專利名稱：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取方法，更具體地涉及一種酶消化法來(lái)制備臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)最早是從骨髓分離出的成體干細(xì) 胞。MSC具有較強(qiáng)的粘附性，低密度培養(yǎng)時(shí)能夠迅速貼壁，且具有快速增殖的能力。MSC體外 培養(yǎng)能保持核型的穩(wěn)定及端粒酶的活性。目前主要是根據(jù)其形態(tài)、抗原表型及分化潛能來(lái) 鑒定MSC。傳代后骨髓MSC的形態(tài)呈單一類成纖維細(xì)胞的長(zhǎng)梭形。迄今尚未發(fā)現(xiàn)MSC的特異 性表面標(biāo)志，MSC均勻穩(wěn)定的抗原標(biāo)記包括:SH2 (+)、SH3 (+)、CD29 (+)、CD44 (+)、CD71 (+)、 CD90 (+)、CD106(+)、CD120a(+)、CD124(+)，不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志 CD34、CD45、CD14、 CDl 17和與移植免疫排斥發(fā)生密切相關(guān)的表面標(biāo)志HLA-DR、B7-1 (CD80)、B7_2 (CD86)、CD40 等。MSC在體外不同的微環(huán)境誘導(dǎo)下可向不同的組織分化，用地塞米松，β-磷酸甘油和抗 壞血酸等聯(lián)合誘導(dǎo)，MSC可以分化為成骨細(xì)胞；在3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，吲哚美辛作用 下，MSC可分化為成脂細(xì)胞；用β-巰基乙醇，全反式視黃酸為誘導(dǎo)劑，MSC可分化為神經(jīng)細(xì) 胞等。1991年，McElreavey等首次報(bào)道，從人臍帶的Wharton，s jelly組織中分離并培 養(yǎng)到了一種成纖維樣細(xì)胞，具有較強(qiáng)的分化潛能，可向多個(gè)方向進(jìn)行分化。隨后，數(shù)位研究 者也分別報(bào)道臍帶中含有豐富的MSC。臍帶MSC具有骨髓MSC相類似的特點(diǎn)形態(tài)似長(zhǎng)梭 形，表達(dá)以上骨髓MSC的一組抗原標(biāo)記以及多向分化潛能。但其還具有自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)臍 帶MSCs不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(MHC) II類抗原，表達(dá)MHC-I類抗原，但不表達(dá)或低 表達(dá)移植免疫排斥相關(guān)的共刺激因子⑶80、⑶86、⑶40和⑶40 L等，因此是一類免疫缺陷 細(xì)胞，可用來(lái)與造血干細(xì)胞共移植，預(yù)防和治療急性移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)。臍帶是分娩 后的廢物，取材方便，易于收集、保存、冷凍，不受倫理道德及法律方面的限制，且細(xì)胞較為 原始，分化能力強(qiáng)，生物性能穩(wěn)定，可以為實(shí)驗(yàn)和臨床提供充足的細(xì)胞來(lái)源，因此在細(xì)胞治 療方面具有廣闊的臨床前景。目前國(guó)內(nèi)外各家實(shí)驗(yàn)室存在多種分離臍帶MSCs的方法，歸納起來(lái)主要是利用流 式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分選法，以及酶消化法進(jìn)行分離純化臍帶MSCs。流式細(xì)胞儀分 選與免疫磁珠分選間充質(zhì)干細(xì)胞的方法成本高，操作繁瑣，大量細(xì)胞的分離純化受到限制， 且目前仍未找到MSCs特有的特異性抗原標(biāo)記，因此大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用酶消化法。然而，不 同實(shí)驗(yàn)室的酶消化方法也各不相同，首先是消化的臍帶組織不同，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室消化的是 從臍帶中刮出的Wharton膠狀物或是將臍帶組織整個(gè)剪碎為l_2mm3大小的組織塊進(jìn)行消 化，操作較為復(fù)雜，且容易污染；另外，所用的酶的種類不同，如Sachiko使用膠原酶與透明 質(zhì)酸酶消化，而Wangs則單獨(dú)使用膠原酶消化，這些均能得到臍帶MSCs，但是細(xì)胞得率各不 相同，且細(xì)胞能傳代的次數(shù)各不相同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在建立一種簡(jiǎn)單有效且得率高的臍帶MSCs分離方法，為新生兒儲(chǔ)存臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及今后大規(guī)模臨床應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)單高效的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，包括(1)臍帶剔除血管的處理；(2)酶消化步驟，(3)收集消化后的細(xì)胞；(4)對(duì)收集獲得的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；其特點(diǎn)是所用的酶為2U/ml中性蛋白酶+2mg/ml膠原酶I+2U/ml透明質(zhì)酸酶。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選的消化時(shí)間為16小時(shí)。消化后，將未消化的組織用鑷子夾出，收集消化的細(xì)胞懸液，加入生理鹽水后離 心，2000r, 20min,小心棄除上清液，用生理鹽水洗滌，離心，棄上清。細(xì)胞冰醋酸稀釋后計(jì) 數(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS+10ng/mlbFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每隔2 3d更換培養(yǎng)基，約過(guò)7-10天，細(xì)胞即可80%匯合后，以胰酶/ EDTA消化即可得到原代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，證實(shí)1用本發(fā)明的方法制備得到的細(xì)胞為臍帶MSC。原代培養(yǎng)時(shí)大多數(shù)細(xì)胞呈成纖維樣的長(zhǎng)梭形，折光性強(qiáng)，胞核為圓形或橢圓形， 位于胞體的中央，胞質(zhì)較豐富，少部分細(xì)胞呈上皮樣結(jié)構(gòu)，為扁平的多角形，緊密相連(圖 1A)。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%匯合時(shí)，用胰酶消化并按1 3的比例傳代，傳至第二代時(shí)，細(xì)胞形態(tài) 為均一的成纖維樣的長(zhǎng)梭形(

