專利名稱：一種利用ssr指紋圖譜鑒別紫云英品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種利用SSR指紋圖譜鑒別綠肥作物紫 云英品種的方法。
背景技術(shù)：
紫云英(學(xué)名-Jistragalus ^iflicm)是豆科黃芪屬的植物。屬一年生或越年生草 本。又稱紅花草、翹搖。廣泛分布于北緯25 33度地區(qū)，多生長(zhǎng)在溪邊、山坡及潮濕處。中 國(guó)早在明、清時(shí)代就已在長(zhǎng)江中下游地區(qū)大面積種植。紫云英主根較肥大，一般入土 40 50厘米，側(cè)根入土較淺。紫云英主根、側(cè)根及地表的細(xì)根上都能著生根瘤，以側(cè)根上居多 數(shù)。莖呈圓柱形，中空，柔嫩多汁，有疏茸毛。栽培品種株高一般80 120厘米，野生的只 有10 30厘米。葉多數(shù)為奇數(shù)羽狀復(fù)葉，具7 13枚小葉。小葉全緣，倒卵形或橢圓形。 花為傘形花序，一般腋生，少頂生，常有小花8 10多，族生在花梗上，排列成輪狀。莢果兩 列，聯(lián)合成三角形，稍彎，無(wú)毛，頂端有喙。每莢有種子4 10粒，種子腎狀，種皮光滑，一般 黃綠色。千粒重3 3. 5克?，F(xiàn)在中國(guó)南方多用作稻田冬季綠肥栽種，一般在秋季套播于 晚稻田中，作早稻的基肥。紫云英除用作綠肥外，還能直接或青貯紫云英作飼料，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 頗高。目前，紫云英的品種鑒別以生育特性與形態(tài)外觀為主按生育期和成熟期可分 早、中、晚3個(gè)類型。紫云英的主要優(yōu)良品種，早熟種有信陽(yáng)種、樂(lè)平種、閩紫1號(hào)等，中熟種 有余江大葉籽、萍寧3號(hào)、常德種、閩紫6號(hào)等，晚熟品種有寧波大橋種、浙紫5號(hào)等。由于 紫云英異花傳粉，雜交率較高，單靠形態(tài)觀察與生長(zhǎng)特性難以準(zhǔn)確地進(jìn)行品種的鑒別。為了 更好地進(jìn)行品種識(shí)別，達(dá)到保護(hù)品種知識(shí)權(quán)益的目的，需要有更為快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行品種鑒 別的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用SSR指紋圖譜鑒別紫云英品種的方法，可以更準(zhǔn)確地從植物基 因的分子水平鑒別紫云英品種資源。本發(fā)明利用SSR指紋圖譜用于鑒別紫云英品種，其中涉及一種紫云英基因 組中特定的SSR位點(diǎn)，所述特定的SSR位點(diǎn)的序列由6條序列組成，其序列由短到長(zhǎng) 排歹丨J 為① ACACACACAACACACACAAACACA ；② ACACACACACACACACAAACAAACACAAACAC ； ③ CTCTCTCTGATCTCTCTCTCCCTCTCCC TCTCCCTCTCCCTCT ；④ CTCTTCCTCTTCTTCTCTTTCATATG CTCCACT CTTCCTCTCTTCTTCTCT ；⑤ CCC ACACCACCACTCACCAACATCACCACTCACACACCAGCACCTTC CACTCCCTTCAACCACCCCCACCACTACTCAAACACCACCATCTCACCA ； ACACACACACACACACACACACGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGAGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACGTGCGCGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGCGT GCGTGTGTGTGTGTGT。
上述紫云英基因組中特定的SSR位點(diǎn)的兩側(cè)設(shè)計(jì)的引物序列由6對(duì)引物對(duì)組成， 引物對(duì)序列如下① EG6-54 上游CGCCCATAAATCTCTTCCA 下游CTCCCTTTGATCAATCTCGC ；
②EG6-167 上游TTTCACTTCTAGAAATTTGTTGACA，下游ATGGATGGTCAACTCGGTAAC ；
③Bm2-8 上游:GCTCGGCCTTTCACATGG,下游GAGAAATAGGTACCAGTTCTAGGG ；
④Lm2-44 上游GATTGACAAAGTCTGCCG，下游ATGCTCCCCTCTTCACACA ；⑤ EG6-170 上 游GGCCAACACTCACTACCCTCAT，下游CAACCAACGATCACTCCCACC ；⑥ YAGT37 上游 CGCCCATAAATCTCTTCCA，下游TGCGCACACACAACG。引物的篩選方法，包括下列步驟紫云英 總DNA的提取；用親和磁珠富集紫云英基因組中的SSR位點(diǎn)，SSR位點(diǎn)兩側(cè)引物的設(shè)計(jì)篩 選；PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物電泳及染色，根據(jù)電泳結(jié)果篩選具有多態(tài)性的引物。其中所述紫云英總DNA提取方法，以紫云英品種幼苗或成熟植株的葉片或莖段中 的一種或兩種為材料，提取基因組DNA，具體的操作步驟為①稱取0. 1克植物組織，用去離 子水沖洗干凈，迅速轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中；②加入液氮，迅速用電鉆搗碎，加入600mlCTAB ； ③65°C水浴lh，混勻；④加等體積的氯仿一異戊醇，氯仿與異戊醇的體積比為24 :1，混勻；
