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流行性造血器官壞死病毒的pcr檢測試劑盒及檢測方法

文檔序號:586437閱讀:565來源:國知局
專利名稱:流行性造血器官壞死病毒的pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領域
本發(fā)明涉及病毒的檢測方法,特別涉及流行性造血器官壞死病毒(Epizootic hematopoieticnecrosis virus, EHNV)的 PCR 檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)
近年來,由病毒引起的水產(chǎn)動物病害給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失。隨 著經(jīng)濟的全球化,世界各地水產(chǎn)貿(mào)易日益增加,病毒的傳播也逐漸蔓延開來,病毒造成的 病害已經(jīng)成為影響世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的嚴重問題(l.Murm CB. Viruses as pathogens of marineorganisms—from bacteria to whales. J Mar Biol Assoc UK,2006,86 (3) 453-467)。其中虹彩病毒的危害比較嚴重,危害分布范圍較為廣泛,并且魚類一旦同時感染 虹彩病毒和寄生蟲,致死率可達90%以上(2.蕭楓,張奇亞.水生動物虹彩病毒的分子生物 學.水生生物學報,2004,28 (2) :202-206)。^^ftiitifil^'B'if^E^I^ (Epizootic hematopoietic necrosis virus, EHNV) 是虹彩病毒科蛙病毒屬的成員,能引起河鱸(Perca fluviatilis)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等多種魚類的幼魚和成魚出現(xiàn)內(nèi)臟壞死以至死亡(3. World organisation for animal health(0IE). Manual ofDiagnostic Tests for Aquatic Animals 2009. 0IE, Paris, France. 2009,168-187 ;4. Langdon JS, Humphrey JD. Epizootic Hematopoietic Necrosis a New Viral Disease in Redfin Perch Percafluviatilis L. in Australia. J. Fish Dis.,1987,10(4) 289-298 ;5.Langdon JS.Experimentaltransmission and pathogenicity of epizootic haematopoietic necrosis virus(EHNV)in redfin perch, Perca fluviatilis L. , and 11 other teleosts. J. Fish Dis.,1989,12 (4) :295_310 ; 6. Reddacliff LA, ffhittington RJ. Pathology of epizootic haematopoietic necrosis virus(EHNV)infection in rainbowtrout(Oncorhynchus mykiss ffalbaum)and redfin perch (Perca fluviatilis L). J Comp Pathol, 1996,115(2) : 103-115)。對于 EHNV 尚無特 效藥,病毒的早期檢測和診斷仍是最重要的防治手段。目前,常用的診斷方法有電鏡觀察、ELISA和PCR后酶切等(7. Hyatt AD, Eaton BT, Hengstberger S. Epizootic hematopoietic necrosis virus :detection by ELISA, immunohistochemistry and electron microscopy. J Fish Dis,1991,14, 605-617 ;8.Marsh IB, ffhittington RJ, 0' Rourke B, Hyattc AD and Chisholm 0. Rapid differentiation of Australian, European and