專利名稱：一種修復(fù)石油污染鹽堿土壤的微生物復(fù)合菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種適用于石油污染鹽堿土壤修復(fù)的微生物復(fù)合菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國大慶油田、大港油田、勝利油田等多個油田的土壤因其特定的地質(zhì)條件和不合理的人類活動均有不同程度的鹽堿化。在石油開采和油井施工作業(yè)過程中，易造成石油烴泄漏，污染土壤。鹽堿土壤本身土壤理化性質(zhì)差，石油污染進一步惡化了鹽堿土壤理化性質(zhì)，對土壤微生物造成顯著脅迫，干擾土壤物質(zhì)循環(huán)。此外，石油中含有的多環(huán)芳烴等污染物具有“三致”效應(yīng)，具有較高的生態(tài)風(fēng)險，對人類健康具有潛在威脅。因此，石油污染鹽堿土壤的修復(fù)是一項緊迫任務(wù)。然而目前的土壤修復(fù)方法大多集中在石油或者鹽堿單一脅迫方面，針對石油和鹽堿復(fù)合脅迫下的土壤修復(fù)制劑罕見報道。目前，石油污染土壤的修復(fù)方法主要有萃取法、淋洗法、堆肥法、植物修復(fù)法、微生物修復(fù)法等。微生物由于具有繁殖能力強、適應(yīng)性強、降解譜廣等優(yōu)點，常用于清除有機污染物；從土壤環(huán)境中篩選出來的土著石油降解菌也常用于石油污染土壤的修復(fù)。例如 中國專利O00410038053. 9)公開了一株可以降解石油烴的短短芽孢桿菌Brevibacillus brevis HTCGMCC No. 1142;中國專利(200710059755. 9)公開了一株低溫解烴的極小單胞菌PUSillim0nassp.T7-7。除此以外，目前報道的可以降解石油烴、修復(fù)石油污染土壤的微生物還有假單胞菌(Pseudomonas sp.)、棒桿菌(Corynebacterium sp·)、微球菌 (Micrococcus sp.)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)、芽孢桿菌(Bacillus sp·)、無色桿菌 (Achromobacter sp.)、諾卡氏菌(Nocardiasp.)，等等。從土壤中分離篩選高效石油烴降解菌，特別是適應(yīng)特定土壤環(huán)境的降解菌，仍是石油污染土壤修復(fù)的研究熱點之一。通常情況下，石油烴降解菌不太適應(yīng)鹽堿土壤環(huán)境，鹽堿脅迫影響其降解效果的發(fā)揮。從石油污染鹽堿土壤中分離得到的耐鹽堿的石油烴降解菌，比較適應(yīng)鹽堿土壤環(huán)境，可以在高鹽堿條件下高效地降解石油烴。表面活性劑對石油等疏水性有機污染物具有較好的分散效果，增大石油與微生物的接觸面積，提高微生物對石油烴的降解效果，在石油污染土壤的修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。如中國專利O00910027359. 7)公開了一種產(chǎn)脂肽短小芽孢桿菌Bacillus pumilus Y8A，該菌株能高效穩(wěn)定的產(chǎn)生脂肽類表面活性劑，有效促進石油的生物降解過程；中國專禾Ij (200710055897. 8)公開了一種采用降解菌 Rhodococcus erythropolis 禾口 Pseudomonas aeruginosa修復(fù)石油污染土壤的方法，該方法通過添加表面活性劑促進微生物降解石油。在修復(fù)過程中，氮磷等營養(yǎng)元素的添加可以增強土壤微生物的代謝活性，進而促進土壤中石油的降解。如中國專利O00710060166. 2)公開了一種應(yīng)用于石油污染修復(fù)的緩釋肥料。該肥料由顆粒狀氮肥、磷酸二氫鈣、微量元素等組成，可以緩慢釋放養(yǎng)分維持菌體生長，提高石油污染修復(fù)的效率。鹽堿土壤中營養(yǎng)元素較少，土壤肥力低，微生物活性差， 不利于石油烴的降解。施加氮肥和磷肥可以彌補鹽堿土壤這一缺陷。特別是施加磷酸二氫鉀、硫酸銨等酸性肥料，還可以中和土壤堿性，降解土壤PH值，改善土壤理化性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前石油污染鹽堿土壤修復(fù)中的問題，本發(fā)明提供一種適用于修復(fù)石油污染鹽堿土壤的微生物復(fù)合菌劑，可以快速有效地修復(fù)石油污染鹽堿土壤。本發(fā)明所使用的菌株是由發(fā)明人從石油污染的鹽堿土壤中分離篩選出來的3株高效降解石油烴且耐鹽堿的細(xì)菌，于2010年10月25日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。