⑤12000rpm離心6min，取上清液；⑥向上清液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇或2/3體積的異 丙醇沉淀DNA，-20°C放置20min ；⑦12000rpm離心6min，棄上清液；⑧加75%的乙醇清洗 DNA, 12000rpm離心2min，棄上清液；⑨風(fēng)干后加入50ul的TE緩沖液溶解DNA，備用。所述PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為25 μ L的PCR反應(yīng)體系中包括提取的DNA溶 液 1 yL, 10nmol/L 引物 2 μ L, 2. 5 mmol/LdNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA聚合酶1 U ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性7min;隨后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變 性 30 s, 55°C退火 30 s, 72°C延伸 30s;最后 72°C延伸 10 min。所述PCR產(chǎn)物電泳及染色，采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯色。本發(fā)明的一種利用SSR指紋圖譜鑒別紫云英品種的方法，其特征在于所述方法 包括(1)紫云英總DNA的提?。?2)根據(jù)所述特定的SSR位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物；(3)對(duì)引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳及染色，形成不同紫云英品種的SSR指紋圖譜，然后進(jìn)行 紫云英的品種鑒別。其中所述紫云英總DNA提取方法，以紫云英品種幼苗或成熟植株的葉片或莖段中 的一種或兩種為材料，提取基因組DNA，具體的操作步驟為①稱取0. 1克植物組織，用去離 子水沖洗干凈，迅速轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中；②加入液氮，迅速用電鉆搗碎，加入600mlCTAB ； ③65°C水浴lh，混勻；④加等體積的氯仿一異戊醇，氯仿與異戊醇的體積比為24 :1，混勻； ⑤12000rpm離心6min，取上清液；⑥向上清液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇或2/3體積的異 丙醇沉淀DNA，-20°C放置20min ；⑦12000rpm離心6min，棄上清液；⑧加75%的乙醇清洗 DNA, 12000rpm離心2min，棄上清液；⑨風(fēng)干后加入50ul的TE緩沖液溶解DNA，備用。所述PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為25 μ L的PCR反應(yīng)體系中包括提取的DNA溶 液 1 yL, 10nmol/L 引物 2 μ L, 2. 5 mmol/LdNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA聚合酶1 U。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性7min;隨后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變 性 30 s, 55°C退火 30 s, 72°C延伸 30s;最后 72°C延伸 10 min。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
1)以提取的紫云英總DNA為鑒定材料，它可以在紫云英的任何生長(zhǎng)時(shí)期與生長(zhǎng)部位進(jìn) 行取材提取而不影響反應(yīng)結(jié)果，從而避免紫云英生長(zhǎng)狀態(tài)與生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)品種鑒別的干擾與影響；2)采用的分子標(biāo)記技術(shù)為微衛(wèi)星分子標(biāo)記，也稱SSR標(biāo)記。這種標(biāo)記廣泛隨機(jī)分布于 真核生物基因組中，具有高度的多態(tài)性、高信息含量、高度的可重復(fù)性和共顯性遺傳方式。 因此，SSR標(biāo)記方法比其他標(biāo)記方法具有簡(jiǎn)便、快捷、特異、穩(wěn)定、所揭示的等位基因多樣性 高等特點(diǎn)；3)通過(guò)大量的篩選工作，得到了可在紫云英不同品種中形成多態(tài)性的SSR位點(diǎn)， 用這種SSR位點(diǎn)兩翼序列設(shè)計(jì)的引物，可以用于構(gòu)建紫云英不同品種的指紋圖譜，達(dá)到鑒 別紫云英品種的目的。


