專利名稱：檢測a型流感病毒的核苷酸序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測A型流感病毒的核苷酸序列和試劑盒，尤指快速的基于LNA修飾 的短探針熒光RT-PCR檢測A型流感病毒的通用核苷酸序列和試劑盒，不僅適用于不同動物 組織樣本中A型流感病毒的準(zhǔn)確檢測，還可適用于不同動物活體樣本(主要為拭子樣品) 的A型流感病毒的檢測，可用于動物A型流感病毒的篩查，出入境檢疫等，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
流感病毒(Influenza Virus)屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，國際病毒 分類委員會(ICTV) 1995年發(fā)布的第六次分類報(bào)告，將正粘病毒科原來的1個(gè)屬(流感 病毒屬)分為3個(gè)屬，即A、B型流感病毒屬(Influenza Virus A, B)和C型流感病毒屬 (Influenza Virus C)。其中B型和C型流感病毒能引起人的感染，但流行規(guī)模很小。A型 流感病毒感染范圍很廣，能引起人和動物的大流行。其中動物流感幾乎均由A型流感病毒 引起。A型流感常以流行的形式出現(xiàn)，發(fā)病快，傳播蔓延非常迅速，危害巨大。歷史上多次 發(fā)生A型流感病毒大流行，席卷全世界，1918年發(fā)生的A型流感大流行導(dǎo)致死于流感的人數(shù) 甚至超過第一次世界大戰(zhàn)死亡的人數(shù)。動物A型流感主要包括禽流感，豬流感，馬流感以及其他動物的流感。近二十年 來，由于世界各地動物流感的暴發(fā)頻率越來越高、流行面積越來越廣，因而導(dǎo)致全球?qū)λ?高度關(guān)注，雖然各國對動物流感防制策略不盡相同，但都把動物流感的快速診斷和及時(shí)監(jiān) 測作為首要步驟。在國際貿(mào)易中，對動物流感的檢疫也成為各國進(jìn)出口貿(mào)易的重點(diǎn)檢測對 象。動物流感檢測方法包括傳統(tǒng)動物流感檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法。傳統(tǒng)動物流感 檢測方法主要有病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷(如瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、間接 血凝抑制實(shí)驗(yàn)及病毒中和試驗(yàn)等)，傳統(tǒng)的動物流感檢測方法不足之處在于操作繁瑣、診斷 時(shí)間長、結(jié)果重復(fù)性不好等。特別是動物流感宿主和血清型眾多，且新的變異株不斷出現(xiàn)， 而制備血清型特異性單克隆抗體相對困難，近來研究發(fā)現(xiàn)，用雞胚分離和培養(yǎng)的流感病毒 常出現(xiàn)宿主介導(dǎo)變異，所有這些都限制了傳統(tǒng)方法在實(shí)際中的應(yīng)用。目前新型的核酸擴(kuò)增檢測方法發(fā)展快速，由于其簡便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，已經(jīng)在臨床 檢疫中廣泛應(yīng)用，取得了良好的效果，目前已有替代傳統(tǒng)檢測方法的趨勢。盡管A型流感病毒M基因相對保守，但不同毒株特別是來源于不同感染宿主的A 型流感病毒，在M基因序列上存在明顯差異。近期，鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)作 為一種新穎的核苷酸衍生物在生物學(xué)研究領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注，它是一種特殊的雙 環(huán)狀核苷酸衍生物，結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè)2' -0,4' -C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單 體，核糖的2' -0位和4' -C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞 甲基橋，并連接成環(huán)形，這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3'-內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的 柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。對DNA、RNA有很好的識別能力和強(qiáng)大的親
3和力。LNA和DNA、RNA互補(bǔ)的雙鏈有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性(Δ Tm = 3 8°C )，具有抗3 ‘脫氧 核苷酸酶降解的穩(wěn)定性，合成方法相對簡單，部分或完全修飾的LNA寡核酸鏈可用氨基磷 酸法在DNA自動合成儀上合成。本研究為保證方法的通用性，保證探針的匹配性，我們在大 量序列分析基礎(chǔ)上，在國內(nèi)首次設(shè)計(jì)LNA修飾的短探針用于檢測A型流感病毒，縮短了探針 的核苷酸數(shù)量，并提高了方法的靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測A型流感病毒核苷酸 序列，包括引物序列和基于LNA修飾的短探針序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的基于LNA修飾的檢測A型流感 病毒的通用檢測試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇A型流感病毒M基因編碼區(qū)特定序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對的基礎(chǔ)上， 進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。