專利名稱：羅伊氏乳桿菌及其復(fù)合活菌制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于微生態(tài)制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種羅伊氏乳桿菌及其復(fù) 合活菌制劑。
背景技術(shù)：
復(fù)合活菌制劑做為微生態(tài)制劑的一種，已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)養(yǎng)殖。其主要由兩 種或兩種以上的不同益生菌菌屬組成。目前，通常應(yīng)用的菌種主要是乳酸桿菌、雙歧桿菌、 糞鏈球菌、芽孢桿菌及酵母菌等。將具有不同生物功能的益生菌組合，研制的復(fù)合活菌制劑 通過生物拮抗作用、生物奪氧用及及增強(qiáng)免疫等作用以維持胃腸道內(nèi)環(huán)境平衡，且益生菌 可在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)生長代謝，產(chǎn)生的各種消化酶能明顯加強(qiáng)機(jī)體對(duì)飼料中各種營養(yǎng)成分的消 化吸收，提高飼料的利用。目前，應(yīng)用于豬的復(fù)合活菌制劑生產(chǎn)菌株中，大部分為非豬源益生菌，由于動(dòng)物腸 道菌群的生成是長期進(jìn)化的結(jié)果，一種適于某類動(dòng)物的微生態(tài)制劑不一定適于另一類動(dòng) 物，從而導(dǎo)致應(yīng)用效果受到較大影響。羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)是健康仔豬胃腸道的常在菌，國外研究 報(bào)道表明，羅伊氏乳桿菌對(duì)胃酸及膽汁具有較強(qiáng)的耐受能力，能夠保持活力直達(dá)胃腸道，并 且還能分泌特殊的抗菌物質(zhì)Reuterin，有效抑制輪狀病毒及其他腸道病原微生物的生長， 從而來預(yù)防和治療腹瀉。該菌已被國內(nèi)外學(xué)者廣泛地應(yīng)用于飼用微生態(tài)制劑，具有很好的 市場(chǎng)前景。雙歧桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)最主要的生理性細(xì)菌之一，與其它生理性細(xì)菌成員構(gòu) 成了微生物群落，并與宿主構(gòu)成一個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)。雙歧桿菌進(jìn)入腸道后迅速在腸粘膜定植， 并與腸粘膜上皮細(xì)胞結(jié)合形成微生物膜，阻止致病菌的定植與入侵；同時(shí)，產(chǎn)生大量的乳酸 與乙酸，改善腸內(nèi)環(huán)境，維持正常的腸蠕動(dòng)，促使致病菌排出體外；直接抑制或拮抗痢疾桿 菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌、致病性大腸桿菌、葡萄球菌等致病菌的生長。雙歧桿菌可清除致 病菌所釋放的有毒有害代謝產(chǎn)物，減少內(nèi)毒素來源，抑制致病菌群生長，降低血中內(nèi)毒素水 平，調(diào)整微生態(tài)平衡，防治內(nèi)毒素血癥。雙歧桿菌也能合成多種維生素(如維生素Bi、B2、 B6、B12、煙酸、葉酸等)和生物酶；使腸道酸化，有利于鐵、鈣及維生素D的吸收，防止缺鐵性 貧血及維生素D缺乏癥的發(fā)生；能補(bǔ)充多種氨基酸和微量元素。能激活機(jī)體吞噬細(xì)胞的吞 噬能力，增強(qiáng)機(jī)體的抗病免疫功能。由于雙歧桿菌具有維持微生態(tài)平衡、生物拮抗、免疫調(diào) 節(jié)、營養(yǎng)等多方面的益生性能，目前已被廣泛應(yīng)用于微生物飼料添加劑、醫(yī)療、保健、食品等 領(lǐng)域，在國內(nèi)外受到了研究者和消費(fèi)者的青睞。另外，經(jīng)國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬中的納豆芽孢桿菌，由于其可產(chǎn)生芽 孢，因而有耐酸、耐堿、耐高溫及耐擠壓等特點(diǎn)，在制粒過程及胃酸環(huán)境中均能保持高度的 穩(wěn)定性，是各種益生菌當(dāng)中，對(duì)環(huán)境耐受力較好且可以直達(dá)小腸的菌種之一。此外，納豆芽 孢桿菌還能夠生成多種蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性飼料中某些復(fù)雜的碳 水化合物，從而提高飼料的轉(zhuǎn)化率，調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)動(dòng)物的細(xì)胞免疫效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羅伊氏乳桿菌以及由其制備的復(fù)合活菌制劑。