菌株包括巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)P9菌株(保藏編號為 CGMCCNo. . 4270)，假單胞菌(Pseudomonas sp. )P4 菌株(保藏編號為 CGMCC No. 4269)和木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) P2 菌株(保藏編號為 CGMCC No. 4268)。修復(fù)石油污染鹽堿土壤的微生物復(fù)合菌劑是由上述3株細(xì)菌的復(fù)合微生物菌液、 營養(yǎng)物質(zhì)和表面活性劑組成。3種組分的重量比例為30 200 1 2 0. 1 1，較好的是80 120 1 2 0.2 05。本發(fā)明所述的復(fù)合微生物菌液由巨大芽孢桿菌P9、假單胞菌P4和木糖氧化無色桿菌P2組成。各菌株的活菌體重量比例為1 3 1 3 1 3，較好的是1 1.5 1 15 1 2。本發(fā)明所述的營養(yǎng)物質(zhì)由硫酸銨等氮肥和磷酸二氫鉀等磷肥組成。氮肥和磷肥重量比例為1 20 1 2，較好的是5 10 1 1.5。本發(fā)明所述的表面活性劑由Triton-XlOO和十二烷基磺酸鈉組成。2種組分重量比例為1 3 1 3，較好的是1 2 1 2。本發(fā)明所述的復(fù)合微生物菌液可以由以下方法制備將巨大芽孢桿菌P9、假單胞菌P4和木糖氧化無色桿菌P2菌株分別接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(組分比例為牛肉膏5g、 蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml, ρΗ7· 0 7· 2，121°C滅菌20分鐘)，35 37°C恒溫?fù)u床 100 150r/min培養(yǎng)24 48小時。5000r/min離心10分鐘，取下層菌體沉淀，用pH7. 0 7. 5的磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 02 0. lmol/1)洗滌2次。將所得到的菌體沉淀按重量比為1 3 1 3 1 3的比例混合，重懸于與培養(yǎng)基等體積的pH7. 0 7. 5磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 02 0. lmol/1)中，即可得到復(fù)合微生物菌液。將復(fù)合微生物菌液、營養(yǎng)物質(zhì)、表面活性劑按重量比為30 200 1 2 0. 2 0. 5的比例混合即可得到本發(fā)明所述的石油污染鹽堿土壤的修復(fù)材料。本發(fā)明以環(huán)境生物學(xué)為理論依據(jù)，針對石油污染鹽堿土壤的特性，設(shè)計修復(fù)材料配方，可以高效地修復(fù)石油污染鹽堿土壤。本發(fā)明具有以下優(yōu)點①對鹽堿土壤中的石油污染具有較高的去除效率；②可以提高鹽堿土壤肥力，降低土壤PH值，改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤微生物活性，促進土壤微生物生長繁殖，對環(huán)境不造成二次污染；③選用的菌種來自石油污染的高度鹽堿化土壤，活性高、抗逆性強，適合鹽堿土壤修復(fù)。
具體實施例方式以下通過具體實施例闡述本發(fā)明，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。
具體實施方式
如下
實施例 1 將巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)P9、假單胞菌(Pseudomonas sp. )P4和木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)P2菌株分別接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(組分比例為牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml,pH7. O 7. 2，121°C滅菌20分鐘)，37°C恒溫?fù)u床150r/min培養(yǎng)48小時。5000r/min離心10分鐘，取下層菌體沉淀，用pH7. O 7. 5的磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 02 0. lmol/1)洗滌2次。將所得到的菌體沉淀按重量比為1 3 1 3 1 3的比例混合，重懸于與培養(yǎng)基等體積的pH7. O 7. 5磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 02 0. lmol/1)中，即可得到復(fù)合微生物菌液。