引物長度為20個(gè)堿基左右，GC含量為50% -60%，引物內(nèi)無二級結(jié) 構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5°C。探針 的長度在12 14個(gè)堿基左右，采用LNA修飾，并標(biāo)記熒光基團(tuán)。一組檢測A型流感病毒的通用核苷酸序列，如下1)5，-CCRATC YTG TCA CCT CTGACTAA-3 ‘ (SEQ ID NO 1)2)5，-CGT CTA CGC TGC AGT CCT C_3，(SEQ ID NO 2)Y代表嘧啶，此處為T或C ;R代表嘌呤，此處為A或G ；3) 5，- [FAM] -CAC TGG GCA CGG JGA- [TAMRA 或 BHQ1] -3，(SEQ ID NO 3)其中序列1)和2)分別為檢測A型流感病毒M基因的正義引物和反義引物，序 列3)為檢測A型流感病毒M基因的LNA修飾的熒光短探針，用斜體表示的堿基用LNA 進(jìn)行修飾，即第4、7、10、13位的堿基用LNA進(jìn)行修飾，探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán) FAM(6-carboxy-熒光素)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)TAMRA或BHQl。我們采用TaqMan熒光RT-PCR檢測技術(shù)建立了 A型流感病毒通用檢測方法，對反 應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃度的優(yōu)化，引物探針濃度 的優(yōu)化，得到以下試劑盒。檢測A型流感病毒LNA修飾短探針檢測試劑盒，由以下組分組成1)裂解液購自INVITR0GEN公司，按15ml/瓶進(jìn)行分裝，2瓶/盒。2)RT-PCR反應(yīng)液，表1為反應(yīng)液配方。
表IRT-PCR反應(yīng)液配方
組分終濃度5 X RT-緩沖液0.5 X RT-緩沖液10 X PCR緩沖液0.5 X PCR緩沖液
權(quán)利要求
一組檢測A型流感病毒的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別為檢測A型流感病毒M基因的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO3為檢測A型流感病毒M基因的LNA修飾的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測A型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于所述探針序 列SEQ ID NO 3的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA或BHQ1，第 4、7、10、13位的堿基用LNA進(jìn)行修飾。
3.一種檢測A型流感病毒的試劑盒，由以下組分組成1)裂解液；2)RT-PCR反應(yīng)液，包括PCR緩沖液、RT緩沖液、MgCL2, dNTP、正義引物、反義引物和熒 光探針；3)RT-PCR酶顆粒；4)Taq DNA聚合酶；5)DEPC 水；6)陰性對照流感病毒陰性組織樣品，用0.01mol/L pH7. 2PBS緩沖鹽水制成20%懸 液，70°C作用1小時(shí)；7)陽性對照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對應(yīng)的DNA序列為序列表SEQ IDNo. 4所示的核苷酸序列；其中，正義引物為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’端標(biāo) 記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA或BHQ1，第4、7、10、13位的堿基用LNA 進(jìn)行修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測A型流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應(yīng) 液 0. 5 X PCR 緩沖液、0. 5 X RT 緩沖液、1. 5mmol/L MgCL2、0. 2mmol/L dNTP、0. 5 μ mol/L 正義 引物、0. 5ymol/L反義引物和0. 3 μ mol/L熒光探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組檢測A型流感病毒的核苷酸序列和試劑盒。該檢測A型流感病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO3，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別為檢測A型流感病毒M基因的正義引物和反義引物，序列SEQ IDNO3為檢測A型流感病毒M基因的LNA修飾的熒光探針。本發(fā)明進(jìn)一步公開了含有上述引物和探針的檢測A型流感病毒的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒具有快速、靈敏、特異、通用性好、重復(fù)性好及不易污染的特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/70GK101985664SQ201010526980
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者喬彩霞, 劉環(huán), 張偉, 張利峰, 張向東, 張鶴曉, 柏亞鐸, 汪琳, 蒲靜, 谷強(qiáng), 高志強(qiáng) 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局