專利名稱：懸浮培養(yǎng)mdck細(xì)胞及利用其生產(chǎn)病毒疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的方法，進(jìn)一步涉及利用該細(xì)胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法。
背景技術(shù)：
體外細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，其中懸浮培養(yǎng)又可分為微載體懸浮培養(yǎng)及全懸浮培養(yǎng)。與貼壁培養(yǎng)相比，懸浮培養(yǎng)具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)可連續(xù)擴(kuò)大生產(chǎn)量；有利于細(xì)胞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體充分接觸，而且易于控制培養(yǎng)條件(溫度、pH、 氧分壓和CO2等)；(3)培養(yǎng)條件穩(wěn)定，趨于均一，便于進(jìn)行定量研究；(4)易于在連續(xù)密閉的系統(tǒng)中進(jìn)行，減少了操作步驟和污染的機(jī)會(huì)；(5)可以長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)，既可節(jié)省人力，又使細(xì)胞能持續(xù)維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；(6)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞仍保持原先對(duì)病毒的敏感性和生物學(xué)特性。而與微載體懸浮培養(yǎng)相比，全懸浮培養(yǎng)有以下優(yōu)勢(shì)無需昂貴的微載體，從而有效降低生產(chǎn)成本；可省去微載體培養(yǎng)中附加步驟如消化收獲細(xì)胞等，從而簡(jiǎn)化生產(chǎn)過程，縮短生產(chǎn)時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，并易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。MDCK 細(xì)胞(Mardin Darby canine kidney cells)指 Mardin Darby 犬腎細(xì)胞。 MDCK細(xì)胞系由S. H. Madin和N. B. Darby于1958年從成體考克斯班尼犬(cocker spaniel) 的腎臟組織分離培育而建立，最初的MDCK細(xì)胞系(NBL-2)保藏在ATCC(目錄編號(hào)ATCC CCL 34)。MDCK細(xì)胞系可以用于多種病毒的繁殖和純化，如流感病毒，RSV，副流感病毒1、2和 3，呼吸道合胞病毒，乳多空病毒，水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯薩奇病毒，呼腸弧病毒， 細(xì)小病毒，腺病毒，骨髓灰質(zhì)炎病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒，和皰疹病毒。尤其可用于流感病毒增殖。從MDCK用于生產(chǎn)獸用疫苗的歷史來看，它也可以生產(chǎn)安全有效的人疫苗，且具有很高的產(chǎn)毒能力。所以開展MDCK大規(guī)模生產(chǎn)和制備疫苗的研究具有重要意義。但是，由于MDCK細(xì)胞無法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，限制了其在疫苗生產(chǎn)中的使用。MDCK細(xì)胞不同于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、轉(zhuǎn)染腺病毒ElA基因的人腎上皮細(xì)胞系等可以很容易在馴化過程中失去粘附性能的貼壁細(xì)胞系，MDCK細(xì)胞的緊密連接蛋白的形成和彌合與血清無太大關(guān)系，黏附能力受鈣鎂離子的影響不大，而且MDCK細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在很嚴(yán)重的“失巢凋亡”現(xiàn)象(Anoikis，是一種細(xì)胞程序死亡形式，是由于細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和其他細(xì)胞脫離接觸而誘發(fā)的，即細(xì)胞一旦不黏附其它基質(zhì)就會(huì)發(fā)生凋亡)，故而用傳統(tǒng)的懸浮馴化手段_有血清和無血清培養(yǎng)反復(fù)適應(yīng)的方法很難得到穩(wěn)定的MDCK懸浮細(xì)胞?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)影響細(xì)胞粘附的一些基因。例如人類siat7e基因被認(rèn)為在控制細(xì)胞貼附程度中起著一定的作用，增加的siat7e基因的表達(dá)可減少細(xì)胞粘附 (Jaluria P，Betenbaugh M,Konstantopoulos K，F(xiàn)rank B，Shiloach J(2007)Application of microarrays to identify and characterize genes involved in attachment dependence in HeLa cells. MetabEng 9:241-251·)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中MDCK細(xì)胞培養(yǎng)方法中存在的問題，提供一種懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的方法。本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的方法包括如下步驟(1)利用包含能減弱細(xì)胞粘附性能基因序列表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞；(2)篩選并分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克??；(3)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中的基因表達(dá)；(4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的懸浮培養(yǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種大規(guī)模懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞以生產(chǎn)病毒疫苗的方法。


圖1表示實(shí)施例1中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞克隆的RT-PCR檢測(cè)圖。其中，GAPDH和 18s RNA為內(nèi)參基因，對(duì)照為未經(jīng)轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞。A、B、C、D和E分別為分離到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。RT-PCR結(jié)果顯示，A、B、C、D和E五個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中均有siat7e基因的表達(dá)。圖2表示實(shí)施例1中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞克隆的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)特性正常。