將復(fù)合微生物菌液、硫酸銨、磷酸二氫鉀、Triton-XlOO和十二烷基磺酸鈉按100 1.5 1 0. 3 0. 3 的比例混合，得到本發(fā)明所述的修復(fù)石油污染鹽堿土壤的微生物復(fù)合菌劑。實施例2 按的施加量將制備得到的微生物復(fù)合菌劑加入石油污染鹽堿土壤中，混合均勻。10天后，測定土壤石油烴含量。烷烴含量由3870mg/kg降至2748mg/kg，下降了；芳香烴含量由79;3mg/g降至605mg/kg，下降了對％。再向石油污染鹽堿土壤中加入的微生物復(fù)合菌劑，混合均勻。10天后，烷烴含量降至2060mg/kg，20天累計降低了 47% ；芳香烴含量降至507mg/kg，累計降低了 36%。實施例3 按2%的施加量將制備得到的微生物復(fù)合菌劑加入石油污染鹽堿土壤中，混合均勻。7天后，測定土壤理化性質(zhì)。烷烴含量由3870mg/kg降至2718mg/kg，下降了 30% ；芳香烴含量由79;3mg/g降至60;3mg/kg，下降了對％。再向石油污染鹽堿土壤中加入2%的微生物復(fù)合菌劑，混合均勻。10天后，烷烴含量降至1823mg/kg，20天累計降低了 53% ；芳香烴含量降至430mg/kg，累計降低了 46%。
權(quán)利要求
1.一種適用于修復(fù)石油污染鹽堿土壤的微生物復(fù)合菌劑，其特征在于，復(fù)合菌劑是由微生物復(fù)合菌液、營養(yǎng)物質(zhì)和表面活性劑3種成分組成，3種組分的重量比為30 200 1 2 1 2。
2.權(quán)利要求1所述的微生物復(fù)合菌劑，其特征在于，選用的菌種于2010年10月25 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101 ；包括巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) P9 菌株(保藏編號 CGMCC No. · 4270)，假單胞菌(Pseudomonas sp. )P4 菌株 (保藏編號CGMCC No. . 4269)和木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) P2菌株 (保藏編號 CGMCC No. · 4268)。
3.權(quán)利要求1所述的微生物復(fù)合菌液，其特征在于，復(fù)合微生物菌液由巨大芽孢桿菌 P9、假單胞菌P4和木糖氧化無色桿菌P2的活菌體按照重量比為1 3 1 3 1 3 懸浮與磷酸鹽緩沖溶液制成。
4.權(quán)利要求1所述的營養(yǎng)物質(zhì)，其特征在于，由硫酸銨和磷酸二氫鉀等混合而成，重量比為1 20 1 2。
5.權(quán)利要求1所述的表面活性劑，其特征在于，由Triton-XlOO和十二烷基磺酸鈉混合而成，重量比為1 3 1 3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于修復(fù)石油污染鹽堿土壤的微生物復(fù)合菌劑及其制備方法，屬于環(huán)境保護技術(shù)領(lǐng)域。它主要由復(fù)合微生物菌液、營養(yǎng)物質(zhì)和表面活性劑3種成分組成。復(fù)合微生物菌液是由3株石油烴降解菌，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)P9菌株(保藏編號CGMCC No.4270)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)P4菌株(保藏編號CGMCC No.4269)和木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)P2菌株(保藏編號CGMCC No.4268)，通過液態(tài)培養(yǎng)得到的微生物菌體，與營養(yǎng)物混合而成。菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。復(fù)合微生物菌液與營養(yǎng)物質(zhì)、表面活性劑按30～200∶1～2∶0.2～0.5的比例混合，獲得微生物復(fù)合菌劑。本發(fā)明制備的微生物復(fù)合菌劑對鹽堿土壤中的石油污染具有較高的去除效率；可以同時降低鹽堿土壤的pH值，改善土壤理化性質(zhì)。
文檔編號C12N1/00GK102453678SQ20101051929
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者姜丹, 莊國強, 朱永官, 王新新, 白志輝, 韓禎 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心