圖1B)。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)我們分析了傳代培養(yǎng)后類成纖維 樣細(xì)胞的表面標(biāo)志，類成纖維樣細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29，CD90和多能干細(xì)胞標(biāo) 志0CT-4，SSEA4 ；不表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志⑶34，⑶45，⑶31，KDR (圖2)。應(yīng)用細(xì)胞免疫 化學(xué)方法，細(xì)胞質(zhì)中可檢測(cè)到高表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白Vimentin，SMA, Desmin (圖3)。上述 結(jié)果表明傳代培養(yǎng)后類成纖維樣細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志，不表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo) 志。類成纖維樣細(xì)胞在含有地塞米松、維生素C、磷酸甘油鈉的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中培 養(yǎng)，細(xì)胞胞體逐漸變大，由單一的類成纖維樣細(xì)胞的梭形變成三角形或多邊形。局部細(xì)胞可 呈多層生長(zhǎng)，細(xì)胞聚集區(qū)可見細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，形成大小不一的顆粒狀沉淀。成骨誘導(dǎo) 30d后，堿性磷酸酶染色呈紅色(圖4A)，Von Kossa染色有黑色的礦物沉淀(圖4B)。傳代 培養(yǎng)后類成纖維樣細(xì)胞在含有吲哚美辛、3_異丁基-1-甲基黃嘌呤和胰島素的成脂誘導(dǎo)分 化體系中培養(yǎng)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)呈空泡樣的脂滴逐漸增多并相互融合，細(xì)胞由長(zhǎng) 梭形變?yōu)閳A形或多邊形，誘導(dǎo)14天后油紅0染色呈紅色(圖5)，表明有大量脂質(zhì)沉積。根 據(jù)以上的細(xì)胞成纖維樣形態(tài)、表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志及向成骨成脂分化潛能證實(shí)了我們 所得的細(xì)胞為臍帶MSC.2.同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，還證實(shí)新的方法比其余方法簡(jiǎn)單高效。實(shí)驗(yàn)中我們比較了不同的酶混合液消化5cm去除血管后的臍帶組織的結(jié)果。結(jié)果 顯示，單獨(dú)使用胰酶消化或先用中性蛋白酶再用胰酶消化，細(xì)胞得率均非常低，分離得到的 單個(gè)核細(xì)胞很難貼壁，即使將臍帶組織剪碎后再消化，得到的結(jié)果也類似。因此我們主要比 較了應(yīng)用中性蛋白酶與膠原酶I兩種酶混合液和中性蛋白酶、膠原酶I與透明質(zhì)酸酶三種酶混合液進(jìn)行消化后的結(jié)果。如表1所示，應(yīng)用兩種酶的混合液消化單位長(zhǎng)度去血管臍帶 組織，消化后的細(xì)胞得率及培養(yǎng)一定時(shí)間后細(xì)胞得率與用三種酶的混合液消化結(jié)果類似， 但是前者消化后得到的細(xì)胞懸液非常粘稠，需要大量的生理鹽水反復(fù)稀釋洗滌后，細(xì)胞才 能接種，而后者消化后按常規(guī)方法洗滌細(xì)胞即可，可能由于臍帶組織富含透明質(zhì)酸，消化液 中加入了透明質(zhì)酸酶后，將透明質(zhì)酸消化，從而去除了消化后細(xì)胞懸液的粘稠性，使后續(xù)的 處理更容易。文獻(xiàn)報(bào)道臍帶Wharton膠和間質(zhì)組織均含有間充質(zhì)干細(xì)胞，本研究中我們應(yīng)用不 同的方法分別分離了 Wharton膠狀物和包含Wharton膠的去除血管后臍帶組織的間質(zhì)干 細(xì)胞。我們使用三種酶混合消化Wharton膠狀物和去除血管后臍帶組織，細(xì)胞得率如表2 所示，含Wharton膠的臍帶組織消化后，細(xì)胞得率、培養(yǎng)10天后得到的細(xì)胞數(shù)均明顯高于 Wharton膠組織。因此，我們認(rèn)為應(yīng)用三種酶混合液消化去除血管后的臍帶間質(zhì)組織不需要刮膠， 也不需將臍帶組織剪碎，操作簡(jiǎn)便，減少了污染的機(jī)會(huì)，細(xì)胞得率更高，不失為臍帶間質(zhì)干 細(xì)胞分離較好的方法。表1 不同酶混合液消化5cm去血管臍帶組織結(jié)果
權(quán)利要求
臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，包括(1)臍帶剔除血管的處理；(2)酶消化步驟，(3)收集消化后的細(xì)胞；(4)對(duì)收集獲得的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；其特點(diǎn)是所用的酶為2U/ml中性蛋白酶+2mg/ml膠原酶I+2U/ml透明質(zhì)酸酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法，其特征在于消化時(shí)間為16小
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，本發(fā)明的步驟包括(1)取人臍帶用酒精消毒，生理鹽水洗滌后剔除血管；(2)加入膠原酶、透明質(zhì)酸酶、蛋白中性酶消化；(3)收集細(xì)胞懸液，離心，棄去上清液，培養(yǎng)，即可獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明為新生兒儲(chǔ)存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及今后大規(guī)模臨床應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞提供了一種較為簡(jiǎn)單、高效的分離方法。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101948804SQ20101051771
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者盧光琇, 程臘梅, 肖娜 申請(qǐng)人:湖南光琇高新生命科技有限公司