具體實(shí)施例方式通過對(duì)MDCK細(xì)胞基因組進(jìn)行基因改造，獲得適于懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)工藝，實(shí)現(xiàn)通過大規(guī)模懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞以生產(chǎn)病毒疫苗。本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的方法包括如下步驟(1)利用包含能減弱細(xì)胞粘附性能基因序列的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞；(2)篩選并分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆；(3)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中的基因表達(dá)；(4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的懸浮培養(yǎng)。在所述的步驟(1)中，所述的基因序列為siat7e基因；載體可以是本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的表達(dá)載體，例如質(zhì)粒。所述的表達(dá)載體既可以根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段自行制備， 還可以購(gòu)買獲得。將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方式有兩種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中重組DNA 導(dǎo)入感染性強(qiáng)的細(xì)胞系以獲得目的基因暫時(shí)但高水平的表達(dá)。轉(zhuǎn)染的DNA不必整合進(jìn)宿主染色體，當(dāng)有大量樣品需要在短時(shí)間內(nèi)分析時(shí)，尤其是在轉(zhuǎn)染后的1到4天內(nèi)收獲細(xì)胞，所得的溶解產(chǎn)物用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)時(shí)，可以采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中DNA的暫時(shí)表達(dá)即為瞬時(shí)表達(dá)。穩(wěn)定或持久的轉(zhuǎn)染用于建立克隆的細(xì)胞系，這種細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染的目的基因整合到染色體DNA中并指導(dǎo)適量目的蛋白的合成。一般來說(由細(xì)胞類型決定)，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率比瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效率低1到2個(gè)數(shù)量級(jí)。利用可選擇的遺傳標(biāo)記物有利于在非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的背景中分離出稀少的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中整合基因的表達(dá)即為穩(wěn)定表達(dá)。將基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有許多種，包括生化方法轉(zhuǎn)染，物理方法轉(zhuǎn)染以及病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等。具體而言包括DEAE (二乙氨乙基)-葡聚糖介導(dǎo)法，磷酸鈣介導(dǎo)法，脂質(zhì)體介導(dǎo)法，聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染法，生物粒子介導(dǎo)法，電穿孔轉(zhuǎn)染法，顯微注射法，病毒介導(dǎo)法等，優(yōu)選采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法。所述的步驟(1)進(jìn)一步包括如下步驟(a)用全長(zhǎng)人類siat7e基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，純化質(zhì)粒； 純化質(zhì)粒的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段，可以采取試劑盒或非試劑盒的方法；(b)轉(zhuǎn)接1 X 105-5X 105MDCK細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育細(xì)胞20_24h，約40-90% 匯合度；所述MDCK細(xì)胞可以是例如商品名為ATCC，Cat. No. CCL-34的市售商品；(c)取1-10 μ g的質(zhì)粒DNA稀釋于250 μ L轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(如Opti-MEM培養(yǎng)基)中， 混勻；2-50 μ L脂質(zhì)體稀釋于250 μ L轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕輕混勻，靜置5-15min ；(d)將上述制備的溶液混合，室溫靜置10-20min ；將步驟(b)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)板中各個(gè)孔換成無血清無抗生素的0.5-2mL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基；將上述步驟(c)中的混合物轉(zhuǎn)入步驟(b)所述的孵育細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，輕輕前后晃動(dòng)混勻；(e)37°C培養(yǎng)，l_24h后，將各個(gè)孔中的培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)；(f)24h后，將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)板中傳至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在所述步驟(2)中，由于攝取、整合和表達(dá)外源DNA是小概率事件，通常根據(jù)新表型篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。一般情況下，這種表型由共同轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性的基因提供。表達(dá)一個(gè)DNA分子上的基因標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)常也表達(dá)另一 DNA分子攜帶的基因標(biāo)記。