專利名稱：一種以腺病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的人逆轉(zhuǎn)錄泡沫病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以腺病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的人逆轉(zhuǎn)錄泡沫病毒載體。
背景技術(shù)：
基因治療作為常規(guī)藥物治療的替代或(和)補充療法，正以日新月異的速度發(fā)展。 基因治療對象已從單基因遺傳病擴(kuò)展到多基因遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、艾滋病以及 神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前全球已有1，340種基因治療方案用于臨床?；蛑委煹妮d體主要有非 病毒性載體和病毒性載體。非病毒性載體雖然制備簡單、擁有較大的外源基因攜帶容量，但 是其轉(zhuǎn)染效率較低、外源基因不能長期表達(dá)并常有細(xì)胞毒性。病毒性載體的優(yōu)點是轉(zhuǎn)導(dǎo)效 率高、外源基因能夠?qū)崿F(xiàn)長期表達(dá)，但是其安全性、免疫原性是主要問題。因此構(gòu)建安全、有 效的基因載體一直是基因治療的瓶頸。腺病毒載體(Adenovirus Vector，AdV)是已經(jīng)進(jìn)入人類基因治療臨床實驗的載體 之一。與其他病毒載體相比較，腺病毒載體顯著的優(yōu)點是1)能非常容易地獲得高滴度的 病毒載體，未經(jīng)濃縮的病毒載體即可達(dá)到lX109pfu/ml ；2)能在體外體內(nèi)有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)各種 組織來源細(xì)胞；3)其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移不依賴細(xì)胞是否分裂。腺病毒載體也存在明顯缺點， 病毒基因組不能整合到宿主細(xì)胞基因組中導(dǎo)致轉(zhuǎn)移基因不能長期表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是人們熟知的能整合到宿主細(xì)胞基因組中的一大類病毒，其中正逆轉(zhuǎn) 錄病毒亞科(Orthoretrovirinae)的伽馬逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Gamma—retrovirus)禾口慢病毒屬 (Lentivirus)的成員都有應(yīng)用為病毒載體的，但是它們具有的潛在致病性限制了臨床上的 使用。泡沫病毒亞科是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的第二個亞科，長期的研究確認(rèn)其無致病性，現(xiàn)在正成 為病毒載體開發(fā)的“明星”。人泡沫病毒(Human Foamy Virus, HFV)顯示出作為基因表達(dá) 載體的良好的應(yīng)用前景1)迄今為止沒有HFV與人類疾病直接相關(guān)的研究報道，HFV載體有 很高的安全性；2)HFV自然感染發(fā)生率極低，人體沒有相應(yīng)抗體，HFV載體不易被血清滅活； 3)HFV宿主廣泛；4)HFV具有比其它逆轉(zhuǎn)錄病毒更復(fù)雜的復(fù)制調(diào)控過程，在缺乏反式激活因 子Bel-I時，HFV啟動子不能啟動病毒復(fù)制，因此HFV易于構(gòu)建復(fù)制缺陷型載體，保證其安全 性；5) HFV載體可以有效地整合于宿主細(xì)胞染色體，實現(xiàn)長期穩(wěn)定地表達(dá)外源基因；6) HFV 整合位點多為基因表達(dá)序列外的CpG島，其整合對宿主基因表達(dá)無明顯影響。目前，德國和 美國都在積極開發(fā)相關(guān)的泡沫病毒載體并應(yīng)用于造血干細(xì)胞的基因治療研究。本發(fā)明的完 成人在國內(nèi)外率先開展將HFV作為載體進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的研究，已成功構(gòu)建了 復(fù)制缺陷型HFV載體，并運用該載體介導(dǎo)谷氨酸脫羧酶基因進(jìn)行了神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療 的探索。