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供所述羅伊氏乳桿菌及其復(fù)合菌劑的應(yīng)用。本發(fā)明的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5分離自豬腸道，該菌株已 于2010年7月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101)，其簡稱為CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4050。本發(fā)明還提供含有羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5的菌劑。所述菌劑還包括雙歧桿菌和納豆芽孢桿菌。優(yōu)選地，所述菌劑按重量份計(jì)含有羅伊氏乳桿菌L-HD5 1-10份雙歧桿菌1-10份納豆芽孢桿菌1-10份。更優(yōu)選地，所述菌劑按重量份計(jì)含有羅伊氏乳桿菌L-HD5 1份雙歧桿菌1份納豆芽孢桿菌1份。本發(fā)明還提供含有羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5或上述菌劑的 飼料添加劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供制備上述菌劑的方法，包括下述步驟將羅伊氏乳桿菌L-HD5、 雙歧桿菌和納豆芽孢桿菌分別進(jìn)行下述操作進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，離心處理后收集菌 泥，再通過真空冷凍干燥技術(shù)制備并收集菌粉，最后將三種菌粉復(fù)配。其中，所述羅伊氏乳桿菌L-HD5和雙歧桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度37°C， pH6. 0 6. 5，靜止培養(yǎng)，裝液量60%，接種量3%，培養(yǎng)時(shí)間16 24h，活菌數(shù)大于IO8CFU/
mLo所述納豆芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度37°C，pH6. 0，攪拌轉(zhuǎn)速ISOrpm，裝液 量20 %，接種量3 %，培養(yǎng)時(shí)間24 36h，活菌數(shù)大于108CFU/mL，芽孢形成率達(dá)到50 %以上。本發(fā)明還提供羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5或上述菌劑在飼料 添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的復(fù)合活菌制劑作為飼料添加劑，經(jīng)飼養(yǎng)后可顯著提高斷奶仔豬頭均日增 重及飼料效率，降低仔豬腹瀉率，提高經(jīng)濟(jì)效益。具有推廣應(yīng)用前景，并且為尋求抗生素替 代品提供了 一定的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 羅伊氏乳桿菌活菌制劑的制備菌種活化將羅伊氏乳桿菌凍干菌種(Lactobacillus reuteri L-HD5)劃線接種于MRS固體 培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)為CM188)表面，37°C厭氧培養(yǎng)16 24h，直至固體培養(yǎng)基表面長出菌落，鏡檢觀察菌體形態(tài)及純度。種子液的制備挑取MRS固體培養(yǎng)基表面菌落，接種于裝有5mL種子培養(yǎng)基的試管中，37°C厭氧培 養(yǎng)16 24h，待活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL，按2% (約1 X 106CFU/mL)接種量接種于裝有150mL種 子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，37°C厭氧培養(yǎng)16 24h，待活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL，作為種子液種子培養(yǎng)基組成如下蛋白胨10g，牛肉膏15g，酵母粉5g，葡萄糖15g，檸檬酸二 銨 2g，乙酸鈉 5g，吐溫 801mL, K2HP042g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，蒸餾水加至 1000mL。液體深層發(fā)酵培養(yǎng)選用5L立式發(fā)酵罐進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。其中，羅伊氏乳桿菌種子液的接種量 為3%，裝液量為60%，37°C厭氧培養(yǎng)20h后，測(cè)定每毫升菌液中的活菌數(shù)，待活菌數(shù)達(dá) 109CFU/mL,放罐結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下大豆蛋白胨50g，葡萄糖10g，酵母粉17g，低聚糖3g，蒸餾水 加至 lOOOmL，pH 6. 