因此，穩(wěn)定表達(dá)選擇性標(biāo)記(如抗生素抗性)的細(xì)胞很可能也表達(dá)載體DNA上的其他DNA序列。這種物理上不相連的基因被整合到同一轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的現(xiàn)象叫做共轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)有常用篩選標(biāo)記包括氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(對(duì)G418或新霉素有抗性)、潮霉素-B磷酸轉(zhuǎn)移酶(對(duì)潮霉素-B有抗性)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(對(duì)霉酚酸、氨喋呤有抗性)與嘌呤霉素-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(對(duì)嘌呤霉素有抗性)。本發(fā)明優(yōu)選采用G418加壓篩選。所述的步驟(2)進(jìn)一步包括如下步驟細(xì)胞轉(zhuǎn)染24_48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基更換為選擇性培養(yǎng)基，以后每 2-4天更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)14-21天，觀察是否形成克隆，分離、擴(kuò)增獨(dú)立細(xì)胞克隆。 所述篩選的標(biāo)記可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的篩選標(biāo)記，包括但不限于G418篩選標(biāo)記， 所述的選擇性培養(yǎng)基優(yōu)選為G418選擇性培養(yǎng)基。利用選擇性培養(yǎng)基促進(jìn)抗性細(xì)胞生長(zhǎng)，無抗性細(xì)胞即死亡。所述的步驟(3)進(jìn)一步包括如下步驟待形成克隆后，挑取克隆進(jìn)行鑒定，所述鑒定方法主要為對(duì)獲得的克隆在插入基因的RNA水平和蛋白水平表達(dá)的檢測(cè)，其中RNA水平的檢測(cè)方法主要有RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng))、熒光定量PCR(熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng))、N0rthern雜交等。蛋白水平的檢測(cè)方法主要有=Western雜交、ELLSA (酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、免疫熒光檢測(cè)、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)等。在所述步驟(4)中，將篩選獲得并經(jīng)過檢測(cè)證明人類siat7e基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(方瓶或搖瓶)馴化至懸浮培養(yǎng)。將馴化懸浮培養(yǎng)細(xì)胞取一部分凍存， 另一部分在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)形態(tài)正常、活力大于90% 時(shí)接種至搖瓶中。在搖瓶及生物反應(yīng)器中擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞，最后按適宜細(xì)胞接種密度接種至
6生產(chǎn)規(guī)模的生物反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器的溫度、培養(yǎng)液PH值、溶氧濃度等參數(shù)，使細(xì)胞生長(zhǎng)于最適宜環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。所述的步驟(4)的懸浮培養(yǎng)的條件為容器懸浮培養(yǎng)容器，優(yōu)選為搖瓶(shake bottle)、攪拌瓶(Spinner Bottle)、生物反應(yīng)器等；細(xì)胞接種密度1X 105-1 X 106，優(yōu)選 2X105-5X IO5 ；細(xì)胞培養(yǎng)溫度33-40°C，優(yōu)選36-38°C ；pH 值6. 0-7. 8，優(yōu)選 6. 8-7. 4 ；溶氧濃度20%-100%，優(yōu)選 20% -80 %。細(xì)胞培養(yǎng)方式可為批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)與灌注培養(yǎng)。所述生物反應(yīng)器包括但不限于攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、固定床和流化床生物反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器、一次性生物反應(yīng)器等。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，所選用的細(xì)胞培養(yǎng)基并不是關(guān)鍵的，原則上所有能夠用于MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所用的細(xì)胞培養(yǎng)基都可以使用，優(yōu)選為無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。很多培養(yǎng)基都已經(jīng)是商業(yè)化產(chǎn)品，可以通過商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明還涉及懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞以生產(chǎn)病毒疫苗的方法?？稍诒景l(fā)明的MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)的病毒包括所有對(duì)MDCK細(xì)胞敏感的病毒，其包括但不限于流感病毒，RSV，副流感病毒1、2和3，呼吸道合胞病毒，乳多空病毒，水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯薩奇病毒， 呼腸弧病毒，細(xì)小病毒，腺病毒，骨髓灰質(zhì)炎病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒皰疹病毒。優(yōu)選為流感病毒。所述流感病毒包括人、馬、豬或者禽類株。大規(guī)模懸浮培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞，待MDCK細(xì)胞密度增殖至1 X IO6細(xì)胞/mL 以上時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為維持培養(yǎng)液，用病毒懸液接種MDCK細(xì)胞。其條件如下用病毒感染增殖的MDCK細(xì)胞(細(xì)胞密度為至少約1 X IO6)病毒感染復(fù)數(shù)(m.ο. i) 0. 0001-10，優(yōu)選 0. 001-5，更優(yōu)選 0. 002-2 ；病毒培養(yǎng)溫度30-37 °C，優(yōu)選30-35 °C ；pH 6. 5-8. 0，優(yōu)選 7. 2-7. 6 ；溶氧20%-100%，優(yōu)選20%-80%。可采用批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)與灌注培養(yǎng)方式培養(yǎng)細(xì)胞繁殖病毒，并可適時(shí)一次性或連續(xù)收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液。優(yōu)選流加培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)。即在病毒感染MDCK細(xì)胞一段時(shí)間后， 比如6-18hr后，可以采用流加或灌注的連續(xù)培養(yǎng)方式往生物反應(yīng)器中添加病毒維持液，不斷收獲上清病毒液。收獲的病毒液置于_15°C以下保存?？梢圆捎酶鞣N方法進(jìn)一步制備疫苗，例如收獲病毒液放置于2-8°C中，并保存在-20°C，凍融1次，過濾、滅活、乳化后制備疫