但是，由于HFV獨特復(fù)雜的復(fù)制過程，有效的HFV載體包裝細(xì)胞系難以建立，目前 HFV載體的產(chǎn)生依賴多個質(zhì)粒的瞬時共轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致產(chǎn)生的載體滴度低下，一般未經(jīng)濃縮的滴 度約IO3-IO4轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml。經(jīng)過費時費力的超速離心等方法濃縮后，病毒載體方可達(dá)到應(yīng) 用濃度(》IO5轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml)，這大大限制了 HFV載體在體外和體內(nèi)的應(yīng)用。兼具有腺病毒高滴度和逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定表達(dá)特性的腺病毒-人泡沫病毒嵌合 載體(AdY-HFV Chimeric Vector)可能提供解決辦法。嵌合病毒(Chimeric or HybridViruses)并非新概念，多年前病毒學(xué)家們就將其作為一種工具在使用，例如，假型病毒 (Pseudotype Viruses)改變病毒表面糖蛋白為另外一種病毒的，以改變病毒親嗜性。前期 有研究者希望結(jié)合腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點構(gòu)建了腺病毒-鼠白血病病毒(AdV-MLV)嵌 合載體并進(jìn)行了相應(yīng)研究，結(jié)果顯示AdV-MLV嵌合載體兼具有高滴度和穩(wěn)定表達(dá)的特性， 但是由于MLV安全性問題，MLV載體在臨床實驗時引發(fā)兩名兒童白血病樣的疾病，研究遭到 終止。因此認(rèn)為以更具優(yōu)點更安全的HFV替代MLV,以腺病毒系統(tǒng)提高HFV載體滴度，構(gòu)建 具有高滴度和穩(wěn)定表達(dá)特性的AdV-HFV嵌合載體應(yīng)該是替代AdV-MLV載體的有效方案，同 時也是顯著提高HFV載體滴度使HFV載體能進(jìn)行體內(nèi)應(yīng)用的有效方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種安全、高效的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其沒有任 何病毒編碼序列，避免了野生型病毒載體可能產(chǎn)生的風(fēng)險，但仍能夠有效地表達(dá)外源基因。本發(fā)明提供的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來源于人泡沫病毒(HFV)，但僅包含1)HFV病毒復(fù)制裝配所必需的順式序列(CAS)。在本發(fā)明中，“順式序列”指DNA分 子中具有特殊功能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和其它調(diào)控基序。詳細(xì)的說，順式序列包括CASl和 CAS2兩部分。其中CASl包含引物結(jié)合位點、包裝信號Φ的序列；CAS2包括病毒轉(zhuǎn)錄活性 所必須的一段來源于pol基因的序列。2) HFV病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)。3)改造的增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的編碼序列。該序列來源于pEGFPAl質(zhì) 粒。詳細(xì)的說，根據(jù)pEGFP-Nl質(zhì)粒中所攜帶的經(jīng)過改造的eGFP基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增包 含eGFP編碼框架的片段。兼具腺病毒高滴度和HFV安全、能穩(wěn)定表達(dá)優(yōu)點的AdV-HFV嵌合載體是生產(chǎn)HFV 載體的基礎(chǔ)，這些嵌合載體包括1)對HFV病毒基因組進(jìn)行精減，僅保留HFV LTR和其復(fù)制裝配所必需的順式序列 CAS,并插入eGFP序列作為報告基因，構(gòu)建的pAdV-HFVcis嵌合質(zhì)粒載體；2)HFV的結(jié)構(gòu)蛋白基因(gag、pol和env基因)插入AdV載體質(zhì)粒中，構(gòu)建的 pAdV-Gag、pAdV-Pol 和 pAdV-Env。