0 6. 5。凍干菌粉制備通過發(fā)酵液的離心、濃縮、加入凍干保護(hù)劑、真空冷凍干燥及菌粉活菌數(shù)檢驗(yàn)等生 產(chǎn)程序，最終制備出粉狀活菌制劑。其中，凍干保護(hù)劑的組成如下蔗糖15g，甘油3g，山梨醇15g，脫脂奶粉15g，蒸餾 水加至250mL;菌泥(離心濃縮后的菌體)與凍干保護(hù)劑的添加比例為1 125(g/mL)，凍 干保護(hù)率達(dá)到70%以上。成品檢測(cè)取制備完的粉狀活菌制劑lg，按國標(biāo)GB/T 4789. 35-2003方法測(cè)定每克菌粉中的 活菌數(shù)，且菌粉中的活菌數(shù)大于109CFU/g。實(shí)施例2 雙歧桿菌活菌制劑的制備菌種活化將雙歧桿菌凍干菌種(嬰兒雙歧桿菌，購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心，編號(hào)CGMCC No. 1. 2202)劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基表面，37°C厭氧培養(yǎng)16 24h，直至固體培養(yǎng)基表面長出菌落，鏡檢觀察菌體形態(tài)及純度。種子液的制備挑取MRS固體培養(yǎng)基表面菌落，接種于裝有5mL種子培養(yǎng)基的試管中，37°C厭氧培 養(yǎng)16 24h，待活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL，按2% (約1 X 106CFU/mL)接種量接種于裝有150mL種 子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，37°C厭氧培養(yǎng)16h 24h，待活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL，作為種子液種子培養(yǎng)基組成如下蛋白胨10g，牛肉膏15g，酵母粉5g，葡萄糖15g，檸檬酸二 銨 2g，乙酸鈉 5g，吐溫 801mL, K2HP042g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，蒸餾水加至 1000mL。液體深層發(fā)酵培養(yǎng)將雙歧桿菌種子液按3%的接種量，裝液量60%，接種于5L發(fā)酵罐中，pH6. 5，37°C
5厭氧培養(yǎng)24h后，測(cè)定每毫升菌液中的活菌數(shù)，待活菌數(shù)達(dá)109CFU/mL，放罐結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下大豆蛋白胨50g，葡萄糖10g，酵母粉17g，低聚糖3g，蒸餾水 力口至 IOOOmL, ρΗ6· 5。凍干菌粉制備通過發(fā)酵液的離心、濃縮、加入凍干保護(hù)劑、真空冷凍干燥及菌粉活菌數(shù)檢驗(yàn)等生 產(chǎn)程序，最終制備出粉狀活菌制劑。成品檢測(cè)取制備完的粉狀活菌制劑lg，按國標(biāo)GB/T 4789. 35-2003方法測(cè)定每克菌粉中的 活菌數(shù)，測(cè)得菌粉中的活菌數(shù)大于109CFU/g。實(shí)施例3 納豆芽孢桿菌活菌制劑的制備菌種活化將納豆芽孢桿菌凍干菌種(購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，編號(hào)CGMCC No. 1. 1086)劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任 公司生產(chǎn)，批號(hào)為20060808)表面，37°C好氧培養(yǎng)12 24h，直至培養(yǎng)基表面長出菌落，鏡 檢觀察菌體形態(tài)及純度。種子液的制備挑取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面菌落，接種于裝有5mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 (北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)為CM106)的試管中，37°C培養(yǎng)12 24h，待活菌 數(shù)達(dá)108CFU/mL，按2% (約lX106CFU/mL)接種量接種于裝有150mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基 的250mL錐形瓶中，37°C培養(yǎng)12 24h，待活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL以上，作為種子液備用。液體深層發(fā)酵培養(yǎng)將納豆芽孢桿菌種子液按3%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中， PH6. 