American ranaviruses based on variation in major capsid protein gene sequence. MolCell Probes,2002,16(2) 137-151.),但電鏡觀察和PCR后酶切均較為繁瑣,ELISA難以區(qū)分EHNV和蛙病毒屬的其他 成員,因此急需一種特異性高,簡便快捷的針對EHNV的檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性高,簡便快捷的流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種流行性造血器官壞死病毒的檢測方法。本發(fā)明所述流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒設有盒體、裂解液、吸附 液、洗滌液、PCR反應液、陽性對照和陰性對照。所述裂解液的配方為5mol/L鹽酸胍,0. lmol/L EDTA,去離子水定容至1L,pH為 8. 0。所述吸附液的組成為玻璃粉、濃硝酸與水,所述玻璃粉、濃硝酸與水的配比為 lg (5 6)mL: (10 12)mL,其中玻璃粉以質(zhì)量計算,濃硝酸和水以體積計算,所述濃 硝酸的質(zhì)量分數(shù)可為55% 70%。所述洗滌液的組成為0.lmol/L氯化鈉,lmmol/L EDTA, 10mmol/L Tris-HCl,去離 子水定容至1L,pH為7. 5,再加入等體積的無水乙醇。所述PCR反應液的配方為每23iiL中包含10XPCR緩沖液2. 5iiL,正向引物P1 0. 5ii L,反向引物P2 0. 5u L, dNTP2 u L, Taq酶0. 25 y L,雙蒸水17. 75 y L ;所述正向引物 PI和反向引物P2的序列為正向引物P1 5,-CAGCTGGGAGACAACGGCACA-3,;反向引物P2 5,-ACGAATTCGAGCTCGGTACC-3,。所述PCR緩沖液可采用常規(guī)PCR緩沖液。所述陽性對照可為含有pMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒的溶液;所述陰性對照可為無菌 水。本發(fā)明所述流行性造血器官壞死病毒的檢測方法包括以下步驟1)選取待測樣品,加入裂解液進行裂解;第1次離心,收集上清,加吸附液,混勻, 靜置后,第2次離心,收集沉淀物,用洗滌液洗滌沉淀物后,再第3次離心,再收集沉淀物,加 水充分懸浮沉淀物,即得PCR模板;2)將步驟1)所得PCR模板加入PCR反應液中進行PCR反應,設立陽性對照和陰 性對照,PCR 反應的程序為95°C 3min ;94°C 30s,61°C 30s,72°C 30s,35 個循環(huán);72°C 5min ;3) PCR反應結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,在紫外燈下觀察,陽性 對照應有一條195bp條帶,陰性對照在195bp條帶平行位置應無條帶;若樣品在該平行位置 有195bp條帶,則表明該樣品含有病毒,若無195bp條帶,則無病毒。在步驟1)中,所述第1次離心可為12000rpm,第1次離心時間可為3min ;所述靜 置的時間可為5min,靜置期間可搖勻1 3次;所述第2次離心可為lOOOOrpm,第2次離心 的時間可為15s ;所述第3次離心可為lOOOOrpm,第3次離心的時間可為30s。本發(fā)明以虹彩病毒EHNV中的主衣殼蛋白基因(MCP)保守區(qū)序列作為擴增靶序列, 設計合成了一對特異性引物,通過改進PCR模板的制備方法和優(yōu)化擴增條件,建立了 EHNV 病毒PCR快速檢測技術(shù),并開發(fā)成簡便、快速、實用的檢測試劑盒,經(jīng)試驗,該試劑盒的檢測 靈敏度相當于31個病毒粒子,模板制備時間約30min,半個工作日即可得到準確的結(jié)果,無 非特異性擴增帶,適用于EHNV病毒感染的苗種和水產(chǎn)品的檢疫及水質(zhì)環(huán)境的監(jiān)測。


