專利名稱：黃瓜枯萎病菌在提高哈茨木霉菌株l產(chǎn)木霉素水平中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及提高哈茨木霉菌產(chǎn)木霉素水平的方法。
背景技術(shù)：
微生物發(fā)酵中效價往往是決定生產(chǎn)成本以及實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸所在。對菌株 進(jìn)行遺傳改造、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化等是提高產(chǎn)素水平的常用方法。近年來，真菌誘導(dǎo) 子在植物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵生產(chǎn)次生產(chǎn)物的研究中得到廣泛應(yīng)用。真菌誘導(dǎo)子主要是 真菌的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)或分泌物，它們可以是真菌的菌絲體、菌絲體降解產(chǎn)物、發(fā)酵液、真菌 分泌物等，主要包括多糖、脫乙酰幾丁質(zhì)、β-1-3-葡聚糖、乙酰葡萄糖醛酸、糖蛋白、蛋白 質(zhì)、短肽、不飽和脂肪酸等。關(guān)于真菌誘導(dǎo)子在微生物發(fā)酵生產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用報(bào) 道很少。研究組從枸骨中分離篩選到一株產(chǎn)木霉素(Trichodermin)的活性內(nèi)生真菌-哈茨 木霉菌(Trichoderma harzianum),定名為哈茨木霉菌株(Trichoderma harzianum)L。該 菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14 日，保藏登記號CGMCC No. 1780。木霉素對多種農(nóng)作物病原真菌具有很強(qiáng)的抑制作用，在防 治作物病害中具有廣泛的應(yīng)用前景。從自然界分離的野生型菌株往往產(chǎn)素水平較低，生產(chǎn) 能力低下。國外有關(guān)哈茨木霉菌發(fā)酵生產(chǎn)木霉素的文獻(xiàn)甚少，BERTAGN0LLI等報(bào)道的哈茨木 霉菌株 Th008 產(chǎn)木霉素的單位為 0. 324μ g/mL(BERTAGNOLLI B L，DALY S and SINCLAIR J B.Antimycotic Compounds from the Plant Pathogen Rhizoctonia solani and its Antagonist Trichoderma harzianum. J. Phytopathology, 1998,146,131-135.)。石if究組分 離到的哈茨木霉菌株L現(xiàn)有的產(chǎn)木霉素單位約為80mg/L，為了更大的發(fā)揮哈茨木霉菌株L 和木霉素在生物防治上的應(yīng)用，提高木霉素產(chǎn)率是關(guān)鍵技術(shù)。在前期的研究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)添 加微生物誘導(dǎo)子能夠有效地提高木霉素產(chǎn)率，通過本發(fā)明為提高木霉素的發(fā)酵水平提供了 一種可行的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在研究提高哈茨木霉菌株L產(chǎn)素水平的試驗(yàn)中，生物活性測定表明滅活的黃瓜枯 萎病菌(Fusarium oxysporum)菌絲體的加入能夠提高哈茨木霉菌株L發(fā)酵液的抑菌效果。 采用氣相色譜分析發(fā)酵液中木霉素的含量，顯示添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體后發(fā)酵液 中木霉素的濃度與對照相比提高了數(shù)倍。本發(fā)明通過在哈茨木霉菌株L培養(yǎng)液中添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體，提高發(fā) 酵液中木霉素的濃度。該發(fā)明為哈茨木霉菌株L的產(chǎn)素水平提高提供了一種可靠的方法。本發(fā)明的目的是針對野生型菌株哈茨木霉菌株L產(chǎn)素水平低的不足，提供一種提 高其產(chǎn)素水平的方法；本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株代謝產(chǎn)物木霉素制備微生物農(nóng) 藥的方法。
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本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種提高哈茨木霉菌株L發(fā)酵液中木霉素含量的方法按以下步驟進(jìn)行(1)黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)黃瓜枯萎病菌，從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所購買。培養(yǎng)基為馬 鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基(配方為稱取200g去皮的馬鈴薯，切成塊煮沸半小時，然后 用紗布過濾，加葡萄糖20g，溶化后補(bǔ)足水至1L)，300mL三角瓶裝PD液體培養(yǎng)基60mL，用接 種鉤挑取少許黃瓜枯萎病菌菌絲于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置26°C 28°C搖床，200r/min，振蕩 培養(yǎng)6天，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，收集菌絲體，在_53°C、0. 5mbar條件下真空冷凍 干燥15h，滅活的菌絲體在無菌條件下用研缽研磨至粉末狀，備用； (2)哈茨木霉菌株L液體發(fā)酵哈茨木霉菌株L為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌(石一捃，申屠旭萍，俞曉平.1株枸 骨內(nèi)生真菌菌株的分類鑒定及其代謝產(chǎn)物的生防作用研究.