0，攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，裝液量20%，37°C好氧培養(yǎng)24 36h后，測(cè)定每毫升菌液中的活 菌數(shù)，待活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL以上，芽孢形成率達(dá)到80 %以上，放罐結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)(消泡劑 為植物油，添加量1%，單位:g/ml)。發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下蛋白胨10g，牛肉粉3.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖l.Og，蒸餾水 加至 1L, ρΗ6· 0。凍干菌粉制備通過發(fā)酵液的離心、濃縮、加入凍干保護(hù)劑、真空冷凍干燥及菌粉活菌數(shù)檢驗(yàn)等生 產(chǎn)程序，最終制備出粉狀活菌制劑。成品檢測(cè)取制備完的粉狀活菌制劑lg，按國標(biāo)NY-T 1461-2007方法測(cè)定每克菌粉中的活 菌數(shù)，測(cè)得菌粉中的活菌數(shù)大于109CFU/g。實(shí)施例4 復(fù)合活菌制劑的制備將三種已制備完成的粉狀活菌制劑按質(zhì)量比1 1 1的比例復(fù)配，可得到復(fù)合 活菌制劑45g，經(jīng)檢測(cè)復(fù)配后得到的活菌制劑成品活菌總數(shù)大于101(lCFU/g。效果本發(fā)明的復(fù)合菌劑采用冷凍干燥保護(hù)技術(shù)制備，大幅度保證產(chǎn)品高活菌數(shù) 的保存期，一年內(nèi)產(chǎn)品總活菌數(shù)不低于107CFU/g。實(shí)驗(yàn)例1 羅伊氏乳桿菌L-HD5凍干粉制劑的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇35日齡健康斷奶仔豬36頭，母系父系均為長白豬；將36頭仔豬隨機(jī)分為兩組，試驗(yàn)組一為羅伊氏乳桿菌L-HD5凍干粉制劑組，飼喂仔豬日糧(不含抗生素)+羅 伊氏乳桿菌L-HD5凍干粉制劑組(添加量為基礎(chǔ)日糧的)；試驗(yàn)組二為對(duì)照組，飼喂基 礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)時(shí)間為30d，仔豬的免疫按豬場(chǎng)常規(guī)免疫程序進(jìn)行。最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下試驗(yàn)組一每頭仔豬平均日增重為0. 415Kg，對(duì)照組為0. 360Kg,試驗(yàn)組較對(duì)照組提
高日增重7. 1%。試驗(yàn)組一每頭仔豬平均日耗料量為0. 668Kg，對(duì)照組為0. 700Kg，試驗(yàn)組較對(duì)照組 降低日耗料量2.3%。試驗(yàn)組一腹瀉率為12.5%，對(duì)照組為32.2%，試驗(yàn)組較對(duì)照組降低腹瀉率 19. 7%。動(dòng)物飼喂實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)斷奶仔豬飼喂豬源羅伊氏乳桿菌L-HD5凍干粉制劑可提高 斷奶仔豬日增重，降低日耗料量和腹瀉發(fā)病率。實(shí)驗(yàn)例2隨機(jī)選擇35日齡健康斷奶仔豬54頭，母系父系均為長白豬；將54頭仔豬隨機(jī)分 為三組，試驗(yàn)組一為羅伊氏乳桿菌L-HD5凍干粉制劑組，飼喂仔豬日糧(不含抗生素)+羅 伊氏乳桿菌L-HD5凍干粉制劑組(添加量為基礎(chǔ)日糧的)；試驗(yàn)組二為復(fù)合活菌制劑 組，飼喂仔豬日糧(不含抗生素)+實(shí)施例4所制得的復(fù)合活菌制劑(添加量為基礎(chǔ)日糧的 1% )；試驗(yàn)組三為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)時(shí)間為30d，仔豬的免疫按豬場(chǎng)常規(guī)免疫程 序進(jìn)行。最終試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下試驗(yàn)組一每頭仔豬平均日增重為0. 415Kg，試驗(yàn)組二每頭仔豬平均日增重為 0. 563Kg，對(duì)照組為0. 360Kg，試驗(yàn)組一較對(duì)照組提高日增重7. 1 %，試驗(yàn)組二較對(duì)照組提高 日增重22%。試驗(yàn)組一每頭仔豬平均日耗料量為0. 668Kg，試驗(yàn)組二每頭仔豬平均日耗料量為 0. 690Kg,對(duì)照組為0. 700Kg,試驗(yàn)組一較對(duì)照組降低日耗料量2. 3%，試驗(yàn)組二較對(duì)照組降 低日耗料量0.7%。