專利名稱：一種培育轉(zhuǎn)基因四合木愈傷組織的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育轉(zhuǎn)基因四合木愈傷組織的方法及其專用培養(yǎng)基，屬于四合木 生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
四合木是蒺藜科四合木屬落葉小灌木，是我國特有的孓遺單種屬植物。它是強旱 生植物，分布于我國內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯高原北部、庫布齊沙漠以南、阿拉巴素山的山麓 地帶的石質(zhì)低山、沙礫質(zhì)高原和山前洪積扇等生態(tài)條件極為惡劣的干旱地區(qū)，能防風固沙、 保持水土，對維持荒漠生態(tài)系統(tǒng)的功能有重要作用。它是最具代表性的古老孓遺瀕危珍稀 植物，但由于結(jié)實率低、胚胎敗育率高等原因，其種子形成頻率僅1. 26-2. 8 %，自我更新較 慢，此外，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人類的生產(chǎn)活動使四合木分布區(qū)的生態(tài)環(huán)境日趨惡化、種群數(shù) 量和面積不斷萎縮，瀕危情況更加嚴重。早在1982年，《中國油脂植物》中就指出，四合木是含油量較高的植物。此外，考慮 到它屬于沙生植物，不會占用寶貴的耕地資源，且能改善當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境，適宜作為生物柴 油的原料來開發(fā)。但因為四合木分布地域極為有限、種群數(shù)量少等原因，目前對其的研究還 集中在生物學特性、生理指標分析、主要化學成分分析、生態(tài)學研究等方面，尚未深入到克 隆基因、遺傳轉(zhuǎn)化、品質(zhì)改良等研究。因此，建立四合木遺傳轉(zhuǎn)化體系，可以利用生物技術(shù)來 進行種質(zhì)資源保存、通過基因工程利用外源基因?qū)λ暮夏咎囟ㄆ焚|(zhì)進行改良。植物遺傳轉(zhuǎn)化能夠?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w植物，從而改變植物本來的性狀、產(chǎn)生新 的性狀，通過篩選即可得到符合需要的植物材料。可用于植物轉(zhuǎn)基因的方法有基因槍法、花 粉管通道法、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法。其中，基因槍法又稱微彈轟擊法，借助高壓將附著在金屬 微粒上的DNA導入受體細胞或組織，該方法操作簡單，可控度高，但需要專門的儀器，且容 易在植物基因組多個位點整合造成多拷貝，易引起轉(zhuǎn)基因后沉默。花粉管通道法是在植物 授粉時將含有目的基因DNA的溶液涂抹到柱頭上，目的基因通過授粉過程中形成的花粉管 通道進入受精卵細胞并整合到受體基因組中，該方法無需精良的實驗裝置，但考慮到四合 木開花植株少且結(jié)實率低，該方法不適于四合木遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌法是將外植體置于含外 源基因的農(nóng)桿菌菌液中浸泡，然后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基，使Ti質(zhì)粒插入植物細胞，將DNA整合 到植物基因組中并在植物體表達。綜合分析認為農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法成本較低、操 作簡單，且能完整地將T-DNA以單拷貝或低拷貝的形式插入受體基因組，最適用于四合木 的遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化通常選用植物分生能力較強的器官、組織或細胞作為受體 系統(tǒng)，如子葉節(jié)、胚尖、下胚軸、原生質(zhì)體等。但這些外植體制備比較繁瑣、轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的嵌 合體較多、后期篩選工作量較大。愈傷組織細胞在合適的培養(yǎng)條件下生長速度快、結(jié)構(gòu)疏松，且在光照、溫度、培養(yǎng) 基、激素配比等合適時，能分化出組織和器官，或形成胚狀體，進而發(fā)育成完整植株，因此選 用愈傷組織作為受體，在其中表達外源基因，能在相對較短時間內(nèi)對該基因的功能和表達模式等諸多信息進行分析，操作簡單、周期短、成本低，可行性較高，可用于功能基因組學研 究。2010年徐冉等建立了黃瓜疏松愈傷組織瞬時表達系統(tǒng)；陳惠等2008年建立了水稻的 成熟胚愈傷組織高效基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。目前，四合木的轉(zhuǎn)基因體系尚未有人研究。建立一個操作簡單、成本低廉的轉(zhuǎn)基因 愈傷組織轉(zhuǎn)化體系，既可以作為瞬時轉(zhuǎn)化和表達系統(tǒng)，用于研究四合木基因功能，也可以進 一步再生出植株，篩選出轉(zhuǎn)基因品系，實現(xiàn)四合木的遺傳改良。