植物病理學(xué)報(bào)，2009，39 (4) 362-367)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方其組分與含量(每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為黃瓜枯萎病菌 菌絲體粉末60mg，蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麩皮5g、MnCl2 0. Olg^KH2PO4 0. lg、 MgSO4 0.05g;對照中不添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末，其余組分與含量同發(fā)酵培 養(yǎng)基配方；300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨木霉菌株L孢子 懸液(IX IO6個/mL)于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置28°C搖床，180r/min，振蕩培養(yǎng)96h，發(fā)酵液經(jīng) 5000rmin離心lOmin，上清液用于木霉素含量的測定；(3)木霉素的檢測方法采用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(以5%苯基甲基硅 氧烷為固定液，30πιΧ320μπιΧ0. 25μπι)；檢測器氫火焰離子檢測器(FID)；檢測器溫度 2700C ；進(jìn)樣口溫度250°C ；柱溫度程序升溫，初始溫度100°C，保持5min，以10°C -min"1升 溫至260°C保持5min ；載氣氮?dú)?；流?. 5mL · min—1。本發(fā)明的有益效果一是本發(fā)明通過在哈茨木霉菌株L培養(yǎng)液中添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體，提 高發(fā)酵液中木霉素的濃度，這為哈茨木霉菌株L的產(chǎn)素水平提高提供了一種可靠的方法；二是本發(fā)明提供了制備防治作物真菌病害的微生物源農(nóng)藥的活性成分木霉素，為 農(nóng)用殺菌劑的開發(fā)增添了新的途徑。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提高木霉素產(chǎn)素水平的方法作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1 黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所購買。培養(yǎng) 基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)，300mL三角瓶裝PD液體培養(yǎng)基60mL，用接種鉤挑取少 許黃瓜枯萎病菌菌絲于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置26 V 28°C搖床，200r/min,振蕩培養(yǎng)6天，發(fā) 酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，收集菌絲體，在_53°C、0. 5mbar條件下真空冷凍干燥15h，滅 活的菌絲體在無菌條件下用研缽研磨至粉末狀，備用；哈茨木霉菌株L液體發(fā)酵哈茨木霉菌株L為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌，該菌株已 在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登記號CGMCC No. 1780。發(fā)酵培養(yǎng)基配方其組分與含量(每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為 黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末60mg，蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麩皮5g、MnCl2 0. Olg、 KH2PO4 O.lg、MgSO4 0.05g;對照中不添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末，其余組分與含 量同發(fā)酵培養(yǎng)基配方；300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨木霉菌 株L孢子懸液(IX IO6個/mL)于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置28°C搖床，180r/min，振蕩培養(yǎng)96h， 發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，上清液用于木霉素含量的測定；木霉素的檢測采用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(以5% 苯基甲基硅氧烷為固定液，30πιΧ320μπιΧ0. 25μπι)；檢測器氫火焰離子檢測器(FID)； 檢測器溫度270°C ；進(jìn)樣口溫度250°C ；柱溫度程序升溫，初始溫度10(TC，保持5min，以 IO0C · mirT1 升溫至 260°C保持 5min ；載氣氮?dú)猓涣魉?1. 5mL · mirT1 ；結(jié)果表明添加黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末后，哈次木霉菌L發(fā)酵液中木霉素的含 量與對照相比提高了 4倍(從0. 082g/L升高至0. 328g/L)。實(shí)施例2 黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)同實(shí)施例1 ；哈茨木霉菌株L液體發(fā)酵哈茨木霉菌株L為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌，發(fā)酵培養(yǎng) 基配方其組分與含量(每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末90mg，蛋 白胨 30g、玉米粉 10g、葡萄糖 15g、麩皮 5g、MnCl2 0. Olg^KH2PO4 0. lg、MgS04 0 . 05g ；對照中 不添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末，其余組分與含量同發(fā)酵培養(yǎng)基配方；300mL三角 瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨木霉菌株L孢子懸液(1 X IO6個/mL)于 滅菌的培養(yǎng)瓶中，置28°C搖床，180r/min,振蕩培養(yǎng)96h，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，上 清液用于木霉素含量的測定；木霉素的檢測同實(shí)施例1 ；結(jié)果表明添加黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末后，哈次木霉菌L發(fā)酵液中木霉素的含 量與對照相比提高了 4. 2倍(從0. 082g/L升高至0. 344g/L)。