試驗(yàn)組一腹瀉率為12.5%，試驗(yàn)組二腹瀉率為9.6%，對(duì)照組為32.2%，試驗(yàn)組較 對(duì)照組降低腹瀉率19. 7%，試驗(yàn)組二較對(duì)照組降低腹瀉率22. 6%。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)斷奶仔豬飼喂復(fù)合活菌制劑可顯著提高斷奶仔豬日增重，降低 日耗料量和腹瀉發(fā)病率。復(fù)合活菌制劑較單一羅伊氏乳桿菌制劑益生效用顯著。這可能是由于復(fù)合活菌制 劑中的三種益生菌具有協(xié)同增效作用。首先，納豆芽孢桿菌屬于好氧菌，進(jìn)入腸道后在生長繁殖過程中消耗環(huán)境內(nèi)的氧 氣，可以抑制好氧致病菌的生長，但有助于羅伊氏乳桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的繁殖；其 次，羅伊氏乳桿菌和雙歧桿菌的生長又增加了腸道內(nèi)的酸度，更加強(qiáng)了對(duì)致病菌生長的抑 制。所以復(fù)合活菌制劑較單一菌制劑表現(xiàn)出了更顯著的益生效用。
權(quán)利要求
羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)L HD5，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4050。
2.含有權(quán)利要求1所述菌株的菌劑。
3.如權(quán)利要求2所述的菌劑，其還包括雙歧桿菌、納豆芽孢桿菌和凍干保護(hù)劑，其中所 述凍干保護(hù)劑的組分為蔗糖10g-15g，甘油3g-5g，山梨醇10g-15g，脫脂奶粉10g_15g，蒸 餾水加至250mL ；每克由羅伊氏乳桿菌L-HD5、雙歧桿菌和納豆芽孢桿菌組成的菌泥中添加 125ml凍干保護(hù)劑。
4.如權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑按重量份計(jì)含有羅伊氏乳桿菌L-HD5 1-10份雙歧桿菌1-10份納豆芽孢桿菌1-10份。
5.如權(quán)利要求4所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑按重量份計(jì)含有羅伊氏乳桿菌L-HD5 1份雙歧桿菌1份納豆芽孢桿菌1份。
6.含有權(quán)利要求1所述菌株或權(quán)利要求2 5任一項(xiàng)所述菌劑的飼料添加劑。
7.制備權(quán)利要求4 6任一項(xiàng)所述菌劑的方法，包括下述步驟將羅伊氏乳桿菌 L-HD5、雙歧桿菌和納豆芽孢桿菌分別進(jìn)行下述操作進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，離心處理后 收集菌泥，再通過真空冷凍干燥技術(shù)制備并收集菌粉，最后將三種菌粉復(fù)配。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述羅伊氏乳桿菌L-HD5和雙歧桿菌的發(fā) 酵培養(yǎng)條件為溫度37°C，pH6. 0 6. 5，靜止培養(yǎng)，裝液量60 %，接種量3 %，培養(yǎng)時(shí)間16 24h，活菌數(shù)大于108CFU/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述納豆芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫 度37°C，pH6. 0，攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，裝液量20%，接種量3%，培養(yǎng)時(shí)間24 36h，活菌數(shù)大 于108CFU/mL，芽孢形成率達(dá)到50%以上。
10.權(quán)利要求1所述菌株或權(quán)利要求2 5任一項(xiàng)所述菌劑在飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5及其復(fù)合活菌制劑，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4050。本發(fā)明的活菌制劑作為飼料添加劑，經(jīng)飼養(yǎng)后可顯著提高斷奶仔豬頭均日增重及飼料效率，降低仔豬腹瀉率，提高經(jīng)濟(jì)效益。具有推廣應(yīng)用前景，并且為尋求抗生素替代品提供了一定的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/225GK101974463SQ20101051742
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者劉宇, 孫秀軍, 崔玉東, 張軍, 朱戰(zhàn)波, 楊煥民, 賈永全 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)