號 SEQ ID NO 6)。序列全長為1819bp，其物種為毛果楊(Populus trichocarpa)，楊屬植物，其mRNA 片段如下所示(序列表編號SEQ ID NO 4)AACCCTTACACTCCTCCATTTTCGTCTCACCCTCTCTCTCGAGCGCAACCACCAGCTAGCAAGTCAGGC AGGCCACATCTTTCGCTAGACTTGGCTTGGTCTGTTTCGCTCTCTGTCTCTAGATATCTCCTCTGTCTCCGACTTCAAAAGAATTTGTAGA AAATGGCCGATGCCGAGGATATTCAACCCCTTGTCTGTGACAATGGAACTGGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGCAGGTGATGATGCACCCAG GGCAGTGTTTCCCAGTATTGTGGGTAGACCAAGACACACTGGTGTCATGGTTGGAATGGGGCAGAAGGATGCCTATGTTGGTGATGAAGCA CAATCTAAAAGAGGTATCTTGACCTTGAAATACCCCATTGAGCACGGTATTGTAAGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATTTGGCATCACA CTTTCTACAATGAGCTTCGTGTTGCTCCTGAAGAGCACCCAGTCCTCCTGACTGAGGCTCCCCTCAACCCTAAGGCTAACAGAGAGAAGAT GACTCAAATTATGTTTGAGACCTTCAATGTTCCTGCAATGTATGTTGCCATCCAGGCTGTCCTTTCCCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACT GGTATTGTGTTGGATTCTGGTGATGGTGTGAGTCACACTGTGCCAATCTATGAAGGTTATGCCCTTCCACACGCCATCCTTCGTTTGGATC TTGCTGGTCGTGACCTCACCGATGCTTTGATGAAGATTCTGACTGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACGGGAAATTGTCCG TGATATGAAGGAGAAACTTGCGTATGTTGCCCTCGACTACGAGCAGGAGCTTGAGACTGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTTGAGAAGAACTAC GAGCTTCCTGATGGTCAGGTCATCACCATCGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCTTCTCTCATTGGAATGGAAG CTGCTGGCATCCACGAGACTACATACAACTCAATCATGAAGTGTGATGTGGATATTAGAAAGGATCTGTATGGTAACATTGTGCTCAGTGG TGGTTCCACTATGTTCCCTGGTATTGCTGACCGAATGAGCAAGGAGATCACCGCCCTTGCCCCAAGCAGCATGAAGATCAAGGTGGTTGCA CCACCAGAGAGAAAGTACAGTGTCTGGATTGGAGGATCTATCCTTGCTTCCCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTTCCAAGGGTGAGT ATGATGAGTCTGGCCCATCCATTGTCCACAGGAAGTGCTTCTAAGTTCTACAAGTGCTTTGATGGTGAGTTCTTTTTCCTATTTAGTTGGC TTTTTTCGTGTCAAGGTGTCATGAACTCAAAGTCCTGGTTGATATGGAGAATTTATTGAGGTGGGGGTCACTGAAGGAGAAGGGAACATTC TGATCTTCTATGTATCGAATAG
