專利名稱：綿羊α-TTP基因，及其克隆方法和編碼的蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種綿羊α-TTP基因，及其克隆方法和編碼的蛋白。
背景技術(shù)：
作為機(jī)體必需的脂溶性維生素，維生素E自其被發(fā)現(xiàn)以來就受到了人們的重視和廣泛的研究，其中，關(guān)于其抗氧化作用的研究尤為深入(Traber等，2007)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除了抗氧化功能外，維生素E在調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Zingg，2007)和基因表達(dá)(Zingg 等，2004)方面也起著重要的作用。另外，維生素E還可與一些未知蛋白互作發(fā)揮氧化還原反應(yīng)感受器的作用(Azzi，2007)，而且維生素E在細(xì)胞膜上也具有一些特定的功能(Zingg， 2007 ；Quinn, 2004 ；Atkinson等，2008)。然而，關(guān)于維生素E方面的研究主要集中在其生理功能方面，關(guān)于維生素E作用機(jī)制的研究報道較少，特別是維生素E在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理到目前為止仍不清楚。Catignani等于1975年率先在小鼠肝臟細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了一種可以特異性結(jié)合α-生育酚(維生素E在機(jī)體內(nèi)生物活性最高的形式)的蛋白，由于這種蛋白可以提高α-生育酚在膜間的轉(zhuǎn)運(yùn)，所以被稱為α-生育酚結(jié)合蛋白(α-tocopherol binding protein, a-TBP)或 α-生育酚轉(zhuǎn)移蛋白(a -tocopherol transfer protein, α -TTP) (Sato等，1991)。α -TTP具有多種重要的生物學(xué)功能，其最重要的作用是特異性地結(jié)合 α-生育酚，將α-生育酚轉(zhuǎn)運(yùn)到組織器官進(jìn)行利用，發(fā)揮作用(Regina Brigelius-Flohe, 2009)。研究發(fā)現(xiàn)，α -生育酚被小腸吸收后通過乳糜微粒進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，并以乳糜微粒殘基的形式進(jìn)入肝臟細(xì)胞。在肝臟細(xì)胞胞質(zhì)中，α-TTP特異性地結(jié)合α-生育酚，使其主要被極低密度脂蛋白吸收。隨后，α-生育酚被轉(zhuǎn)運(yùn)至各組織進(jìn)行利用(Akihiro等，1997)。通過轉(zhuǎn)運(yùn)和分布α-生育酚，α-TTP可以維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)和繁殖功能的正常性。研究表明，人類中α -TTP基因缺失會導(dǎo)致循環(huán)中的生育酚水平極低，并引發(fā)維生素E缺乏性共濟(jì)失調(diào)癥 (Sokol, 1988 ；Traber等，1996)，而小鼠α -TTP基因表達(dá)受阻后表現(xiàn)為血漿和組織中維生素E含量下降，出現(xiàn)同人類類似的神經(jīng)癥狀，而且還出現(xiàn)了不育(Terasawa等，2000 ；Yokota 等，2001 Jishage等，2001)。盡管這些現(xiàn)象都清楚地表明α-TTP是調(diào)節(jié)維生素E的主要物質(zhì)，但是α-TTP的具體功能目前仍不是特別清楚。無論從基因水平還是蛋白水平研究α -ΤΤΡ，其基因序列信息都是必不可少的基礎(chǔ)條件。目前，人類、家鼠、牛等動物α-TTP的基因序列均已在GenBank上公布，而尚未見任何有關(guān)綿羊α-TTP基因序列的報道，這對進(jìn)行綿羊α-TTP的相關(guān)基因研究造成了極大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種綿羊α-TTP基因，及其克隆方法和其所編碼的蛋白。綿羊α -ΤΤΡ，其為由SEQ ID No. 2所示氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或2)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第(173)位的(F)替換為(L)，或是將第00)位的(G)缺失，或是在042位后面)增加(一個K)。因此，本發(fā)明的綿羊α-TTP蛋白還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，具有綿羊α-TTP蛋白同等活性的由綿羊α-TTP蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核苷酸序列。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。