田ο由于血清對(duì)流感病毒在細(xì)胞上的增殖具有抑制作用，為了提高病毒滴度，應(yīng)嚴(yán)格控制維持培養(yǎng)液中血清的含量，優(yōu)選使用無血清維持培養(yǎng)液。同時(shí)，由于在流感病毒復(fù)制過程中需要胰蛋白酶，以使不具有感染性的非裂解型血凝素變?yōu)榫吒腥拘匝兀蕛?yōu)選在維持培養(yǎng)液中加入適量胰蛋白酶。在本文中，術(shù)語“病毒感染復(fù)數(shù)MOI (multiplicity of infection) ”是指每一個(gè)細(xì)胞上所感染病毒的數(shù)量。MOI =有感染力的病毒量/細(xì)胞總量。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，所選用的病毒株為生產(chǎn)或研制所述疫苗的常用病毒株，可由疫苗生產(chǎn)廠家或研究機(jī)構(gòu)獲得。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞并利用該細(xì)胞生產(chǎn)對(duì)MDCK細(xì)胞敏感的病毒疫苗如流感疫苗等，與現(xiàn)有雞胚培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)工藝相比具有如下有益效果(1)易于進(jìn)行質(zhì)量控制和保證，降低疫苗安全隱患；(2)易于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程自動(dòng)化，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)量高；(3)減少了疫苗生產(chǎn)后期純化度，提高疫苗安全性；(4)生產(chǎn)工藝改進(jìn)可滿足病毒疫苗需求，例如流感大流行和突發(fā)性流感爆發(fā)時(shí)對(duì)流感疫苗的需求。(5)實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞的全懸浮培養(yǎng)，無需購(gòu)置微載體，極大降低了疫苗生產(chǎn)成本；(6)在生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)工藝中，微載體放大工藝具有較大技術(shù)難度，且增加了生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性。而實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，則細(xì)胞的放大培養(yǎng)工藝較為簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)且極大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。實(shí)施例以下通過實(shí)施例和對(duì)比例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體的說明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1利用基因改造懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞1)利用含有siat7e基因的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞；(1)用全長(zhǎng)人類 siat7e 基因表達(dá)載體(Cat. No. EX-V1581-M03，Genecopoeia)轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞。利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒DNA。(2)第一天轉(zhuǎn)接 4X IO5MDCK 細(xì)胞(ATCC，Cat. No. CCL-34)于 6 孔板中，孵育 24h 細(xì)胞約80%匯合度。(3)第二天，取4. 0μ g的質(zhì)粒DNA稀釋于250μ L Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻；10 μ L 脂質(zhì)體稀釋于250 μ L Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，靜置5min。(4)將上述制備的溶液混合，室溫靜置20min ；將步驟(2)中所述的6孔板中各個(gè)孔換成無血清無抗生素的2mL Opti-MEM培養(yǎng)基；將上述步驟(3)中的混合物500 μ L轉(zhuǎn)入 6孔板孔中，輕輕前后晃動(dòng)混勻。(5)37°C培養(yǎng)5h后將各個(gè)孔中的培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基DMEM(含10%小牛血清)，37°C于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(6) 24h后，將其從6孔板中傳至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。2)G418加壓篩選以獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基更換為G418選擇性培養(yǎng)基，以后每3天換一次液，持續(xù)培養(yǎng)14天，每天觀察，看是否形成克隆。當(dāng)有抗性克隆出現(xiàn)后，按照單細(xì)胞分離培養(yǎng)方法(鄂征，組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)，北京出版社.100 107，2001年1月)單細(xì)胞分離培養(yǎng)得到5株單克隆細(xì)胞株，分別擴(kuò)大培養(yǎng)。3)驗(yàn)證基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；利用RNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取獲得單克隆細(xì)胞及對(duì)照MDCK細(xì)胞的總 RNA。根據(jù)siat7e基因序列設(shè)計(jì)引物如下正向弓I物5，-ttactcgccacaagatgctg-3，
