專(zhuān)利名稱(chēng)：一種miRNA在腫瘤診斷和預(yù)后判斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種RNA小分子—— miR-99a在腫瘤診斷、治療方法選擇和預(yù)后判斷中的應(yīng)用及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
微小RNAOnicro RNA,簡(jiǎn)稱(chēng)miRNA)是一類(lèi)短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)約18 Mnt。關(guān)于miRNA的最早報(bào)道是1993年Lee等報(bào)道的在秀麗線(xiàn)蟲(chóng)(C. elegants)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種呈時(shí)間特異性表達(dá)的小分子RNA，即可調(diào)節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育的lin-Lee，R. C.等， The C.elegans heterochronic gene lin_4 encodes small RNAs withantisense complementarity to lin-14(線(xiàn)蟲(chóng)異時(shí)性基因lin-4編碼與lin-14反義互補(bǔ)的小RNA). Cell. 1993,75 :843_854。2000 年，Reinhart 等Reinhart，B. J.等，The21_nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans (20 核 1Q1 酸白勺 let-7RNA調(diào)控新桿狀線(xiàn)蟲(chóng)中的發(fā)育周期).Nature. 2000,403 :901_906又發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期表達(dá)的let-7。到目前，公用miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄了數(shù)百種人類(lèi)miRNA序列，其中三分之二已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)。微小RNA來(lái)源于長(zhǎng)度約為IOOObp的長(zhǎng)鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在細(xì)胞核中經(jīng)Drosha酶剪切形成長(zhǎng)度約60 80nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 miRNA前體(Pre-miRNA)。miRNA前體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)后，被進(jìn)一步加工成miRNA。微小RNA在動(dòng)植物細(xì)胞中通過(guò)對(duì)目標(biāo)mRNA的切割和轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、組織分化和腫瘤形成等多種過(guò)程。miRNA在物種間具有高度的保守性、時(shí)續(xù)性和組織特異性。目前認(rèn)為miRNA在細(xì)胞凋亡、增殖、分化、血管生成及腫瘤形成等方面均具有重要的調(diào)節(jié)作用，參與人體大約30 %的基因調(diào)節(jié)，與腫瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊亂及代謝紊亂等多種發(fā)病有關(guān)。在上述疾病中，miRNA與腫瘤的關(guān)系是很多研究的重點(diǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干miRNA通過(guò)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)與慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌高度相關(guān)。miRNA的正調(diào)控靶基因現(xiàn)象是最近的發(fā)現(xiàn)，具體機(jī)制還不明確。有學(xué)者提出了“癌微小RNA，，(OncomiRs)，，的觀點(diǎn)[Esquela-Kerscher, A.等， OncomiRs-mieroRNAs with a role in cancer (癌微小RNA-在癌癥中發(fā)揮作用的微小 RNA). Nat Rev Cancer. 2006,6 :259-269 ；Hammond, SM.等，MicroRNAs as oncogenes (作為癌基因的微小RNA). Curr Opin Genet. 2006，16 :4_9，即認(rèn)為某些miRNA的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中充當(dāng)了類(lèi)似癌基因的角色。研究發(fā)現(xiàn)microRNA主要通過(guò)促進(jìn)靶mRNA的降解或抑制其翻譯過(guò)程而發(fā)揮調(diào)控作用，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝及分化等過(guò)程。MicroRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展及演進(jìn)有著極為密切的關(guān)系?；蚪M不穩(wěn)定性是惡性腫瘤的基本特征，在癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中經(jīng)常伴隨染色體的擴(kuò)增或缺失，從而導(dǎo)致癌基因的激活或抑癌基因的失活。許多microRNA分子定位于癌染色體變異區(qū)內(nèi)，可作為癌基因或抑癌基因而在癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，miRNA以其分子量小、實(shí)驗(yàn)操控性強(qiáng)以及功能特異性等特點(diǎn)，使研究者們對(duì)其與腫瘤診斷、治療和預(yù)后領(lǐng)域的興趣越來(lái)越濃厚。目前發(fā)現(xiàn)，microRNA的表達(dá)情況可鑒別肺癌和肺組織，也可以用于預(yù)測(cè)肺癌患者的預(yù)后。