圖1為特異性試驗PCR電泳圖。在圖1中,1為DNA Marker DL 2000 ;2為 PMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒加入腎組織后提取的模板;3和8為pMD18-T-EHNV_MCP質(zhì)粒;4為 LYCIV病毒質(zhì)粒;5為正常腎組織;6為正常脾組織;7和10為空白對照;9為蛙虹彩病毒基 因組模板。該PCR檢測方法設計的引物能特異性檢測EHNV,并且能與同屬的蛙虹彩病毒區(qū) 分開,特異性較好。圖2為PCR檢測大黃魚虹彩病毒EHNV質(zhì)粒的靈敏性試驗。1為DNA Marker DL 2000 ;2 10 分別為 10ng, lng, 1 X lO^ng, 1 X 10"2ng, 1 X 10"3ng, 1 X 10-"4ng, 1 X 10"5ng, 1 X 10_6ng、1 X 10_7ng陽性質(zhì)粒為模板的擴增結(jié)果;該PCR檢測方法的靈敏度較高,最小檢測 限度達到了 lX10_7ng陽性質(zhì)粒,相當于31個病毒粒子。圖3為模板提取的效果性實驗檢測。1為DNA Marker DL 2000 ;2為 PMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒;3為pMD18-T-EHNV_MCP質(zhì)粒加入腎組織后重新提??;4為 PMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒加入脾組織后重新提取;5為正常腎組織;6為正常脾組織;7為無 模板空白對照。從含有PMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒的魚組織中提取DNA檢測時,能有效地檢測 到pMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒,模板提取效率比較高,同理可知,該PCR檢測方法能檢測到感染 了 EHNV的魚。
具體實施例方式實施例1 pMD-18T-EHNV-MCP 質(zhì)粒構(gòu)建1)從病魚組織中提取病毒模板取約15mg(l/2米粒大小)魚組織或組織懸浮液 300 u L,滴入10滴裂解液(約300 u L)并用牙簽掏碎;12000r/min離心3min,將上清液轉(zhuǎn) 至新管,加入20 ii L吸附液并混勻;室溫放置5min后,10000r/min離心15s,棄上清,滴入10 滴洗滌液于沉淀中,并使沉淀充分懸?。籰OOOOr/min離心30s,去上清;加20 u L的無菌水, 充分懸浮沉淀;lOOOOr/min離心30s,吸取上清液2 y L用于PCR實驗。2)引物設計和質(zhì)粒構(gòu)建(1)結(jié)合生物信息學手段,對蛙病毒屬病毒的基因組序列進行分析,確定了以 EHNV主衣殼蛋白基因(MCP)保守區(qū)序列作為擴增靶序列,并設計了 EHNV特異性的一對引 物,其序列為正向引物P1 5,-CAGCTGGGAGACAACGGCACA-3,;反向引物P2 5,-ACGAATTCGAGCTCGGTACC-3,。該引物的特異性在于其序列和同屬的蛙虹彩病毒主衣殼蛋白基因保守區(qū)序列只 在正向引物P1最末端一個堿基的差異,并由此將與其同源性很高的蛙虹彩病毒區(qū)分開。(2)PCR擴增,使用如下體系進行PCR
10XPCR緩沖液2. 5u L ;
正向引物P10. 5u L ;
反向引物P20. 5u L ;
dNTP2u L ;
組織DNA模板1. 5u L ;
Taq酶0. 25u L ;
雙蒸水17.75iiL。PCR 反應的程序為95°C 3min ;94°C 30s,61°C 30s,72°C 30s,35 個循環(huán);72°C 5min。(3)擴增后的PCR產(chǎn)物,經(jīng)膠回收后連接至PMD18-T載體中,構(gòu)建了 PMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒,并經(jīng)測序進行序列的驗證。實施例2敏感性及特異性檢測1)特異性檢測分別用含pMD 18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒的大黃魚腎組織提取的模板,pMD 18-T-EHNV-MCP 質(zhì)粒,含大黃魚虹彩病毒(LYCIV)主衣殼蛋白序列的質(zhì)粒,正常大黃魚腎組織模板,正常大 黃魚脾組織模板,蛙虹彩病毒模板按上述反應體系進行PCR擴增,取7. 5 y L反應液在1. 5% 瓊脂糖凝膠上進行電泳觀察。實驗結(jié)果(參見圖1)說明該PCR檢測方法設計的引物能特 異性檢測EHNV,并且能與同屬的蛙虹彩病毒區(qū)分開,特異性比較好。2)敏感性試驗將pMD 18-T-EHNV-MCP 質(zhì)粒分別稀釋成 10ng、lng、1 X lO^ig、1 X l(T2ng,、 1 X l(T3ng、1 X l(T4ng、1 X l(T5ng,、1 X l(T6ng、1 X l(T7ng、l(T8ng 進行 PCR 擴增,取 7. 5 ii L 反應