本發(fā)明分別構(gòu)建了四個攜帶HFV病毒蛋白、以及HFV基因組上必要順勢序列的 AdV-HFV質(zhì)粒載體(附圖1)。經(jīng)過轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可以獲得四種AdV-HFV嵌合病毒載體。這四 種嵌合病毒載體可以作為種子，不斷感染細(xì)胞，產(chǎn)生高低度的HFV病毒載體。本發(fā)明避免了 原有的需要不斷制備HFV質(zhì)粒，并且需要多個質(zhì)粒的瞬時共轉(zhuǎn)染才能產(chǎn)出HFV載體的繁瑣、 費時的生產(chǎn)過程。而且本發(fā)明所產(chǎn)生的HFV病毒載體不經(jīng)濃縮即可達(dá)到IO5轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml， 滴度明顯高于現(xiàn)有技術(shù)所制備的HFV病毒載體。本發(fā)明的HFV病毒載體可以進(jìn)一步的含有一個可用于進(jìn)行基因治療的目的基因。 僅當(dāng)需要該基因表達(dá)時，可以切除eGFP的編碼序列，插入目的基因的編碼序列?；蛘哌€ 可以進(jìn)一步的在eGFP上游引入IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點，internal ribosomal entry site)，目的在于表達(dá)兩個或更多個外源基因。本發(fā)明的HFV病毒載體可以進(jìn)一步含有一個 可篩選的標(biāo)記基因，例如NEO(新霉素抗性)基因。


圖1 =AdV-HFV嵌合載體基因組結(jié)構(gòu)示意圖。ITR :AdV反向末端重復(fù)序列，Pqime 人 巨細(xì)胞病毒早期啟動子，Ad DNA 腺病毒載體必需序列，5LTR/3LTR =HFV長末端重復(fù)序列， φ HFV 包裝信號，pA :SV40polyA。圖2 制備PAdV-Gag的方法。圖3 制備pAdV-Pol的方法。圖4 制備pAdV-Env的方法。圖 5-1 和 5-2 ；制備 pAdV-HFVcis 的方法。圖 6 :pShuttle-gag、pShuttle-pol、pShuttle-env 的酶切鑒定圖。質(zhì)粒本發(fā)明 所構(gòu)建的 pShuttle-gag、pShuttle-pol、pShuttle-env 重組質(zhì)粒；EcoR V、Nco I、Nhe I 表 示用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切后的電泳結(jié)果；Apa Ι/Κρη I表示進(jìn)行雙酶切后的電 泳結(jié)果。最左側(cè)標(biāo)注的為Marker條帶大小。圖 7 :pShuttle-HFVcis 的 PCR 鑒定圖。5LTR-CAS1、CAS2、3LTR 和 eGFP 分別表示 以pShuttle-HFVcis為模板，用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。最左側(cè)標(biāo) 注的為Marker條帶大小。圖 8 :pAdV-Gag、pAdV-Pol、pAdV-Env 和 pAdV-HFVcis 的酶切鑒定圖。pAdV-Gag、 pAdV-Pol、pAdV-Env和pAdV-HFVcis分別代表相應(yīng)質(zhì)粒載體進(jìn)行I-CeuI/PI_Sce I雙酶切 后的電泳結(jié)果。最左側(cè)標(biāo)注的為Marker條帶大小。圖9 =HFV病毒載體感染BHK-21細(xì)胞后eGFP的表達(dá)。IiT1、1(Γ2和1(Γ3分別表示不 同稀釋濃度的含有HFV病毒載體的上清液感染ΒΗΚ-21細(xì)胞后，HFV病毒載體所攜帶的eGFP 的表達(dá)情況。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例1 載體pAdV-Gag的構(gòu)建載體pAdV-Gag的構(gòu)建過程見附圖2。具體的說，為了獲得人泡沫病毒gag編碼序 列，以pHSRV13作為PCR模版、SEQ ID NO. 1 (GAGF)和2 (GAGR)的合成寡核苷酸作為引物進(jìn) 行PCR。