專利名稱：一種顯微受精胚胎體外發(fā)育用培養(yǎng)液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)液，尤其涉及一種顯微受精胚胎體外發(fā)育用培養(yǎng)液。
背景技術(shù)：
顯微受精被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)的生殖研究和人的輔助生殖技術(shù)中來治療不孕癥。 從歷史上講，在哺乳動物，顯微受精最早開始于金黃地鼠；自此之后，顯微受精對于哺乳動物受精機(jī)制的研究提供了無價(jià)的信息。由于動物基因工程和生殖技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在，顯微受精技術(shù)已經(jīng)被廣泛的使用，來鑒別特定基因在生物學(xué)上的意義或證實(shí)在體外通過實(shí)驗(yàn)操作后的配子其基因的正常形態(tài)。在顯微操作中，培養(yǎng)液是影響體外胚胎的發(fā)育的重要因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種顯微受精胚胎體外發(fā)育用培養(yǎng)液，其主要包含 TCM199、FBS、丙酮酸鈉、EDTA、青霉素、鏈霉素。所述培養(yǎng)液的各成分的比例為18mlTCM199 2mlFBS 0. 00275g丙酮酸鈉0. 00075gEDTA 0. 0015g 青霉素0. OOlg 鏈霉素。所述培養(yǎng)液的pH為7. 3。本發(fā)明還提供所述的培養(yǎng)液的制備方法，其主要包含步驟TCM199中加入 FBS、丙酮酸鈉、EDTA、青霉素、鏈霉素，混勻。具體地，所述培養(yǎng)液的各成分的比例為 18mlTCM199 2mlFBS 0. 00275g 丙酮酸鈉:0. 00075gEDTA 0. 0015g 青霉素0. OOlg 鏈霉素。所述培養(yǎng)液的PH為7. 3。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液，其制備方法簡單，生產(chǎn)成本低，適合于胚胎的體外發(fā)育培養(yǎng)。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 作詳細(xì)說明如下。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1精子的準(zhǔn)備取兔(6 8月齡新西蘭兔，SPF級，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，許可證號SCXK<滬>2004-000幻精液用D-PBS液(商購)2000r/min離心洗滌三次然后緩慢的加入D-PBS液，放在38. 5°C,5% C02、100%濕度下的培養(yǎng)箱中緩慢上游10分鐘。實(shí)施例2卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備供體母兔為6-8月齡、體重3kg左右的初產(chǎn)新西蘭兔，按KennelIy和Foote (1965) 的方法，即連續(xù)3天每天2次(間隔12h)每次皮下注射FSH50IU/只(寧波第二激素廠生產(chǎn))，最后一次注射FSH后12h，耳緣靜脈注射HCG (寧波第二激素廠生產(chǎn))100IU/只并與結(jié)扎公兔交配，HCG注射后14、16、1 ι進(jìn)行取卵，在無菌條件下剪下輸卵管，吸取IOml的沖卵液，由喇叭口向?qū)m管結(jié)合部方向沖卵，每側(cè)用5mL沖卵液，將卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體放在裝有含0. 2%透明質(zhì)酸酶的D-PBS液的Eppendorf管中，在渦旋混合器上震蕩消化5min去除顆粒細(xì)胞，在體視顯微鏡下 撿出經(jīng)酶消化的卵母細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌三次，然后放入38. 5°C、 5% C02、100%濕度下平衡12h以上的培養(yǎng)液微滴中，直到顯微注射。實(shí)施例3將精子灃射到卵母細(xì)胞中注射前，用撿卵針把5-10枚卵母細(xì)胞移入操作液滴中，然后用注射針抓取一個精子放入聚乙烯吡咯酮(PVP)液滴中，用針尖在精子尾部迅速劃過進(jìn)行制動，看到尾部打折即可，隨后從尾部吸入注射針內(nèi)。注射時第一極體在12點(diǎn)鐘位置，從3點(diǎn)鐘的位置進(jìn)針，設(shè)置強(qiáng)度和頻率參數(shù)為2X2或3X2，激發(fā)1至2個脈沖擊穿透明帶，繼續(xù)進(jìn)針同時將精子小心的推至針尖處，直至針尖插入卵母細(xì)胞深處，幾乎貼近對側(cè)質(zhì)膜時，調(diào)換參數(shù)到1X1的檔，用Piezo弱脈沖擊穿卵母細(xì)胞質(zhì)膜，將精子吐出，回吸注入卵內(nèi)多余的液體，輕輕退針， 完成一次注射。依次操作，每次注射從開始制動到注射完畢在aiiin內(nèi)完成，所有顯微操作在室溫下完成。將注射后的卵母細(xì)胞用本領(lǐng)域常規(guī)的機(jī)械刺激方法激活。受精卵和孤雌活化卵的判定標(biāo)準(zhǔn)注射后6- 檢查原核和第二極體形成情況，只有當(dāng)出現(xiàn)2原核2極體QPN、2PB)時判定為受精；當(dāng)出現(xiàn)1原核1極體(IPNUPB)、1原核 2極體(1ΡΝ、2ΡΒ)、2原核1極體(2ΡΝ、1ΡΒ)時判定為活化。實(shí)施例4警精卵的培養(yǎng)將注射后存活的卵母細(xì)胞隨機(jī)分成兩組分別用mTCM199溶液(TCM199+10 % FBS+1. 25mM 丙酮酸鈉(Na-Pyruvate)+0. ImM EDTA)和 KS0M+0. 3% BSA 進(jìn)行培養(yǎng)，每組重復(fù) 3次，統(tǒng)計(jì)其發(fā)育率。結(jié)果見表1。從表1中可以看出培養(yǎng)液A和B中2-細(xì)胞率(84. 5%和79. 0%)差異不顯著((P > 0.05)，但是桑椹胚率(69.0%和58.0%)和囊胚率(57.1%和38.7%)差異顯著(P < 0. 05)。可見培養(yǎng)液A比較適合于兔ICSI胚胎的體外發(fā)育培養(yǎng)。采用SSPS 13. 0中的卡方(χ2)檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，以P < 0. 05為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。表 權(quán)利要求
1.一種顯微受精胚胎體外發(fā)育用培養(yǎng)液，其特征在于，包含TCM199、FBS、丙酮酸鈉、 EDTA、青霉素、鏈霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液的各成分的比例為 18mlTCM199 2mlFBS 0. 00275g 丙酮酸鈉:0. 00075gEDTA 0. 0015g 青霉素0. OOlg鏈霄素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液的pH為7.3。
4.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，包含步驟TCM199中加入FBS、 丙酮酸鈉、EDTA、青霉素、鏈霉素，混勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液的各成分的比例為 18mlTCM199 2mlFBS 0. 00275g 丙酮酸鈉:0. 00075gEDTA 0. 0015g 青霉素0. OOlg 鏈霄素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液的pH為7.3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種顯微受精胚胎體外發(fā)育用培養(yǎng)液，其包含TCM199、FBS、丙酮酸鈉、EDTA、青霉素、鏈霉素。所述培養(yǎng)液的各成分的比例為18mlTCM199∶2mlFBS∶0.00275g丙酮酸鈉∶0.00075gEDTA∶0.0015g青霉素∶0.001g鏈霉素。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液，其制備方法簡單，生產(chǎn)成本低，適合于胚胎的體外發(fā)育培養(yǎng)。
文檔編號C12N5/073GK102453696SQ20101051853
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者陳浩杰 申請人:陳浩杰