let-7miRNA在肺癌組織內(nèi)低表達(dá)，腫瘤組織內(nèi)相對(duì)低表達(dá)的患者接受根治性手術(shù)后的預(yù)后比高表達(dá)let-7的患者差，可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素Takamizawa，J.等， Reduced expression of the let_7microRNAs in human lungcancers in association with shortened postoperative survival (胃失豆白勺月白勺入月市―巾白勺 let_7it 小RNA表達(dá)下降).Cancer Res. 2004 ；64 :3753-3756。在其它腫瘤亦有許多類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。Roldo 等Roldo, C 等，MicroRNA expression abnormalities in pancreaticendocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features andclinical behavior (胰分泌物和腺泡腫瘤中的微小RNA表達(dá)異常與獨(dú)特的病理學(xué)特征及臨床行為相關(guān)).J Clin Oncol. 2006 ；24 :4677-4684的研究亦提示miRNA的表達(dá)情況可準(zhǔn)確鑒別胰腺腫瘤和正常胰腺組織，且可以進(jìn)一步用于不同類(lèi)型腫瘤組織的鑒別，其中miR-21的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖率和胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率正相關(guān)， 與腫瘤術(shù)后的預(yù)后相關(guān)。miR-99a位于人基因組的21q21位。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR_99a在舌鱗狀細(xì)胞癌Wong TS 等，Mature miR-184 as potential oncogenic microRNA ofsquamous cell carcinoma of tongue. Clinical Cancer Research. 2008,14 :2588-2592.，兒童 lIf ±1/11 M@Doghman M Regulation of Insulin-IikeGrowth Factor-Mammalian Target of Rapamycin Signaling by MicroRNA inChildhood Adrenocortical Tumors. Cancer Research. 2010，70 :4666-4675.、暴露于香煙煙霧的大鼠肺中Izzotti A等， Downregulation of microRNAexpression in the lungs of rats exposed to cigarette smoke. Faseb Journal. 2009,23 :806-812.下降。miR_99a 在 HCMV 感染 MRC_5(人胎肺細(xì)胞)后下降并抑制 HCMV 的增殖。Wang FZ 等，Human cytomegalovirus infection alters the expression ofcellular microRNA species that affect its replication. J Virol. 2008,82(18) :9065-74.。另有報(bào)道表明 miR-99a/let_7c/miR-125b 基因簇在肺癌中易丟失George Adrian Calin 等，Human microRNA genes are frequently located atfragile sites and genomic regions involved in cancers. PNAS. 2004,101 (9) 2999-3004.，說(shuō)明miR_99a可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，本領(lǐng)域中尚無(wú)關(guān)于miR_99a 在肝癌中的作用的報(bào)道。由于癌癥是危害人類(lèi)健康的主要疾病之一，為了有效地治療和預(yù)防腫瘤(如肝細(xì)胞癌)，目前人們已經(jīng)越來(lái)越關(guān)注腫瘤的早期診斷和預(yù)后。以原發(fā)性肝癌(即原發(fā)性肝細(xì)胞癌Ofepatocellular carcinoma, HCC))為例，該疾病是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，患者死亡率在所有惡性腫瘤中居第三位。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，全球每年新增約60萬(wàn)HCC患者，而每年死于肝癌的人數(shù)也約為60萬(wàn)。HCC的發(fā)生是一個(gè)多步驟漸進(jìn)的過(guò)程，和慢性肝炎及肝硬化緊密相關(guān)。我國(guó)約有1.2億乙肝病毒攜帶者，占全球感染人數(shù)的1/3。HCC根治術(shù)后5年的復(fù)發(fā)率約為60-70%，其中術(shù)后1年的復(fù)發(fā)率所占比例高達(dá)51. 4-72. 3%，即使是小肝癌獲根治性切除后的5年復(fù)發(fā)率也達(dá)30-40%。 因此術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為進(jìn)一步提高肝癌治療效果的主要障礙。術(shù)后灌注化療轉(zhuǎn)移等治療方法有可能降低肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率，但是一些長(zhǎng)期研究顯示采用這些術(shù)后化療后患者的生存率反而相對(duì)與未行化療的患者降低。這些現(xiàn)象提示術(shù)后具有較高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的患者可能會(huì)受益于這些術(shù)后治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較低的患者采用這些術(shù)后治療可能會(huì)適得其反。如果能夠通過(guò)有效的預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的患者，就可以通過(guò)一系列的干預(yù)預(yù)防措施，降低復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)患者的生存期。