液在1. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳觀察。實驗結(jié)果(參見圖2)表明該PCR檢測方法的靈敏 度較高,最小檢測限度達到了 lX10_7ng陽性質(zhì)粒,相當于31個病毒粒子。實施例3模板提取的效果試驗分別用pMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒與大黃魚正常的腎或脾組織混合后重新提取出 EHNV病毒質(zhì)粒,正常腎組織模板,正常脾組織模板,按上述反應體系進行PCR擴增,通過PCR 擴增的條帶進行對比。實驗結(jié)果表明表明從含有PMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒的魚組織中提取 DNA檢測時,能很有效的檢測到pMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒,模板提取效率比較高,同理可知, 該PCR檢測方法能檢測到感染了 EHNV的魚。實施例4所述流行性造血器官壞死病毒的檢測方法通過上述一系列試驗最后確定一種快速簡單的檢測方法,從制備模板到檢測出結(jié) 果只需半個工作日。1)檢測試劑配制裂解液5mol/L鹽酸胍,0. lmol/LEDTA,去離子水定容至1L,pH為8. 0。吸附液將玻璃粉、濃硝酸與水按照lg (5 6)mL (10 12)mL的比例配置 吸附液,其中玻璃粉以質(zhì)量計算,濃硝酸和水以體積計算,所述濃硝酸的質(zhì)量分數(shù)為55% 70%。洗滌液0.lmol/L 氯化鈉,lmmol/L EDTA,10mmol/L Tris-HCl,去離子水定容至 1L,pH為pH7. 5,再加入等體積的無水乙醇,搖勻。50 X TAE電泳緩沖液。PCR 反應液每 23ii L 包含 10XPCR buffer 2. 5 ii L,正向引物 P10. 5 ii L,反向引 物 P20. 5u L, dNTP 2 u L, Taq 酶 0. 25 ii L,雙蒸水 17. 75 u L。陽性對照含有pMD 18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒溶液。陰性對照無菌水。滅菌牙簽,滅菌后烘干。
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2)主要儀器及耗材PCR擴增儀,臺式高速離心機,微型混合儀,加樣槍,電泳儀,電泳槽,紫外檢測燈, 0. 5ml離心管,200 u L加樣槍頭,不銹鋼鑷子,一次性手套,瓊脂糖粉。3)檢測步驟1.待測樣品的選取約15ml (約1/2米粒大小)魚或其他魚池生物組織。魚苗可 整只用于檢測,成魚可用鑷子取其脾、腎或腮等組織。2.將取得的魚組織至于1. 5ml小管內(nèi),滴入10滴裂解液,用牙簽搗碎(約1 2min)。3. 12000r/min離心3min,將上清轉(zhuǎn)移至新管內(nèi),加20iiL吸附液(內(nèi)含白色物質(zhì), 用前充分搖勻!),混勻。室溫放置5min,期間搖勻3次。4. 10000r/min離心15s,棄上清,再離心3s,用加樣槍吸干殘余液體,滴入10滴洗 滌液于沉淀中,用加樣槍輕輕攪動是沉淀充分懸浮起來。5. 10000r/min離心30s,棄上清,再離心3s,用加樣槍吸干殘余液體,將沉淀至于 PCR儀上60°C烘3min (打開離心管蓋)。6.加20 ii L蒸餾水,充分懸浮沉淀,10000r/min離心30s,吸取上清2 y L于反應管 中(內(nèi)含23 ii L PCR反應液),用混合器混勻,5000r/min離心3s,即可做PCR反應。陽性 對照和陰性對照不需處理,直接取2 u L于反應管中做PCR即可。PCR程序為95°C 3min ; 94°C 30s,61°C 30s,72°C 30s,35 個循環(huán);72°C 5min。7. PCR反應完畢,取10 iiL反應液在1. 5 %瓊脂糖凝膠上電泳檢測,時間20 30min。紫外燈下觀察,陽性對照應有一條195bp的清晰條帶;陰性對照在此平行位置應無 條帶;若樣品在該平行位置有條帶,則表明該樣品含有病毒,若無條帶,則無病毒。
權(quán)利要求
流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒,其特征在于設有盒體、裂解液、吸附液、洗滌液、PCR反應液、陽性對照和陰性對照。
2.如權(quán)利要求1所述流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒,其特征在于所述裂 解液的配方為5mol/L鹽酸胍,0. lmol/LEDTA,去離子水定容至1L,pH為8. 0。