圖1為引物EG6-54的指紋帶型； 圖2為引物EG6-167的指紋帶型；
圖3為引物Bm2-8的指紋帶型； 圖4為引物L(fēng)m2-44的指紋帶型； 圖5為引物EG6-170的指紋帶型； 圖6為引物YAGT37的指紋帶型；
圖7為紫云英9個(gè)參試品種在75bp-300bp范圍形成的指紋帶型。
具體實(shí)施例方式1、紫云英總DNA的提取
(1)參試紫云英品種1 閩紫1號(hào)；2 信陽(yáng)種；3 寧波大橋種；4 =8324411 ；5 閩紫6 號(hào)；6:8410441; 7 :8487711 ;8 弋江籽；9 余江大葉籽；其中閩紫1號(hào)、8324411、閩紫6 號(hào)、8410441、8487711由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，信陽(yáng)種由河南省信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提 供，余江大葉籽由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，弋江籽由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，寧波大橋種由 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。(2)以紫云英品種幼苗為材料，采用CTAB法提取基因組DNA，由于CTAB法對(duì)于 不同作物的提取程序有所不同，我們經(jīng)過(guò)改進(jìn)，簡(jiǎn)化了針對(duì)紫云英的步驟，具體過(guò)程為① 稱取0. 1克植物組織植物組織包括紫云英幼苗的莖和葉的部分，用去離子水沖洗干凈，迅 速轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中；②加入液氮，迅速用電鉆搗碎，加入600mlCTAB(CTAB購(gòu)自Amresco 公司)；③65°C水浴Ih (每20min反轉(zhuǎn)搖勻一次)；④加等體積的氯仿一異戊醇(體積比24 1)，顛倒混勻；⑤12000rpm離心6min，取上清于新管中；⑥向上清中加入2倍體積的無(wú)水乙 醇(或2/3體積的異丙醇)沉淀DNA，-20°C放置20min ’⑦12000rpm離心6min，去上清；⑧ 加75%的乙醇清洗DNA，12000rpm離心2min，去上清；⑨風(fēng)干后加入50ul的TE緩沖液溶 解DNA，備用；上述使用的有機(jī)溶劑均購(gòu)自北京化工廠。2.用親和磁珠富集紫云英基因組中特定的SSR序列本步驟應(yīng)用Invitrogen公 司的Dynal磁珠與生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針(CT) 15、(AG) 15、(GT) 15、(AC) 15與紫云英基因組 DNA酶切片段雜交，酶切使用的內(nèi)切酶為Ec0RI，MSeI，均購(gòu)自NEB公司，酶切步驟為；取10 μ g提取的紫云英DNA在50 μ 1反應(yīng)體系中用限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI酶切消化3小 時(shí)，取5μ1酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)酶切效果，確定酶切完全。而后按Dynal磁珠的操作說(shuō)明用 以捕獲300-1500 bp含有微衛(wèi)星序列的DNA片段，連接到pMD18_T載體(購(gòu)自Takara公 司)中，構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的小片段插入文庫(kù)。利用PMD18-T載體兩端的測(cè)序接頭引物(引物可以直接購(gòu)自Takara公司也可以按其產(chǎn)品目錄提供的序列合成)和根據(jù)微衛(wèi)星核心 序列設(shè)計(jì)的引物(CT) 15、(AG)15, (GT)15, (AC)15 (由上海生工合成)配合組成引物對(duì)用以直接 進(jìn)行文庫(kù)PCR篩選，從800個(gè)轉(zhuǎn)化子中獲得了 236個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，獲 得了 133個(gè)微衛(wèi)星序列，微衛(wèi)星序列的富集效率達(dá)到16. 7%。3. SSR引物的設(shè)計(jì)篩選及PCR擴(kuò)增含有微衛(wèi)星序列的DNA片段對(duì)SSR序列進(jìn)行 分析，其中35個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)序列的兩端均存在較長(zhǎng)的堿基序列(>30bp)。據(jù)其設(shè)計(jì)特異 引物對(duì)，對(duì)9個(gè)品種紫云英全基因組DNA進(jìn)行2次篩選。