因此，如何有效的診斷和干預(yù)HCC的發(fā)生并適應(yīng)性地選擇治療HCC患者的方法是一個(gè)緊迫的重要問(wèn)題。用臨床指標(biāo)(如 Μ分級(jí)、肝硬化程度)和單個(gè)分子指標(biāo)(如AFP、MMP)預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)有較長(zhǎng)的歷史。但是，臨床指標(biāo)或者病理類(lèi)型相似的患者卻有截然不同的臨床結(jié)局，所以用臨床指標(biāo)或者單獨(dú)的分子標(biāo)志來(lái)預(yù)測(cè)或評(píng)價(jià)患者難以取得滿(mǎn)意的效果。對(duì)腫瘤實(shí)行個(gè)體化、預(yù)見(jiàn)性的治療有助于更加深入理解臨床病理學(xué)特征，改善對(duì)患者的臨床處理，從而提高腫瘤患者的無(wú)瘤生存期及絕對(duì)生存期。確定肝癌相關(guān)基因及其參與肝癌發(fā)病機(jī)理，可為肝癌個(gè)體化預(yù)見(jiàn)性治療提供基礎(chǔ)，也為新的治療方案提供靶點(diǎn)，從而有利于提高 HCC 的治愈率[Thorgeirsson, S.等，Hunting for tumor suppressor genes in livercancer(肝癌中腫瘤抑制基因的探索).H印atology. 2003 ；37 :739-741。目前，由腫瘤基因表達(dá)模式所回顧的分子模擬，已經(jīng)被用于確定不同的癌癥類(lèi)型包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和腦瘤的預(yù)后的新的分子標(biāo)準(zhǔn)。1999年，Tamayo等率先利用基因芯片技術(shù)對(duì)急性白血病進(jìn)行研究，根據(jù)腫瘤的基因表達(dá)譜對(duì)白血病進(jìn)行分型，并根據(jù)所建立的模型對(duì)新的患者進(jìn)行腫瘤類(lèi)型預(yù)測(cè)， 從而為利用基因芯片對(duì)腫瘤的分類(lèi)和預(yù)測(cè)開(kāi)創(chuàng)了先河Tamayo，P.等，hterpreting patterns of gene expression with self-organizing maps :methodsand application to hematopoietic differentiation(具有自組織地圖的基因表達(dá)翻譯模式造血分化的方法和應(yīng)用).Proc Natl Acad Sci USA. 1999 ;96 :2907_12。此后，類(lèi)似的方法也用于對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和乳腺癌進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。這些研究結(jié)果說(shuō)明，基因芯片技術(shù)能夠從分子水平對(duì)腫瘤進(jìn)行更準(zhǔn)確的分類(lèi)，并預(yù)測(cè)腫瘤亞型、預(yù)后和對(duì)治療的反應(yīng)性等特性。Van' t Veer等基于70個(gè)基因的乳腺癌預(yù)后診斷模型和相關(guān)診斷用芯片 MammqaPrint被FDA批準(zhǔn)上市，顯示出基于基因表達(dá)譜模型來(lái)基因疾病分型和預(yù)后判斷的良好前景。但是，基于微陣列的、由基因表達(dá)引起的HCC早期復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)的新近研究?jī)H報(bào)道在一小組患者1年內(nèi)的肝內(nèi)復(fù)發(fā)并且使用6000個(gè)基因的基因芯片Matoba，K.等，Tumor HLA-DR expression linked to earIyintrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma (與肝細(xì)胞癌的早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)的腫瘤HLA-DR表達(dá)).ht J Cancer. 2005 ； 115(2) :231-40。這就增加了 HCC預(yù)后判斷的復(fù)雜度，降低了可操作性。雖然本領(lǐng)域中已知某些微小RNA與腫瘤具有一定的相關(guān)性，但本領(lǐng)域中已知的 miRNA種類(lèi)繁多，功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關(guān)且可作為發(fā)病、治療方案選擇和預(yù)后指標(biāo)的特定miRNA存在較大的難度。目前，本領(lǐng)域中尚無(wú)miR-99a與腫瘤相關(guān)性的研究報(bào)道。綜上所述，本領(lǐng)域中迫切需要尋找到可有效用于腫瘤(尤其是肝癌)發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的miRNA，并將其用于這些用途中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是從數(shù)百種已知的miRNA中篩選出了腫瘤(尤其是肝癌)表達(dá)相關(guān)性及其對(duì)肝癌生長(zhǎng)的具有調(diào)控作用的miRNA——miR-99a,由此本發(fā)明提供了微小RNA miR-99a 或其前體在用于對(duì)象中腫瘤發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估中的新用途，并提供了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。在本發(fā)明的第一方面中，提供了檢測(cè)生物樣品中微小RNA miR-99a或其前體的試劑在制備用于對(duì)象中肝癌治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒中的應(yīng)用。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述miR_99a的前體在對(duì)象體內(nèi)經(jīng)加工轉(zhuǎn)化為miR_99a。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述miR-99a或其前體來(lái)自人、大鼠、小鼠、犬、馬、牛、兔或猴。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述miR_99a的序列如SEQ ID NO 1所示。