用含IOOng模版質(zhì)粒DNA和1 μ 1各種引物(IOpmol/ μ 1)的50 μ 1 PCR反應(yīng)液進(jìn) 行30次PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，每次循環(huán)為94°C 30秒(變性),64°C 30秒(退火)和72°C 2分 鐘(聚合)。對gag的擴(kuò)增片段進(jìn)行Apa I和Kpn I酶切，插入pShuttle載體(Clontech， USA)的Apa I-Kpn I位點，產(chǎn)生pShuttle-gag。對構(gòu)建的pShuttle-gag進(jìn)行酶切鑒定， EcoR V單酶切得到約6. Ikb 一條帶，Apa I/Kpn I雙酶切得到4. Ikb和2. Okb兩條帶，驗證 正確(附圖6)。對pShuttle-gag 進(jìn)行 I-Ceu I 和 ΡΙ-Sce I 酶切，插入 pAdeno-X ViralDNA (Clontech, USA)的 I-Ceu I 和 PI-Sce I 位點，產(chǎn)生 pAdV-Gag 質(zhì)粒載體。對 pAdV-Gag進(jìn)行酶切鑒定，I-Ceu I/PI-Sce I雙酶切獲得約32. 7kb和3. 3kb的兩條帶，驗證 正確(附圖8)。實施例2 載體pAdV-Pol的構(gòu)建載體pAdV-Pol的構(gòu)建過程見附圖3。具體的說，為了獲得人泡沫病毒pol編碼序列，以PHSRV13作為PCR模版、SEQ ID NO. 3 (POLF)和4 (POLR)的合成寡核苷酸作為引物進(jìn) 行PCR。用含IOOng模版質(zhì)粒DNA和1 μ 1各種引物(IOpmol/ μ 1)的50 μ 1 PCR反應(yīng)液進(jìn) 行30次PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，每次循環(huán)為94 °C 30秒(變性)、63°C 30秒(退火)和72 °C 3 分30秒(聚合)。對pol的擴(kuò)增片段進(jìn)行Apa I和KpnI酶切，插入pShuttle載體的Apa I-Kpn I位點，產(chǎn)生pShuttle-pol。對構(gòu)建的pShuttle-pol進(jìn)行酶切鑒定，Nco I單酶切 得到約1. 9kb和5. 7kb兩條帶，Apa I/Kpn I雙酶切得到4. Ikb和3. 5kb兩條帶，驗證正確 (附圖6)。對pShuttle-pol 進(jìn)行 I-Ceu I 和 ΡΙ-Sce I 酶切，插入 pAdeno-X Viral DNA 的 I-Ceu I 和 PI-Sce I 位點，產(chǎn)生 pAdV-Pol。對 pAdV-Pol 進(jìn)行酶切鑒定，I-CeuI/PI-Sce I 雙酶切獲得約32. 7kb和4. 8kb的兩條帶，驗證正確(附圖8)。實施例3 載體DAdV-Env的構(gòu)建載體pAdV-Env的構(gòu)建過程見附圖4。具體的說，為了獲得人泡沫病毒env編碼序 列，以PHSRV13作為PCR模版、SEQID N0. 5 (ENVF)和6 (ENVR)的合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行 PCR0用含IOOng模版質(zhì)粒DNA和1 μ 1各種引物(IOpmol/ μ 1)的50 μ 1 PCR反應(yīng)液進(jìn)行 30次PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，每次循環(huán)為94 °C 30秒(變性)、65°C 30秒(退火)和72 °C 3分 種(聚合)。對env的擴(kuò)增片段進(jìn)行Apa I和KpnI酶切，插入pShuttle載體的Apa I-Kpn I位點，產(chǎn)生pShuttle-env。對構(gòu)建的pShuttle-env進(jìn)行酶切鑒定，NheI單酶切得到約 2. 8kb和4. 3kb兩條帶，Apa I/Kpn I雙酶切得到4. Ikb和3. Okb兩條帶，驗證正確(附圖 6)。對pShuttle-env 進(jìn)行 I-Ceu I 和 ΡΙ-Sce I 酶切，插入 pAdeno-X Viral DNA 的 I-Ceu I 和 PI-SceI 位點，產(chǎn)生 pAdV-Env。