PCR反應(yīng)體系為25 μ L的PCR 反應(yīng)體系中包括提取的DNA溶液1 yL，10nmol/L引物2 μ L, 2. 5 mmol/LdNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA 聚合酶 1 U。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 7min ；隨后 30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸30s ；最后72°C延伸10 min0由于SSR引物具有很高的特異性，這些引物對(duì)一般的反應(yīng)結(jié)果可以分為不反應(yīng)、無(wú)多 態(tài)性以及有多態(tài)性。根據(jù)PCR的電泳結(jié)果只選取帶型清晰，且有多態(tài)性的引物形成的不同 指紋帶型作為品種鑒別的依據(jù)。這里不必要進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，因?yàn)榻y(tǒng)計(jì)的結(jié)果主要用于構(gòu)建 品種聚類群，而無(wú)助于進(jìn)行品種間的鑒別。結(jié)果共得到可在不同品種中可擴(kuò)增出帶型清晰， 且有多態(tài)性的6對(duì)引物。證明這些引物對(duì)之間的SSR位點(diǎn)在紫云英不同品種的基因組中存 在著明顯的多態(tài)性，PCR的電泳結(jié)果可用于構(gòu)建品種間的指紋圖譜。4.聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯色，具體操作程序?yàn)棰倥渲?%聚丙烯酰胺凝 膠，吸取PCR產(chǎn)物7μ L和IyL的上樣緩沖液，充分混勻上樣。上樣完畢后140 V電壓電 泳。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距下邊1 cm 2 cm時(shí)，結(jié)束電泳。②電泳結(jié)束后，關(guān)閉電泳儀，拿出 玻璃板并用藥匙柄小心撬開(kāi)，移走上層玻璃板，將附有凝膠的玻璃板以凝膠面朝下浸入已 準(zhǔn)備好的放有雙蒸水的干凈的瓷盤(pán)中，凝膠即落下，或輕輕用藥匙柄把膠剝開(kāi)一角，即可落 入盤(pán)內(nèi)；③凝膠的固定倒掉瓷盤(pán)中的水，加入固定液(100 mL/L乙醇)，在搖床上緩緩搖 動(dòng)15 min;倒掉瓷盤(pán)中的固定液，用雙蒸水洗2次；④凝膠的染色倒掉瓷盤(pán)中的水，加入 染色液(20 g/L AgNO3),在搖床上緩緩搖動(dòng)染色20 min;⑤洗膠倒掉瓷盤(pán)中的染色液，用 雙蒸水洗2次，共計(jì)1 min;⑥凝膠的顯影加少量顯色液(30 g/L Na2CO3)沖洗15 s，再加 一定體積顯色液，輕搖瓷盤(pán)直到看到清晰的條帶，一般為5 min 6 min，時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)，否 則背景會(huì)過(guò)深；⑦終止顯影倒掉瓷盤(pán)中的顯影液，迅速倒入定影液(100 mL/L HAC),緩 緩搖動(dòng)2 min 3 min;⑧識(shí)讀序列倒掉瓷盤(pán)中的定影液，用雙蒸水洗2次，每次2 min, 將凝膠放在空氣中干燥，識(shí)讀序列。也可用數(shù)碼相機(jī)或凝膠成像儀攝像。5. SSR指紋圖譜結(jié)果分析及判定6對(duì)引物對(duì)應(yīng)的SSR位點(diǎn)在不同紫云英品種中 形成的指紋帶型見(jiàn)圖1-圖6。其中圖1能對(duì)紫云英參試品種在150bp-300bp范圍形成4種 指紋帶型；
圖2能對(duì)紫云英參試品種在80bp-150bp范圍形成5種指紋帶型；圖3能對(duì)紫云英參試 品種在75bp-100bp范圍形成5種指紋帶型；圖4能對(duì)紫云英參試品種在70bp-150bp范圍 形成4種指紋帶型；圖5能對(duì)紫云英參試品種在240bp-300bp范圍形成3種指紋帶型；圖6 能對(duì)紫云英參試品種在250bp-650bp范圍形成3種指紋帶型；
下面我們以6個(gè)SSR位點(diǎn)中的2個(gè)位點(diǎn)為例說(shuō)明如何根據(jù)其電泳的指紋圖譜帶型對(duì)參 試的9個(gè)品種進(jìn)行區(qū)別。實(shí)施例1一、參試紫云英品種1 閩紫1號(hào)；2 信陽(yáng)種；3 寧波大橋種；4 =8324411 ；5 閩紫6 號(hào)；6:8410441; 7 :8487711 ;8 弋江籽；9 余江大葉籽；其中閩紫1號(hào)、8324411、閩紫6 號(hào)、8410441、8487711由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，信陽(yáng)種由河南省信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提 供，余江大葉籽由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，弋江籽由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，寧波大橋種由 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。二、SSR標(biāo)記的鑒別結(jié)果