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑是對(duì)微小RNA miR-99a或其前體具有檢測(cè)特異性的試劑，優(yōu)選所述試劑選自對(duì)微小RNA miR-99a或其前體具有檢測(cè)特異性的探針、基因芯片、和PCR引物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述試劑選自SEQ ID NOs :2_4所示的序列、miR_99a的反義序列、寡核苷酸或引物序列。在另一優(yōu)選例中，所述試劑帶有可檢測(cè)標(biāo)記，優(yōu)選所述可檢測(cè)標(biāo)記選自放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光部分、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、配體(如， 生物素或半抗原)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的肝癌選自原發(fā)性肝癌、肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝癌、或繼發(fā)性肝癌。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含選自下組的一種或多種容器、 使用說(shuō)明書(shū)、陽(yáng)性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、緩沖劑、助劑或溶劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物樣品選自獲自對(duì)象的新鮮組織或細(xì)胞、 福爾馬林固定或石蠟包埋組織或細(xì)胞、血液、或體液。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述生物樣品為獲自所述對(duì)象的腫瘤組織或細(xì)胞、正常組織或細(xì)胞，優(yōu)選腫瘤組織和非腫瘤癌旁組織。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種檢測(cè)試劑盒，其包含(i)檢測(cè)有效量的檢測(cè)微小RNA miR-99a或其前體的一種或多種試劑；(ii)選自下組的一種或多種物質(zhì)容器、使用說(shuō)明書(shū)、陽(yáng)性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、 緩沖劑、助劑或溶劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述試劑(i)是對(duì)微小RNA miR_99a或其前體具有檢測(cè)特異性試劑，優(yōu)選所述試劑選自對(duì)微小RNA miR-99a或其前體具有檢測(cè)特異性的探針、基因芯片、或PCR引物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述試劑選自SEQ ID NOs :2_4所示的序列、miR_99a的反義序列、寡核苷酸或引物序列。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述試劑盒還包含臨床上用于對(duì)象中腫瘤治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估的其它試劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒用于通過(guò)選自下組的方法檢測(cè)微小RNA miR-99a或其前體實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR、生物芯片檢測(cè)法、DNA印跡法、或RNA印記法原位雜交法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述使用說(shuō)明書(shū)中寫(xiě)明當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)象腫瘤組織中的微小RNA miR-99a或其前體的水平低于正常或?qū)φ战M織中的水平，則提示所述對(duì)象適于采用提高微小RNA miR-99a或其前體的量的治療方法來(lái)治療腫瘤、或腫瘤預(yù)后不
良ο在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的預(yù)后不良表現(xiàn)為與微小RNA miR-99a或其前體的水平未降低的患者相比生存期縮短、易發(fā)肝硬化、腫瘤數(shù)量增加快、腫瘤變大加快、門(mén)靜脈癌栓出現(xiàn)比例增加、或TNM分級(jí)上升。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種用于對(duì)象中腫瘤(尤其是肝癌)治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的方法，所述方法包括(a)檢測(cè)對(duì)象腫瘤組織或細(xì)胞中微小RNA miR-99a或其前體的水平；(b)將(a)中檢測(cè)的微小RNA miR-99a或其前體的水平與正常對(duì)照進(jìn)行比較；若所述對(duì)象的微小RNA miR-99a或其前體表達(dá)水平低于對(duì)照水平，則表明所述對(duì)象適于采用提高微小RNA miR-99a或其前體的量的治療方法來(lái)治療腫瘤、或腫瘤預(yù)后不良。在一個(gè)優(yōu)選例中，(a)中檢測(cè)的微小RNA miR_99a或其前體的水平至少比正常對(duì)照中的水平低10-50 %，優(yōu)選20-40 %，更優(yōu)選30-35 %。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述提高微小RNA miR-99a或其前體的量的治療方法包括 給予微小RNA miR-99a或其前體或包含微小RNA miR_99a或其前體的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述對(duì)照水平選自由該對(duì)象非腫瘤的正常生物樣品(例如獲自該對(duì)象非腫瘤癌旁組織或正常組織的樣品)中測(cè)得的miR-99a或其前體水平、通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)確定的群體標(biāo)準(zhǔn)水平、或經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的水平。本發(fā)明的上述技術(shù)方案中的技術(shù)特征可相互組合，以得到同樣適于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的的技術(shù)方案。