此外，四合木的愈傷組織中 可以積累油脂，表明其中具有油脂合成和積累的代謝通路，因此，愈傷組織轉(zhuǎn)化體系可以用 于研究油脂代謝中重要基因功能。目前，石油等不可再生能源日漸短缺，世界各國都在加緊 研發(fā)生物質(zhì)能源。四合木是潛在的能源生物，開展它的轉(zhuǎn)基因研究非常必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2-(N_嗎 啡啉)乙磺酸(MES)、2，4-D和6-BA得到的培養(yǎng)基，所述MES、2，4-D和6-BA在所述四合木 愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的終濃度分別為0. 4-lg/L、0. l-lmg/L、0. 1-0. 3mg/L。上述MES、2，4-D和6-BA在所述四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的終濃度分別為 0. 6g/L、0. 5mg/L、0. 2mg/L ；所述MS培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)如表1所示。表1. MS培養(yǎng)基(pH 5. 8)的溶質(zhì)
權(quán)利要求
四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基，是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加MES、2，4 D和6 BA得到的培養(yǎng)基，所述MES、2，4 D和6 BA在所述四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的終濃度分別為0.4 1g/L、0.1 1mg/L、0.1 0.3mg/L。
2.如權(quán)利要求1所述的四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基，其特征在于所述MES、2，4-D和 6-BA在所述四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的終濃度分別為0. 6g/L、0. 5mg/L、0. 2mg/L ；所 述MS培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)如表1所示。
3.一種培育轉(zhuǎn)基因四合木愈傷組織的方法，包括如下步驟1)將四合木莖接入權(quán)利要求1或2所述的四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到愈 傷組織；2)將含有目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟1)得到的愈傷組織，得到所述轉(zhuǎn)基因四合木愈 傷組織。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述四合木莖是取四合木的種 子接入1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的無菌苗的莖；所述1/2MS培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基中的大量 元素濃度減半，微量元素、鐵鹽、維生素、蔗糖和瓊脂的濃度均不變的培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟1)和步驟2)之 間的繼代培養(yǎng)；所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與權(quán)利要求1或2所述的四合木愈傷組織誘導培養(yǎng) 基相同。
6.如權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述含有目的基因的 農(nóng)桿菌的獲得包括如下步驟a)將含有目的基因的重組表達載體導入農(nóng)桿菌中得到陽性菌落；b)將步驟a)得到的陽性菌落接入菌培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)至對數(shù)增長期；c)在步驟b)基礎(chǔ)上取菌液離心、棄上清后，用重懸培養(yǎng)基將菌體重懸，得到待轉(zhuǎn)化的 所述含有目的基因的農(nóng)桿菌；其中，所述菌培養(yǎng)基是在YEP培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加利福平、卡那霉素和鏈霉素得到的 培養(yǎng)基；所述YEP培養(yǎng)基的溶劑是水、溶質(zhì)如表2所示；所述利福平、卡那霉素和鏈霉素在 所述菌培養(yǎng)基中的終濃度分別是如下I)或II)I)利福平45-55mg/L、卡那霉素 45_55mg/L、鏈霉素 45_55mg/L ；II)利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L、鏈霉素50mg/L。