3.如權(quán)利要求1所述流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒,其特征在于所 述吸附液的組成為玻璃粉、濃硝酸與水,所述玻璃粉、濃硝酸與水的配比為lg (5 6) mL (10 12)mL,其中玻璃粉以質(zhì)量計算,濃硝酸和水以體積計算,所述濃硝酸的質(zhì)量分 數(shù)可為55% 70%。
4.如權(quán)利要求1所述流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒,其特征在于所述洗 滌液的組成為0. lmol/L氯化鈉,lmmol/L EDTA, 10mmol/L Tris_HCl,去離子水定容至1L, PH為7. 5,再加入等體積的無水乙醇。
5.如權(quán)利要求1所述流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒,其特征在于所述 PCR反應液的配方為每23iiL中包含10XPCR緩沖液2. 5iiL,正向引物P1 0. 5yL,反向 引物P20. 5iiL,dNTP 2uL, Taq酶0. 25 y L,雙蒸水17. 75 y L ;所述正向引物PI和反向引 物P2的序列為正向引物 P1 :5,-CAGCTGGGAGACAACGGCACA-3’ ;反向引物 P2 :5’ -ACGAATTCGAGCTCGGTACC-3,。
6.如權(quán)利要求1所述流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒,其特征在于所述陽 性對照為含有PMD18-T-EHNV-MCP質(zhì)粒的溶液;所述陰性對照為無菌水。
7.流行性造血器官壞死病毒的檢測方法,其特征在于包括以下步驟1)選取待測樣品,加入裂解液進行裂解;第1次離心,收集上清,加吸附液,混勻,靜置 后,第2次離心,收集沉淀物,用洗滌液洗滌沉淀物后,再第3次離心,再收集沉淀物,加水充 分懸浮沉淀物,即得PCR模板;2)將步驟1)所得PCR模板加入PCR反應液中進行PCR反應,設立陽性對照和陰性對 照,PCR 反應的程序為95°C 3min ;94°C 30s,61°C 30s,72°C 30s,35 個循環(huán);72°C 5min ;3)PCR反應結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,在紫外燈下觀察,陽性對照 應有一條195bp條帶,陰性對照在195bp條帶平行位置應無條帶;若樣品在該平行位置有 195bp條帶,則表明該樣品含有病毒,若無195bp條帶,則無病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的流行性造血器官壞死病毒的檢測方法,其特征在于在步驟1) 中,所述第1次離心為12000rpm,第1次離心時間為3min ;所述靜置的時間為5min,靜置期 間搖勻1 3次。
9.如權(quán)利要求7所述的流行性造血器官壞死病毒的檢測方法,其特征在于在步驟1) 中,所述第2次離心為lOOOOrpm,第2次離心的時間為15s。
10.如權(quán)利要求7所述的流行性造血器官壞死病毒的檢測方法,其特征在于在步驟1) 中,所述第3次離心為lOOOOrpm,第3次離心的時間為30s。全文摘要
流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒及檢測方法。涉及病毒的檢測方法,提供一種特異性高,簡便快捷的針對流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒及檢測方法。流行性造血器官壞死病毒的PCR檢測試劑盒包括裂解液,吸附液,洗滌液,PCR反應液,陽性對照,陰性對照。檢測方法包括PCR模板制備,PCR反應,PCR產(chǎn)物檢測。該試劑盒的檢測靈敏度相當于31個病毒粒子,模板制備時間約30min,半個工作日即可得到準確的結(jié)果,無非特異性擴增帶,適用于EHNV病毒感染的苗種和水產(chǎn)品的檢疫及水質(zhì)環(huán)境的監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/70GK101948937SQ20101051149
公開日2011年1月19日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者敖敬群, 胡國海, 陳新華, 黃輝三 申請人:國家海洋局第三海洋研究所
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