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1 :HCC中miR_99a表達(dá)水平與患者生存時(shí)間之間的關(guān)系。其中，圖IA為無(wú)瘤生存時(shí)間的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)；圖IB為總體生存時(shí)間的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)(P值使用 SPSS 17. 0 中的 log-rank test 計(jì)算)。圖 2 :miR-99a 對(duì) HCC 細(xì)胞系！fepG2、SMMC_7721、Huh7 增殖的影響。其中，圖 2A 禾口圖2B為EdU檢測(cè)結(jié)果，圖2C為MTT檢測(cè)結(jié)果(結(jié)果顯示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 4) ；*，Ρ < 0. 05 ；**，P < 0. 01)。圖3 :miR-99a對(duì)HCC細(xì)胞系H印G2、SMMC_7721、Huh7細(xì)胞周期(Gl期)的阻滯作用。其中，圖3A為各細(xì)胞系在所示時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期分析圖，同步化后的釋放時(shí)間點(diǎn)記為 Oh ；圖;3B為細(xì)胞同步化釋放后:3h(HepG2和SMMC7721)或9小時(shí)(Huh7)時(shí)，各細(xì)胞系不同處理的Gl期細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)(結(jié)果顯示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 4) ；*，P < 0. 05 ；#，P
7< 0. 01)。圖4 :miR-99a對(duì)HCC細(xì)胞系H印G2、SMMC-7721、Huh7克隆形成能力的降低作用。圖5 瘤內(nèi)注射miR_99a后，miR_99a在SMMC-LTNM腫瘤中的表達(dá)情況的qRT-PCR 檢測(cè)(**，P < 0. 01)。圖6 瘤內(nèi)注射miR_99a后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。其中，圖6A為剝離的腫瘤圖片； 圖6B為腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)；圖6C為血清AFP含量(結(jié)果顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 8) ；*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的腫瘤組織中微小RNAmiR-99a 的表達(dá)會(huì)顯著下調(diào)，且下調(diào)的幅度與患者的生存時(shí)間存在相關(guān)性，其低表達(dá)與患者的預(yù)后差顯著相關(guān)，從而證實(shí)了 miR-99a在腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后中起重要作用。發(fā)明人在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-99a可在體、內(nèi)外有效抑制腫瘤細(xì)胞的繁殖和生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。由此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 miR-99a在用于對(duì)象中腫瘤發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估中的新用途，從而在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)成”、“基
本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”;“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”
和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，“分離的”或“分離純化的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。本發(fā)明提到的特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的
一般性例子。miR~99a 及其前體如本文所用，術(shù)語(yǔ)“miR_99a”或“微小RNA miR_99a”可互換使用，是指包含SEQ ID NO 1所示序列或其同源序列的微小RNA。本領(lǐng)域中已知各種來(lái)源的miR-99a，例如人、黑猩猩、馬、雞等，這些同源序列均包含在本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“miR-99a”中。本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)中還包含上述天然存在的miR-99a序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，或經(jīng)過(guò)生物學(xué)化學(xué)修飾，且仍然具有抗腫瘤活性的衍生RNA。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“miR-99a前體”是指在被施予對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)可被加工成為miR-99a的miRNA前體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉獲得天然存在的miR_99a前體的方法和手段，也可基于分子和遺傳學(xué)理論和手段構(gòu)建所述前體，例如Doghman M等，Regulation of Insulin-like Growth Factor-MammalianTarget of Rapamycin Signaling by MicroRNA in Childhood AdrenocorticalTumors. Cancer Research. 2010, 70 :4666_4675。