本發(fā)明提供的綿羊α -TTP基因是從綿羊中通過RT-PCR及RACE技術(shù)克隆得到， 其cDNA全長為l，098bp，包含一個完整的開放閱讀框849bp，其基因序列同人、牛、家鼠、褐家鼠、黑猩猩、獼猴和犬α-TTP基因的同源性分別為85%、98%、84%、84%、85%、85%和 90%，相應(yīng)氨基酸序列同源性分別為89%、99%、85%、84%、89%、89%和84%。本發(fā)明的另一個目的是提供克隆綿羊α-TTP基因的方法，包括如下步驟1)通過比對GenBank上已經(jīng)公布的人、牛、家鼠α -TTP的cDNA序列，得出同源保守序列；2)提取綿羊肝臟RNA，利用RT-PCR在綿羊體內(nèi)擴(kuò)增該同源保守片段；3)根據(jù)所得到的片段序列，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到綿羊α -TTP的全長基因。本發(fā)明還提供含有上述綿羊α -TTP基因或其片段的載體，以及含有該載體的宿主細(xì)胞；所述載體為所述綿羊α -TTP基因的克隆載體或各類表達(dá)載體。本發(fā)明另一個目的在于提供綿羊α-TTP在綿羊維生素E代謝調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。本發(fā)明首次成功地在綿羊體內(nèi)擴(kuò)增得到了 α-TTP的全長基因，該成果可以為綿羊α-TTP的相關(guān)基因研究提供分子基礎(chǔ)，并使得研究綿羊α-TTP的蛋白功能成為可能。 另外，本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上獨(dú)具創(chuàng)新，相較于傳統(tǒng)的構(gòu)建cDNA文庫篩選基因的方法，利用 RACE技術(shù)克隆全長基因具有快速、簡便、靈敏度和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，可極大提高結(jié)果的準(zhǔn)確性、正確性和研究速度，因而可以大力節(jié)約人力、物力和財(cái)力。本發(fā)明提供的綿羊α-TTP可應(yīng)用于綿羊維生素E的代謝調(diào)節(jié)及機(jī)理闡述。


圖1為綿羊肝臟總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖，M :DL2，OOODNAMarker ；1 綿羊肝臟組織總RNA (DNase I處理)。圖2為同源保守序列PCR產(chǎn)物電泳圖，M :DL2, OOODNAMarker ；1 :PCR產(chǎn)物；2 空白對照。圖 3 為 3，RACE 產(chǎn)物電泳圖，M :DL2, 000DNA Marker ； 1 :3，RACE 產(chǎn)物；2 空白對照。圖 4 為 5，RACE 產(chǎn)物電泳圖，M :DL2, 000DNA Marker ； 1 :5，RACE 產(chǎn)物；2 空白對照。圖5為RACE結(jié)果驗(yàn)證電泳圖，M :DL2，OOODNAMarker ；1 =PCR產(chǎn)物；2 空白對照。
圖6為綿羊α -TTP與其它物種α -TTP的進(jìn)化樹分析。圖7為飼喂不同水平維生素E后的綿羊α -TTP的相對表達(dá)量。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1綿羊α -TTP基因全長的克隆通過比對GenBank上已經(jīng)公布的人(GenBank登錄號ΝΜ_000370)、牛(GenBank登錄號ΧΜ_587081)和家鼠(GenBank登錄號ΝΜ_015767) α-TTP的cDNA序列，得出一段長為 572bp的同源保守序列，人、牛和家鼠α-TTP基因序列中相應(yīng)的保守序列分別位于其284 855bp、l 445bp 和 264 835bp 處。利用RNApr印pure動物組織總RNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄號DP431)提取綿羊肝臟RNA，對其進(jìn)行DNase I處理后取Iul進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。結(jié)果顯示RNA提取效果良好，無降解現(xiàn)象。利用RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后根據(jù)比對后確定的同源保守序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，進(jìn)而利用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。其中，上游引物序列如SEQ ID No. 3所示，下游引物序列如 SEQ ID No. 4 所示。其中，PCR反應(yīng)體系為 50μ 1 模板 cDNA 2μ1;1 XcDNA DilutionBuffer II 8μ 1 ；上下游弓I 物(ΙΟμπιοΙ/L)各 2μ 1 ;2XGC Buffer I 25 μ 1 ； TaKaRa LA Taq (5U/ μ 1)0. 5μ 1 ；加水補(bǔ)足至50 μ 1。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min ；94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，然后經(jīng)切膠回收連接到PMD19-T載體(購自大連寶生物公司，產(chǎn)品目錄號D102A)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。