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述重懸培養(yǎng)基是在去掉瓊脂的1/2MS培 養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加MES，硫代硫酸鈉、二硫蘇糖醇、乙酰丁香酮、2，4-D、6-BA、水解酪蛋白和 硝酸銀得到的培養(yǎng)基；所述去掉瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基是將權(quán)利要求4所述的1/2MS培養(yǎng)基 中去掉瓊脂得到的培養(yǎng)基；所述MES、硫代硫酸鈉、二硫蘇糖醇、乙酰丁香酮、2，4-D、6-BA、 水解酪蛋白和硝酸銀在所述重懸培養(yǎng)基中的終濃度分別是如下I)或II)DMES 3. 0-4. 5g/L，硫代硫酸鈉0. 1-0. 3g/L、二硫蘇糖醇0. 1-0. 2g/L、乙酰丁香酮 15-25mg/L、2，4-D 0. 1-0. 5mg/L、6_BA 0.05-0. 15mg/L、水解酪蛋白 250_500mg/L 和硝酸銀 3_5mg/L ；IDMES 3. 9g/L，硫代硫酸鈉 0. 2g/L、二硫蘇糖醇 0. 154g/L、乙酰丁香酮 20mg/L、2，4_D 0. 25mg/L、6-BA 0. lmg/L、水解酪蛋白 300mg/L 和硝酸銀 4mg/L。
8.如權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述方法還包括在所述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟1)得到的愈傷組織后的共培養(yǎng)；所述共培養(yǎng)包括如下步驟在所述農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化步驟1)得到的愈傷組織后，將愈傷組織接入表面鋪了一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中 避光培養(yǎng)；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是將權(quán)利要求7所述重懸培養(yǎng)基中的水解酪蛋白去掉并且添 加瓊脂得到的培養(yǎng)基，所述瓊脂在所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的終濃度是6g/L。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述方法還包括所述避光培養(yǎng) 后的篩選；所述篩選包括如下步驟將所述避光培養(yǎng)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中培 養(yǎng)；所述篩選培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加卡那霉素、羧芐青霉素、2，4-D和6-BA得 到的培養(yǎng)基，所述MS培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)如表1所示；所述卡那霉素、羧芐青霉素、2， 4-D和6-BA在所述篩選培養(yǎng)基中的終濃度分別是如下I)或II)I)卡那霉素5-15mg/L、羧芐青霉素 200-300mg/L、2，4-D 0.1-0. 5mg/L、 6-BAO. 05-0. 15mg/L ；II)卡那霉素10mg/L、羧芐青霉素 250mg/L、2，4-D 0. 25mg/L，6-BAO. lmg/L。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法還包括在愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng) 基之前的沖洗，所述沖洗是將所述避光培養(yǎng)得到的愈傷組織用含0. 5g/L羧芐青霉素鈉的 蒸餾水和不含瓊脂的共培養(yǎng)培養(yǎng)基輪流沖洗30min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育轉(zhuǎn)基因四合木愈傷組織的方法及其專用培養(yǎng)基。該方法，包括如下步驟1)將四合木莖接入上述的四合木愈傷組織誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到愈傷組織；2)將含有目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟1)得到的愈傷組織，得到所述轉(zhuǎn)基因四合木愈傷組織。本發(fā)明選用采自內(nèi)蒙古烏海的四合木種子為最初實驗材料，無菌培養(yǎng)得無菌苗后，切下幼嫩莖段誘導出愈傷組織，以愈傷組織為外植體，利用農(nóng)桿菌介導的方法，將外源基因整合到四合木的基因組中，通過優(yōu)化愈傷組織轉(zhuǎn)化和篩選的過程，建立了一個操作簡便、高效快捷的一個四合木愈傷組織轉(zhuǎn)化體系。
文檔編號C12N15/82GK101974479SQ20101051146
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者吳韓英, 平文麗, 李敏春, 許亦農(nóng) 申請人:中國科學院植物研究所