GCCTGTGATTCAATGTTGATATCGCTGCCATTTGTGAAGCTTAAACTGTAATGGTCCTCCCTCCGGATG TGGTGGGCAGACAGACACTTTGGTAATCAAGTTCTTTGCTTCCCTCACATCATCACCAATGGTTCAACCTTGTGTCTTTTTTAGTAGGATG CTTGTAGTCGGAGAGTGATTGTGATGATGCTTTTCTATTTTTATTTTTTTTCCATCTCGACATTTGAAGGGTTTATTTTTTTTTCCTGGGA ACATTAATGTTAATAGTTATTGTATGAGAAATTTTATGTTAGTGTCAATTTGCTTTCATAAACCCTATGGAAATCATATTTAATACTTTTG TTTGAACTTTGAATTGATCTTPCR反應體系如下
權利要求
1.一種分離柑橘類植物、煙葉或梨腐爛病菌絲體總RNA純化試劑組合物，其特征在于， 包括以下組分1)溶液Aa.按重量/體積計異硫氰酸胍50%；b.醋酸鈉0. lmol/L ；c.氯化鈉0. 25mol/L ；d.氯化鎂IOmmol/L ；e.按重量/體積計十二烷基肌氨酸鈉0.7% ；f.糖原60 μ g/ml ；g.按體積/體積計β-巰基乙醇0. 5%2)溶液B:ρΗ4. 0-5. 0的水飽和酚；3)裂解液a.按體積/體積計，溶液A50% -55% ；b.按體積/體積計，溶液B50% -45% ；c.按重量/體積比甲基紅0.2%o ；將溶液A和溶液B按體積比1 1混合后，加入甲基紅使溶液呈玫瑰紅色，即為所述的裂解液。
2.一種分離柑橘類植物、煙葉或梨腐爛病菌絲體總RNA的方法，其特征在于包含以下步驟(1)、制備RNA純化試劑組合物1)溶液Aa.按重量/體積計異硫氰酸胍50%；b.醋酸鈉0. lmol/L ；c.氯化鈉0. 25mol/L ；d.氯化鎂IOmmol/L ；e.按重量/體積計十二烷基肌氨酸鈉0.7% ；f.糖原60 μ g/mlg.按體積/體積計β-巰基乙醇0. 5%2)溶液B:ρΗ4. 0-5. 0的水飽和酚；3)裂解液a.按體積/體積計，溶液A50% -55% ；b.按體積/體積計，溶液B50% -45% ；c.按重量/體積比甲基紅0.2%o ；將溶液A和溶液B按體積比1 1混合后，加入甲基紅使溶液呈玫瑰紅色，即為所述的裂解液；(2)樣品裂解根據(jù)樣品稱重，按照每0. Ig樣品添加Iml裂解液的比例吸取裂解液于離心管中，將樣品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的離心管中劇烈震蕩，樣品勻漿后在室溫下放置5min， 然后置于冰上直至所有樣品勻漿完成，不立即進行RNA提取的樣品可將勻漿置于-20°C保存；⑶抽提按每Iml裂解液添加200 μ 1氯仿的比例向勻漿中加入氯仿，劇烈震蕩使溶液呈乳濁狀，冰上靜置5min后于4°C下離心，離心后吸取上層水相于新離心管中并加入等體積氯仿再次抽提，離心，除去水相中殘余的酚；(4)沉降RNA吸取上層水相于新離心管中，加入等體積異丙醇，冰上至室溫25°C放置IOmin后，離心回收RNA ；(5)洗滌溶解RNA在室溫條件下，用濃度為75%的乙醇使RNA沉淀懸浮，洗滌1-2次后，將其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯處理的去離子水中。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學方法領域，涉及一種分離植物或微生物總RNA的試劑組合物及制備方法。以異硫氰酸胍、苯酚為主要成分，以NaCl、MgCl2等提供陽離子，以醋酸鈉-醋酸緩沖系統(tǒng)穩(wěn)定溶液pH，經氯仿簡單抽提后，即可得高質量的RNA。由于本發(fā)明的RNA提取試劑中添加了糖原作為核酸沉淀劑，與同類試劑相比，核酸的沉降效率大為提高，對組織樣品中含量很低的核酸成分亦能有效分離。使核酸沉降過程短時間內即可完成，免除了-20℃沉降數(shù)小時的過程，大大縮短了操作時間。該方法快捷、高效，適用樣品廣泛，比商業(yè)化TRIzol試劑更為廉價。克服了傳統(tǒng)方法樣品選擇性強、操作繁瑣、效率較低等缺點。且操作更為靈活，樣品勻漿后可于-20℃保存3天再進行RNA的提取。
文檔編號C12N15/10GK102443580SQ201010509840
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權日2010年10月15日
發(fā)明者丁芳, 徐文興, 楊帆, 洪霓, 王利平, 王國平 申請人:華中農業(yè)大學