對 pAdV-Env 進(jìn)行酶切鑒定，I-CeuI/PI-Sce I 雙 酶切獲得約32. 7kb和4. 3kb的兩條帶，驗證正確(附圖8)。實施例4 載體pAdV-HFVcis的構(gòu)建載體pAdV-HFVcis的構(gòu)建過程見附圖5-1，5-2。以pHSRV13作為PCR模版，SEQ ID NO. 7(51F)和8(51R)的合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增5LTR-CAS1片段；SEQ ID N0. 9 (CAS2F)和10 (CAS2R)的合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增CAS2片段；SEQ ID NO. 1K3LTRF)和12(3LTRR)的合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增3LTR片段。擴(kuò)增體系同 上文所述，三個片段的退火溫度分別為63°C、59°C和63°C，聚合時間分別為1分種、2分30 秒和1分30秒，其他條件均如上文所述。對5LTR-CAS1片段分別進(jìn)行NheI和ApaI酶切， 插入 pShuttle 載體的 NheI-ApaI 位點，產(chǎn)生 pShuttle_5LTR_CASl。對 CAS2 片段進(jìn)行 XbaI 酶切，插入 pShuttle-5LTR-CASl 的 XbaI 位點，產(chǎn)生 pShuttle-5LTR-CASl_CAS2。對 3LTR 片 段依次進(jìn)行 BstXI 和 KpnI 酶切，插入 pShuttle-5LTR-CAS-l-CAS2 的 BstXI-KpnI 位點，產(chǎn) 生 pShuttle-5LTR-CASl-CAS2-3LTR。為了獲得綠色熒光蛋白EGFP編碼序列，以pEGFP-Nl (Clontech，USA)作為PCR模 版、SEQ ID N0. 13 (CENF)和H(CENR)的合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR。用含IOOng模版 質(zhì)粒DNA和1 μ 1各種引物(IOpmol/ μ 1)的50 μ 1 PCR反應(yīng)液進(jìn)行30次PCR擴(kuò)增反應(yīng)循 環(huán)，每次循環(huán)為94°C 30秒(變性)、62°C 30秒(退火)和72°C 2分種(聚合)。對EGFP 的擴(kuò)增片段進(jìn)行NotI酶切，插入pShuttle-5LTR-CASl-CAS2-3LTR 的NotI 位點，產(chǎn)生ρ Shuttle-5LTR-CAS1-CAS2-EGFP-3LTR。本載體攜帶HFV的必要順式元件，為病毒載體必需序
6列，最終命名為pShuttIe-HFVciS。對構(gòu)建的pShuttIe-HFVcis 進(jìn)行 PCR 鑒定。以 IOOng 的 pShuttle-HFVcis 質(zhì)粒為 模版，分別用上述引物擴(kuò)增665bp的5LTR-CAS1片段、2038bp的CAS2片段、1149bp的3LTR 片段和1415bp的eGFP片段，結(jié)果表明載體構(gòu)建成功(附圖7)。對pShutt le-HFVc is 進(jìn)行 I-Ceu I 和 ΡΙ-Sce I 酶切，插入 pAdeno-X ViralDNA 的 I-Ceu I 和 PI-Sce I 位點，產(chǎn)生 pAdV-HFVcis。對 pAdV-HFVcis 進(jìn)行酶切鑒定，I-Ceu I/ PI-Sce I雙酶切獲得約32. 7kb和6. 6kb的兩條帶，驗證正確(附圖8)。實施例5 載體的牛產(chǎn)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293a細(xì)胞。以4xl05細(xì)胞/孔接種6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞濃度達(dá)到70-80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染(約24小時)。質(zhì)粒pAdV-Gag、 pAdV-Pol、pAdV-Env和pAdV-HFVcis用Pac I酶切，獲得線性的AdV基因組。