對測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對后發(fā)現(xiàn)其與上述同源保守序列相似性較高， 因此，可以認(rèn)定已成功在綿羊體內(nèi)擴(kuò)增得到該段同源保守序列。設(shè)計(jì)3 ’ RACE引物，其中上游引物序列如SEQ ID No. 5所示，下游弓|物序列如SEQ ID No. 6所示。然后以實(shí)施例2制備的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件均按照試劑盒里的步驟進(jìn)行。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳(圖3)，其PCR產(chǎn)物(約0. 3kb)經(jīng)切膠回收后測序。設(shè)計(jì)5，RACE引物，其上游引物序列如SEQ ID No. 7所示，下游引物序列如SEQ ID No. 8所示。首先按照試劑盒的步驟對綿羊肝臟總RNA進(jìn)行CIAP、TAP處理，然后與5’ RACE接頭連接后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件均按照試劑盒里的步驟進(jìn)行。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖4)，其PCR產(chǎn)物(約 0. 3kbp)經(jīng)切膠回收后測序。為了驗(yàn)證擴(kuò)增得到的cDNA 3’端和5’端為目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)上游引物，序列如SEQ ID No. 9所示，設(shè)計(jì)下游引物，序列如SEQ ID No. 10所示進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例2。經(jīng)PCR驗(yàn)證，共得到產(chǎn)物約840bp(圖5)。根據(jù)3，和5，RACE產(chǎn)物以及同源保守序列的序列信息及片段大小分析，證明得到的5’及3’ RACE序列是根據(jù)上述同源保守序列得到的，RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確可信。結(jié)果表明，共得到的5，端未知序列和257bp的3， 端未知序列。實(shí)施例2綿羊α -TTP及其編碼的蛋白的生物信息學(xué)分析本發(fā)明利用RT-PCR和RACE技術(shù)成功在綿羊體內(nèi)擴(kuò)增出α-TTP全長基因共 l，098bp。經(jīng)生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，該全長基因及其所編碼蛋白具有以下特點(diǎn)1、測序結(jié)果表明綿羊α -TTP cDNA全長基因包含翻譯起始信號和多聚腺苷化信號，cDNA 基因全長 1098bp，包含 23bp 的 5，_UTR、226bp 的 3，-UTR 以及 849bp 的 CDS 區(qū)，共編碼282個氨基酸，其序列如SEQ ID No. 2所示。 2、基因序列與進(jìn)化樹分析經(jīng)GenBank blastp軟件比對后的結(jié)果顯示，綿羊α -TTP基因與其它哺乳類動物 α-TTP基因及相應(yīng)氨基酸序列同源性均較高，其基因序列與人、牛、家鼠、褐家鼠、黑猩猩、 獼猴和犬0-11 基因的同源性分別為85%、98%、84%、84%、85%、85%和90%，其氨基酸序列的同源性分別為89%、99%、85%、84%、89%、89%和84% ；但是，其基因及氨基酸序列與家雞和鮐魚的同源性相對較低，基因序列同源性分別只有75%和71%，氨基酸序列同源性則分別僅為72^^ΠΜ%。根據(jù)氨基酸序列比對結(jié)果，繪出綿羊α-TTP基因與其它物種成員之間的同源關(guān)系進(jìn)化樹(圖6)。其中，它與牛、人等哺乳動物的遺傳距離較近，而與家雞和鮐魚等非哺乳動物的遺傳距離較遠(yuǎn)。由此可以推測，α-TTP基因在哺乳動物中高度保守，而這種高度種間保守性預(yù)示其對于維護(hù)機(jī)體正常的生理功能具有重要的意義，同時也預(yù)示著α -TTP基因在哺乳動物和非哺乳動物中發(fā)揮作用的機(jī)制可能有所不同。3、序列特性及功能結(jié)構(gòu)域分析(1)根據(jù)綿羊α-TTP基因的⑶S區(qū)推測，該基因編碼一個含有282個氨基酸的蛋白多肽，其分子量約為32.01kD，等電點(diǎn)(pi)為6. 46，屬于弱酸性蛋白，穩(wěn)定指數(shù) (instability index)為38. 77，表明該蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。(2)利用Prosite數(shù)據(jù)庫對綿羊α -ΤΤΡ蛋白序列進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。