反向弓I物5，-gcaccatgccataaacattg-3，利用superscrpt反轉(zhuǎn)錄-聚合酶式反應(yīng)試劑盒(invitrogen公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶式反應(yīng)檢驗(yàn)所獲單克隆細(xì)胞中siat7e基因的表達(dá)。證明所獲單克隆細(xì)胞中 siat7e基因均有表達(dá)(如圖1所示)。將篩選獲得并經(jīng)過檢測(cè)證明人類siat7e基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(方瓶或搖瓶)馴化懸浮培養(yǎng)。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞可穩(wěn)定懸浮培養(yǎng)后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；以2X IO5細(xì)胞/mL將細(xì)胞接種于搖瓶中置于37°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每天取出細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞密度為縱軸(對(duì)數(shù))，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(如圖2 所示)。實(shí)施例2-4除了按照表1改變實(shí)驗(yàn)條件以外，進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作。表 權(quán)利要求
1.一種懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的方法，其包括如下步驟(1)利用包含能減弱細(xì)胞粘附性能基因序列的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞；(2)篩選并分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克??；(3)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中的基因表達(dá)；(4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的懸浮培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(1)中利用含有siat7e基因的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述轉(zhuǎn)染的方法包括二乙氨乙基-葡聚糖介導(dǎo)法，磷酸鈣介導(dǎo)法，脂質(zhì)體介導(dǎo)法，聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染法，生物粒子介導(dǎo)法，電穿孔轉(zhuǎn)染法，顯微注射法，病毒介導(dǎo)法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述轉(zhuǎn)染的方法為脂質(zhì)體介導(dǎo)法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的步驟(2)包括如下步驟細(xì)胞轉(zhuǎn)染24-48h 后，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)基更換為選擇性培養(yǎng)基，以后每2-4天更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)14-21天，觀察是否形成細(xì)胞克隆，分離、擴(kuò)增獨(dú)立細(xì)胞克隆。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的步驟(3)包括如下步驟利用RNA水平檢測(cè)方法或蛋白水平檢測(cè)方法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中的基因表達(dá)，其中，所述的RNA水平檢測(cè)方法包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)、Northern雜交； 所述的蛋白水平檢測(cè)方法包括Western雜交、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光檢測(cè)、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的步驟(4)的懸浮培養(yǎng)的條件為 容器懸浮培養(yǎng)容器；細(xì)胞接種密度1 X 105-1 X 106; 細(xì)胞培養(yǎng)溫度33-40°C ； pH 值6. 0-7. 8 ； 溶氧20% -100%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述的懸浮培養(yǎng)容器為搖瓶、攪拌瓶、生物反應(yīng)器；所述細(xì)胞接種密度為2X 105-5X 105;所述細(xì)胞培養(yǎng)溫度為36-38 °C ；所述pH為 6. 8-7. 8 ；所述溶氧為 20% -80% ο
9.一種采用權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法得到的MDCK細(xì)胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述的病毒選自流感病毒，RSV，副流感病毒1、 2和3，呼吸道合胞病毒，乳多空病毒，水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯薩奇病毒，呼腸弧病毒，細(xì)小病毒，腺病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒和皰疹病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述的病毒為流感病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，生產(chǎn)病毒疫苗的條件為 用病毒感染MDCK細(xì)胞；病毒感染復(fù)數(shù)0. 0001-10 ； 病毒培養(yǎng)溫度30-37 °C ； pH 值6. 5-8. 0 ；溶氧20% -100%。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)密度至少為IX IO6;所述病毒感染復(fù)數(shù)為0. 001-5 ；所述病毒培養(yǎng)溫度為30-35°C ；所述pH為7. 2-7. 6 ；所述溶氧為 20% -80%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的方法，其包括如下步驟(1)利用包含能減弱細(xì)胞粘附性能基因序列的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞；(2)篩選并分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆；(3)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中的基因表達(dá)；(4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的懸浮培養(yǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及利用所述懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102453700SQ20101051756
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月18日
發(fā)明者張韌, 王建超, 陳文慶, 高飛 申請(qǐng)人:北京清大天一科技有限公司