各取4ug進(jìn) 行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)10-14天后收集培養(yǎng)基，通過0.45mm濾膜過濾，分別收獲含有AdV-Gag、 AdV-Po 1、AdV-Env和AdV-HFV cis重組病毒的上清液。過濾液立即使用或者_(dá)80°C凍存。用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞。以2xl06個細(xì)胞接種 IOcm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至細(xì)胞濃度達(dá)到70%進(jìn)行感染。等比例混合四種病毒(AdV-Gag、 AdV-Pol、AdV-Env和AdV-HFVcis)的過濾液，加入細(xì)胞進(jìn)行孵育感染，4天后收獲HFV病毒 載體。細(xì)胞培養(yǎng)液低速離心后通過0. 45um濾膜，得到含有病毒載體顆粒的上清；同時細(xì)胞 經(jīng)消化濃縮于小體積培養(yǎng)液中，反復(fù)凍融三次，離心并過0. 45um濾膜去除細(xì)胞碎片，得到 含有病毒載體顆粒的上清。合并所得的上清，分成小份凍存于-80°C備用。實施例5 載體的滴度測定按IxlO5個BHK-21細(xì)胞每孔接種24孔板培養(yǎng)約24小時。用10倍系列稀釋的含 有HFV病毒載體的上清液感染細(xì)胞，每個稀釋濃度重復(fù)三個孔。48小時后，利用倒置熒光顯 微鏡觀察eGFP表達(dá)的情況(附圖9)。用軟件計數(shù)每孔中表達(dá)eGFP的細(xì)胞數(shù)目，取三孔的 平均值，再根據(jù)稀釋倍數(shù)推算實施例5中由腺病毒介導(dǎo)產(chǎn)生的HFV病毒載體的滴度。實驗 重復(fù)三次，最后計算出本發(fā)明所產(chǎn)生的HFV病毒載體滴度為IO5熒光細(xì)胞數(shù)目/mL。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種以腺病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的人逆轉(zhuǎn)錄泡沫病毒載體，其特征在于，來源于人泡沫病毒HFV，僅包含1)HFV病毒復(fù)制裝配所必需的順式序列CAS；2)HFV病毒的長末端重復(fù)序列LTR；3)改造的增強型綠色熒光蛋白eGFP的編碼序列；該病毒載體還包括AdV HFV嵌合載體，這些嵌合載體包括1)對HFV病毒基因組進(jìn)行精減，僅保留HFV LTR和其復(fù)制裝配所必需的順式序列CAS，并插入eGFP序列作為報告基因，構(gòu)建的pAdV HFVcis嵌合質(zhì)粒載體；2)HFV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插入AdV載體質(zhì)粒中構(gòu)建的pAdV Gag、pAdV Pol和pAdV Env，HFV的結(jié)構(gòu)蛋白基因包括gag、pol和env基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以腺病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的人逆轉(zhuǎn)錄泡沫病毒載體，來源于人泡沫病毒HFV，僅包含1)HFV病毒復(fù)制裝配所必需的順式序列CAS；2)HFV病毒的長末端重復(fù)序列LTR；3)改造的增強型綠色熒光蛋白eGFP的編碼序列；該病毒載體還包括AdV-HFV嵌合載體，這些嵌合載體包括1)對HFV病毒基因組進(jìn)行精減，僅保留HFV LTR和其復(fù)制裝配所必需的順式序列CAS，并插入eGFP序列作為報告基因，構(gòu)建的pAdV-HFVcis嵌合質(zhì)粒載體；2)HFV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插入AdV載體質(zhì)粒中構(gòu)建的pAdV-Gag、pAdV-Pol和pAdV-Env，HFV的結(jié)構(gòu)蛋白基因包括gag、poi和env基因。
文檔編號C12N15/867GK101979606SQ201010526889
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者何小華, 劉萬紅, 孫燕, 李文鑫, 李治, 楊頻, 魏琳嵐 申請人:陜西師范大學(xué)