1、由不同的SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增形成的參試紫云英樣品的帶型圖譜圖7為引物 EG6-54 (圖7中右側(cè))及引物EG6-167 (圖7中左側(cè))對(duì)紫云英9個(gè)參試品種在75bp_300bp 范圍形成的指紋帶型(Μ為分子量標(biāo)準(zhǔn)，0為空白對(duì)照，1-9為參試樣品編號(hào))。2、紫云英品種帶型的指紋分析將圖7中擴(kuò)增明顯的主帶定義為不同帶型，如圖7 所示分別用大寫(xiě)英文字母Α，B, C, D, Ε, F，G表示，可通過(guò)表1將紫云英參試品種的帶型的指 紋圖譜加以總結(jié)。表1紫云英參試品種的帶型的指紋圖譜分析
“ + ”表示1-9號(hào)參試品種所具有的帶型。
由表1可見(jiàn)只要根據(jù)所用的2個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性就可將參試的9個(gè)樣品分為8個(gè) 類型，即除3號(hào)與9號(hào)之間不能區(qū)別外，其余樣品之間均不同。因而可從分子水平對(duì)紫云英 品種加以鑒別。
權(quán)利要求
一種紫云英基因組中特定的SSR位點(diǎn)，其特征在于，所述特定的SSR位點(diǎn)的序列由6條序列組成，其序列由短到長(zhǎng)排列為①ACACACACAACACACACAAACACA；②ACACACACACACACACAAACAAACACAAACAC；③CTCTCTCTGATCTCTCTCTCCCTCTCCC TCTCCCTCTCCCTCT； ④CTCTTCCTCTTCTTCTCTTTCATATGCTCCACT CTTCCTCTCTTCTTCTCT；⑤CCC ACACCACCACTCACCAACATCACCACTCACACACCAGCACCTTCCACTCCCTTCAACCACCCCCACCACTACTCAAACACCACCATCTCACCA；⑥ACACACACACACACACACACACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACGTGCGCGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGCGTGCGTGTGTGTGTGTGT。
2.一種利用權(quán)利要求1所述紫云英基因組中特定的SSR位點(diǎn)的兩側(cè)設(shè)計(jì)的 引物，其特征在于，所述引物序列由6對(duì)引物對(duì)組成，引物對(duì)序列如下①EG6-54 上游:CGCCCATAAATCTCTTCCA 下游CTCCCTTTGATCAATCTCGC ；② EG6-167 上 游:TTTCACTTCTAGAAATTTGTTGACA,下游ATGGATGGTCAACTCGGTAAC ；③ Bm2_8 上 游:GCTCGGCCTTTCACATGG,下游GAGAAATAGGTACCAGTTCTAGGG ；④ Lm2_44 上 游:GATTGACAAAGTCTGCCG,下游ATGCTCCCCTCTTCACACA ；⑤ EG6-170 上游 GGCCAACACTCACTACCCTCAT,下游CAACCAACGATCACTCCCACC ；⑥ YAGT37 上游 CGCCCATAAATCTCTTCCA,下游TGCGCACACACAACG。
3.—種如權(quán)利要求2所述的引物的篩選方法，其特征在于所述方法包括下列步驟紫 云英總DNA的提取；用親和磁珠富集紫云英基因組中的SSR位點(diǎn)，SSR位點(diǎn)兩側(cè)引物的設(shè) 計(jì)篩選；PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物電泳及染色，根據(jù)電泳結(jié)果篩選具有多態(tài)性的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物的篩選方法，其特征在于所述紫云英總DNA提取方法， 以紫云英品種幼苗或成熟植株的葉片或莖段中的一種或兩種為材料，提取基因組DNA，具體 的操作步驟為①稱取0. 1克植物組織，用去離子水沖洗干凈，迅速轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中； ②加入液氮，迅速用電鉆搗碎，加入600mlCTAB ；③65°C水浴lh，混勻；④加等體積的氯仿一 異戊醇，氯仿與異戊醇的體積比為24 :1，混勻；⑤12000rpm離心6min，取上清液；⑥向上清 液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇或2/3體積的異丙醇沉淀DNA，_20°C放置20min ；⑦12000rpm 離心6min，棄上清液；⑧加75%的乙醇清洗DNA，12000rpm離心2min，棄上清液；⑨風(fēng)干 