本領(lǐng)域中已知miR-99a編碼基因的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一系列的加工成熟之后，形成成熟的miR-99a。miR-99a前體只有在加工成成熟的miR_99a后才具有相應(yīng)的生物學(xué)功能，因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可合理預(yù)期利用miR-99a的成熟序列及能夠產(chǎn)生或加工成為miR-99a的各種其它形式的核酸物質(zhì)(即本發(fā)明所述的“miR_99a前體”)均可獲得本發(fā)明所需獲得的效果，即起到抗腫瘤的效果，從而均可用于制備治療或預(yù)防腫瘤的組合物。本發(fā)明還包括一種載體，它含有攜帶所述miRNA或其前體的構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的構(gòu)建物或表達(dá)載體。這些方法包括但不限于基因重組技術(shù)、體外合成技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。檢測(cè)試布丨如本文所用，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)試劑”或“檢測(cè)miR-99a或其前體的試劑”可互換使用，均是指特異性針對(duì)微小RNA miR-99a或其前體，且可用于直接或間接檢測(cè)出miR_99a或其前體的存在和/或含量的試劑。由于miR-99a或其前體的序列在本領(lǐng)域中是已知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于常規(guī)手段制備或通過(guò)市售獲得特異性針對(duì)miR-99a或其前體的試劑。例如，本發(fā)明中可用的檢測(cè)試劑包括但不限于對(duì)微小RNA miR-99a或其前體具有檢測(cè)特異性的探針、基因芯片、或PCR引物，如miR-99a的反義序列、本發(fā)明實(shí)施例中所用的SEQ ID NOs :2_4所示的序列、或寡核苷酸或引物序列。為了便于檢測(cè)，本發(fā)明的檢測(cè)試劑還可帶有可檢測(cè)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記包括但不限于放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光部分、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、配體(如，生物素或半抗原)等。本發(fā)明的檢測(cè)試劑可存在于溶液中、固定于載體(如基片、吸附物)上或以其它本領(lǐng)域中常規(guī)的方式存在，只要該存在方式適于對(duì)生物樣品中miR-99a或其前體的檢測(cè)即可。例如，當(dāng)本發(fā)明的檢測(cè)試劑為核苷酸探針時(shí)，其可以生物芯片(或稱(chēng)“微陣列”)的形式存在。檢測(cè)試劑盒和生物樣品本發(fā)明中還提供了一種檢測(cè)試劑盒，其包含(i)檢測(cè)有效量的檢測(cè)微小RNA miR-99a或其前體的一種或多種試劑；(ii)選自下組的一種或多種物質(zhì)容器、使用說(shuō)明書(shū)、陽(yáng)性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、緩沖劑、助劑或溶劑，例如用于混懸或固定細(xì)胞的溶液，可檢測(cè)的標(biāo)簽或標(biāo)記，使核酸易于雜交的溶液，用于裂解細(xì)胞的溶液，或用于核酸純化的溶液。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中還可附有試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)，其中記載了如何采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，和如何利用檢測(cè)結(jié)果對(duì)腫瘤發(fā)展進(jìn)行判斷、對(duì)治療方案進(jìn)行選擇和/或?qū)︻A(yù)后進(jìn)行評(píng)估。采用本發(fā)明的試劑盒，可通過(guò)選自下組的各種方法(包括但不限于)檢測(cè)微小RNA miR-99a或其前體實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR、生物芯片檢測(cè)法、DNA印跡法、或RNA印跡法或原位雜交法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際條件和需要對(duì)檢測(cè)方式進(jìn)行調(diào)整和改變。當(dāng)然，所述試劑盒還包含臨床上用于對(duì)象中腫瘤發(fā)展的判斷、治療方案的選擇和/ 或預(yù)后評(píng)估的其它試劑，以輔助或驗(yàn)證通過(guò)檢測(cè)miR-99a或其前體所得到的結(jié)果。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)具體需要進(jìn)行常規(guī)選擇。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物樣品”或“待測(cè)樣品”可互換使用，均是指獲自對(duì)象且用于miR-99a或其前體檢測(cè)的樣品。生物樣品可以是獲自對(duì)象的新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織、體液、血液、或細(xì)胞等，優(yōu)選為新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織。這些樣品可為切片、涂片、懸液、溶液、RNA提取物等適于檢測(cè)的各種形式存在，例如可在檢測(cè)前抽提組織或細(xì)胞中的總RNA。/ MJgWfe^Tffe不受如下原理限制本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)miR-99a可在體、內(nèi)外有效抑制腫瘤細(xì)胞(尤其是肝癌細(xì)胞)的繁殖和生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。由此可推測(cè)miR-99a或其前體水平的下降與腫瘤的發(fā)生(從而用于判斷是否已患有腫瘤)、治療(可針對(duì)性地提高患者miR-99a或其前體的水平)和預(yù)后具有密切的聯(lián)系，從而可用作腫瘤發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。