結(jié)果表明，該蛋白具有1個％cl4p超基因家族序列的信號肽序列kcl4p (87-252位氨基酸)，此結(jié)構(gòu)域被稱為％cl4p樣脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一般存在于分泌型蛋白和脂質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白中，該結(jié)構(gòu)域同G蛋白β/γ亞基相互關(guān)聯(lián)。(3)TMHMM-2. 0分析表明，綿羊α -TTP蛋白氨基酸序列沒有發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，說明此蛋白不具備跨膜作用。N-末端的信號肽序列分析結(jié)果也表明，綿羊α-ΤΤΡ蛋白出現(xiàn)信號肽和信號錨定的可能性均為0，不具有跨膜功能，這與跨膜區(qū)分析和疏水性分析的結(jié)果一致。4、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(conserved domain database, CDD)對綿羊α-TTP蛋白進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測。結(jié)果表明，與該基因匹配的蛋白保守區(qū)僅包含1個保守區(qū)，即SEC14保守域，其 E-value 值為 6. 19e46。實(shí)施例3綿羊α -TTP基因調(diào)節(jié)維生素E水平在內(nèi)蒙古赤峰市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所試驗(yàn)羊場選取21只體重相近的五月齡敖漢細(xì)毛羊公羊(購自內(nèi)蒙古自治區(qū)敖漢細(xì)毛羊種羊場)，隨機(jī)分為七組，其日糧中維生素E添加水平分別為0 (對照組)、20、100、200、1000、2000、MOOIU/羊·天―1，飼養(yǎng)周期為一年，試驗(yàn)結(jié)束時屠宰動物，采集肝臟樣品，樣品經(jīng)液氮速凍后放于-80°C保存?zhèn)溆?。利用RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄號DP431) 提取綿羊肝臟RNA。用常規(guī)方法合成cDNA后進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增，Real-TimePCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄號FP202-02。根據(jù)擴(kuò)增得到的綿羊α -TTP全長基因及綿羊β -actin內(nèi)參基因(GenBank登錄號ΝΜ_001009784)設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR引物。其中β-actin的上下游引物分別如SEQ ID No. 11和12所示，綿羊α -TTP基因的上游引物序列分別如SEQ ID No. 13和14所示。PCR程序如下表所示
權(quán)利要求
1.一種綿羊α-TTP蛋白，其為1)由SEQID No. 2所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或2)在SEQID No. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的綿羊α-TTP基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.克隆權(quán)利要求2或3所述基因的方法，其包括如下步驟1)比對GenBank上已經(jīng)公布的人、牛、家鼠α-TTP的cDNA序列，得出同源保守序列；2)提取綿羊肝臟RNA，利用RT-PCR在綿羊體內(nèi)擴(kuò)增該同源保守片段；3)根據(jù)所得到的同源保守序列，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到綿羊α-TTP的全長基因。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
6.含有權(quán)利要求5所述載體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求2或3所述基因在綿羊維生素E代謝調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種綿羊的α-TTP基因及其編碼的蛋白和其克隆方法。本發(fā)明提供一種綿羊的α-TTP蛋白，其為1)由SEQ ID No.2所示氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因及該基因的克隆方法。本發(fā)明成功地在綿羊體內(nèi)擴(kuò)增得到了α-TTP的全長基因，該成果可以為綿羊α-TTP的相關(guān)基因研究提供分子基礎(chǔ)，并使得研究綿羊α-TTP的蛋白功能成為可能。
文檔編號C12N1/21GK102443054SQ201010510250
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者劉昆, 羅海玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)