后加入50ul的TE緩沖液溶解DNA，備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物的篩選方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng) 體系為25 yL的PCR反應(yīng)體系中包括提取的DNA溶液1 μ L，IOnmol L—1引物2 μ L, 2.5 mmol L-1ClNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA 聚合酶 1 U ;PCR 反應(yīng)程序 為94°C預(yù)變性7min;隨后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變性30 s, 55°C退火30 s, 72°C 延伸30s;最后72°C延伸10 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物的篩選方法，其特征在于所述PCR產(chǎn)物電泳及染色， 采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯色。
7.一種利用SSR指紋圖譜鑒別紫云英品種的方法，其特征在于所述方法包括(1)紫 云英總DNA的提??；(2)根據(jù)權(quán)利要求1所述的SSR位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物；(3)對(duì)引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；(4)PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳及染色，形成不同紫云英品種的SSR指紋圖譜，然后進(jìn)行紫云英的品種鑒別。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用SSR指紋圖譜鑒別紫云英品種的方法，其特征在于所 述紫云英總DNA提取方法，以紫云英品種幼苗或成熟植株的葉片或莖段中的一種或兩種 為材料，提取基因組DNA，具體的操作步驟為①稱取0. 1克植物組織，用去離子水沖洗干 凈，迅速轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中；②加入液氮，迅速用電鉆搗碎，加入600mlCTAB ；③65°C水浴 lh，混勻；④加等體積的氯仿一異戊醇，氯仿與異戊醇的體積比為24 :1，混勻；⑤12000rpm 離心6min，取上清液；⑥向上清液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇或2/3體積的異丙醇沉 淀DNA，-20°C放置20min ；⑦12000rpm離心6min，棄上清液；⑧加75%的乙醇清洗DNA， 12000rpm離心2min，棄上清液；⑨風(fēng)干后加入50ul的TE緩沖液溶解DNA，備用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用SSR指紋圖譜鑒別紫云英品種的方法，其特征在于所 述PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為25 μ L的PCR反應(yīng)體系中包括提取的DNA溶液1 μ L, IOnmol L-1 引物 2 μ L, 2.5 mmol L-1ClNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA 聚 合酶1 U。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性7min ；隨后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變性30 s, 55°C退火 30 s, 72°C延伸 30s;最后 72°C延伸 10 min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用SSR指紋圖譜鑒別紫云英品種的方法。本發(fā)明涉及的紫云英基因組中特定的SSR位點(diǎn)及其兩側(cè)引物序列如SEQ.NO.1-18，利用篩選的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的指紋圖譜可用于鑒別紫云英品種，鑒別方法主要包括提取紫云英總DNA,用親和磁珠富集法從基因組DNA中篩選出特定的SSR位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，通過(guò)對(duì)不同紫云英品種的PCR擴(kuò)增最終得到6個(gè)SSR位點(diǎn)的引物對(duì)可形成顯著條帶差異，用其構(gòu)建的指紋圖譜有效地用于鑒別紫云英品種。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101974516SQ20101051038
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者張輝, 朱炳耀, 林新堅(jiān), 陳堅(jiān), 陳濟(jì)琛 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所