通常，可利用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒，采用如下方法進(jìn)行腫瘤發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估(a)從對(duì)象獲得待測(cè)樣品；(b)使待測(cè)樣品與本發(fā)明檢測(cè)試劑盒中的檢測(cè)試劑接觸；(c)檢測(cè)該待測(cè)樣品中miR-99a或其前體的水平，并將該水平與對(duì)照水平相比較；(d)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行腫瘤發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估如檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)象組織中的微小RNA miR-99a或其前體的水平低于對(duì)照水平，則提示所述對(duì)象已患有腫瘤、適于采用提高微小RNAmiR-99a或其前體的量的治療方法來(lái)治療腫瘤、或腫瘤預(yù)后不良ο如本文所用，術(shù)語(yǔ)“對(duì)照水平”是指用作參照的miR-99a或其前體的水平，其包括但不限于由同一對(duì)象的非腫瘤正常生物樣品(例如獲自該對(duì)象非腫瘤癌旁組織或正常組織的樣品)中測(cè)得的miR-99a或其前體水平、通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)確定的群體標(biāo)準(zhǔn)水平、或經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的水平?？捎糜谔崾舅鰧?duì)象已患有腫瘤、適于采用提高微小RNA miR_99a或其前體的量的治療方法來(lái)治療腫瘤、或腫瘤預(yù)后不良的水平差異可為待測(cè)樣品中的miR-99a或其前體水平比對(duì)照水平低10-50 %，優(yōu)選20-40 %，更優(yōu)選30-35 %。提高微小RNA miR-99a或其前體的量的治療方法包括但不限于給予患者有效量的微小RNA miR-99a或其前體、或包含上述活性物質(zhì)的組合物。可通過(guò)如下方法(例如但不限于)將這些物質(zhì)給予對(duì)象直接裸RNA注射法、脂質(zhì)體包裹RNA直接注射法、金包被RNA 基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒RNA法或復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的RNA法。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)后，，是指預(yù)測(cè)疾病的可能病程和結(jié)局，其包括判斷疾病的特定后果(如康復(fù)，某種癥狀、體征和并發(fā)癥等其它異常的出現(xiàn)或消失及死亡)。本發(fā)明中所述的預(yù)后不良包括但不限于生存期縮短、易發(fā)肝硬化、腫瘤數(shù)量增加快、腫瘤變大加快、門(mén)靜脈癌栓出現(xiàn)比例增加、TNM分級(jí)上升等。在預(yù)測(cè)了患者預(yù)后情況后，可結(jié)合提高微小RNA miR-99a或其前體的量的治療方法改善患者的預(yù)后。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要在于(a)本發(fā)明揭示了 miR-99a在肝癌發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估中的新用途，為miR-99a、乃至miRNA的研究和開(kāi)發(fā)利用提供了新的思路和途徑；(b)本發(fā)明的miR-99a或其前體可有效用于肝癌發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估，從而為本領(lǐng)域提供了一種新穎的肝癌診斷劑和/或治療劑，具有一定的臨床應(yīng)用前景。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1.檢測(cè)試劑盒的制備按如下組成制備檢測(cè)試劑盒，該試劑盒適于以實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)生物樣品中miR-99a的表達(dá)(a)裝有反轉(zhuǎn)錄酶QOOU/ μ 1)的容器；(b)裝有RNA酶抑制劑(40U/ μ 1)的容器；(c)裝有反轉(zhuǎn)錄 5X 緩沖液(75mM KCl,500mM Tris_Cl，pH 8. 3，25°C，3mM MgCl2, IOmM DTT)的容器；(d)裝有目的miRNA反轉(zhuǎn)錄引物和PCR上游引物和下游引物(10 μ M)的容器 miR-99a反轉(zhuǎn)錄引物為5 ‘ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAG-3‘ (SEQ ID NO 2)；定量PCR引物5' -GCAACCCGTAGATCCGAT-3‘(上游，SEQ ID NO 3)禾口5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3‘(下游，SEQ ID NO 4)；(e)裝有內(nèi)參反轉(zhuǎn)錄引物和PCR上游引物和下游引物(10 μ M)的容器內(nèi)參TO小核RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物與定量PCR的下游引物相同，序列為5，-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT—3，(SEQ ID NO 5)；定量PCR引物為5，-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3，(上游，SEQ ID NO 6)；和5，-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3，(下游，同上 SEQ ID NO 5)；(f)裝有 10XPCR 緩沖液(50mM KCl, IOOmM Tris-Cl, pH9. 0,25 °C，1.0 % TritonX-100)；(g)裝有dNTP (每種IOmM)的容器；(h)裝有Taq DNA聚合酶(3U/ μ 1)的容器；(i)裝有熒光染料(STOR I)的容器；以及(j)使用說(shuō)明書(shū)。實(shí)施例2 :miR-99a表達(dá)量與HCC的關(guān)系采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法，以實(shí)施例1中制備的檢測(cè)試劑盒對(duì)2002 至2006年收集的共142例HCC患者的HCC組織與癌旁組織(來(lái)自東方肝膽醫(yī)院標(biāo)本庫(kù))中miR-99a的表達(dá)進(jìn)行了分析。采用TRIzoKlnvitrogen 公司)抽提組織總 RNA0 在 LightCyclerl. 5 (Roche 公司)實(shí)時(shí)定量PCR儀上，采用實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒完成qRT-PCR。miRNA的相對(duì)定量使用 2_“ct 法計(jì)算(Ug 為內(nèi)參)Livak, KJ.等，Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2~Δ Δ Ct method. Methods. 2001 ；25 402-408。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-99a在約87%的HCC癌旁組織中有所下降(結(jié)果未顯示)。 對(duì)miR-99a的低表達(dá)與患者生存時(shí)間的性關(guān)性進(jìn)行分析，P值使用SPSS17. O中的log-rank test計(jì)算，結(jié)果分別如圖IA和圖IB所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-99a的低表達(dá)與患者更短的無(wú)瘤生存時(shí)間和總體生存時(shí)間顯著相關(guān)。對(duì)影響HCC預(yù)后的危險(xiǎn)因素進(jìn)行Cox回歸分析，危害比(95%可信區(qū)間)和P值使用SPSS 17. O中的單因素和多因素Cox回歸分析計(jì)算。結(jié)果如表1所示。表1影響HCC患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的單因素和多因素Cox回歸分析
權(quán)利要求
1.檢測(cè)生物樣品中微小RNAmiR-99a或其前體的試劑在制備用于對(duì)象中肝癌治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-99a的序列如SEQIDNO :1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑是對(duì)微小RNAmiR-99a或其前體具有檢測(cè)特異性的試劑，優(yōu)選所述試劑選自對(duì)微小RNA miR-99a或其前體具有檢測(cè)特異性的探針、基因芯片、和PCR引物。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝癌選自原發(fā)性肝癌、肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝癌、或繼發(fā)性肝癌。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒還包含選自下組的一種或多種 容器、使用說(shuō)明書(shū)、陽(yáng)性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、緩沖劑、助劑或溶劑。
6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生物樣品選自獲自對(duì)象的新鮮組織或細(xì)胞、福爾馬林固定或石蠟包埋組織或細(xì)胞、血液、或體液。
7.—種檢測(cè)試劑盒，其包含(i)檢測(cè)有效量的檢測(cè)微小RNA miR-99a或其前體的一種或多種試劑；( )選自下組的一種或多種物質(zhì)容器、使用說(shuō)明書(shū)、陽(yáng)性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、緩沖齊U、助劑或溶劑。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于通過(guò)選自下組的方法檢測(cè)微小RNA miR-99a或其前體實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR、生物芯片檢測(cè)法、DNA印跡法、或RNA 印記法原位雜交法。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述使用說(shuō)明書(shū)中寫(xiě)明當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)象腫瘤組織中的微小RNA miR-99a或其前體的水平低于正?；?qū)φ战M織中的水平，則提示所述對(duì)象適于采用提高微小RNA miR-99a或其前體的量的治療方法來(lái)治療腫瘤、或腫瘤預(yù)后不良。
10.一種用于對(duì)象中肝癌治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的方法，所述方法包括(a)檢測(cè)對(duì)象腫瘤組織或細(xì)胞中微小RNAmiR-99a或其前體的水平；(b)將(a)中檢測(cè)的微小RNAmiR-99a或其前體的水平與正常對(duì)照進(jìn)行比較；若所述對(duì)象的微小RNA miR-99a或其前體表達(dá)水平低于對(duì)照水平，則表明所述對(duì)象適于采用提高微小RNA miR-99a或其前體的量的治療方法來(lái)治療肝癌、或肝癌預(yù)后不良。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種miRNA在腫瘤診斷和預(yù)后判斷中的應(yīng)用，具體涉及檢測(cè)生物樣品中微小RNA miR-99a或其前體的試劑在制備用于對(duì)象中肝癌治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及包含檢測(cè)微小RNA miR-99a或其前體的試劑的檢測(cè)試劑盒、以及用于對(duì)象中腫瘤治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的方法。本發(fā)明的用途、方法和試劑盒可有效用于腫瘤治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估，從而提供了一種新穎的腫瘤診斷劑和/或治療劑，具有一定的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102453759SQ20101052739
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者曹雪濤, 李冬, 李楠 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)