實(shí)施例3 黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)同實(shí)施例1 ；哈茨木霉菌株L液體發(fā)酵哈茨木霉菌株L為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌，發(fā)酵培養(yǎng) 基配方其組分與含量(每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末90mg (在 哈茨木霉菌液體發(fā)酵24小時后添加)，蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麩皮5g、MnCl2 0. Olg、KH2PO4 0. lg、MgSO4 0. 05g ；對照中不添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末，其余組 分與含量同發(fā)酵培養(yǎng)基配方；300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨 木霉菌株L孢子懸液(IX IO6個/mL)于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置28°C搖床，180r/min，振蕩培養(yǎng) 108h，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，上清液用于木霉素含量的測定；木霉素的檢測同實(shí)施例1 ；結(jié)果表明添加黃瓜枯萎病菌菌絲體后，哈茨木霉菌株L發(fā)酵液中木霉素的含量 與對照相比提高了 4. 25倍(從0. 082g/L升高至0. 349g/L)。實(shí)施例4 番茄灰霉病菌的培養(yǎng)番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)從浙江省農(nóng)業(yè)科院植 物保護(hù)與微生物研究所購買。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)，300mL三角瓶裝PD
5液體培養(yǎng)基60mL，用接種鉤挑取少許黃瓜枯萎病菌菌絲于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置26°C 28°C 搖床，200r/min,振蕩培養(yǎng)6天，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，收集菌絲體，在_53°C、 0. 5mbar條件下真空冷凍干燥15h，滅活的菌絲體在無菌條件下用研缽研磨至粉末狀，備 用；哈茨木霉菌株L液體發(fā)酵哈茨木霉菌株L為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌，發(fā)酵培養(yǎng) 基配方其組分與含量(每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為番茄灰霉病菌菌絲體粉末60mg，蛋 白胨 30g、玉米粉 10g、葡萄糖 15g、麩皮 5g、MnCl2 0. Olg^KH2PO4 0. lg、MgS04 0 . 05g ；對照中 不添加番茄灰霉病菌菌絲體粉末，其余組分與含量同發(fā)酵培養(yǎng)基配方；300mL三角瓶裝發(fā) 酵培養(yǎng)基60mL，用無菌的吸管吸取ImL哈茨木霉菌株L孢子懸液(1 X IO6個/mL)于滅菌的 培養(yǎng)瓶中，置28°C搖床，180r/min,振蕩培養(yǎng)96h，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心lOmin，上清液用 于木霉素含量的測定；木霉素的檢測采用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(以5% 苯基甲基硅氧烷為固定液，30πιΧ320μπιΧ0. 25μπι)；檢測器氫火焰離子檢測器(FID)； 檢測器溫度270°C ；進(jìn)樣口溫度250°C ；柱溫度程序升溫，初始溫度IOCTC，保持5min，以 IO0C · mirT1 升溫至 260°C保持 5min ；載氣氮?dú)?；流?1. 5mL · mirT1 ；結(jié)果表明添加番茄灰霉病菌菌絲體粉末后，哈茨木霉菌株L發(fā)酵液中木霉素的 含量(0.0825g/L升)與對照(0.0820g/L升)相比基本沒有提高。
權(quán)利要求
黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)菌絲體在提高哈茨木霉菌株(Trichoderma harzianum)L生產(chǎn)木霉素水平中的應(yīng)用，其特征在于將滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末加入到哈茨木霉菌株L的培養(yǎng)基中，對哈茨木霉菌株L進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，然后對發(fā)酵液進(jìn)行離心；其中哈茨木霉菌株L為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登記號CGMCC No.1780。
2.權(quán)利要求1所述的提高哈茨木霉菌株L發(fā)酵液中木霉素含量的方法，其特征在于所 述的培養(yǎng)基中含有滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末、蛋白胨、玉米粉、葡萄糖、麩皮、MnCl2、 KH2PO4、MgSO4。
3.權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基各組分含量(每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為滅活的黃瓜 枯萎病菌菌絲體粉末60-90mg、蛋白胨30g、玉米粉10g、葡萄糖15g、麩皮5g、MnCl2 0. Olg、 KH2PO4 0. lg、MgSO4 0. 05g。
4.權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)過程為培養(yǎng)基為馬鈴薯 葡萄糖液體培養(yǎng)基，用接種鉤挑取少許黃瓜枯萎病菌菌絲于滅菌的培養(yǎng)瓶中，搖床振蕩培 養(yǎng)；然后發(fā)酵液離心，收集菌絲體，真空冷凍干燥，將滅活的菌絲體在無菌條件下用研缽研 磨至粉末狀。
全文摘要
本發(fā)明公開了黃瓜枯萎病菌在提高哈茨木霉菌株L產(chǎn)木霉素水平中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法將滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末加入到哈茨木霉菌株L的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后對發(fā)酵液進(jìn)行離心，采用氣相色譜分析發(fā)酵液中木霉素的含量，顯示添加滅活的黃瓜枯萎病菌菌絲體粉末后發(fā)酵液中木霉素的濃度與對照相比提高了數(shù)倍。通過本發(fā)明為提高哈茨木霉菌株L產(chǎn)木霉素的發(fā)酵水平提供了一種可行的方法。
文檔編號C12R1/885GK101979619SQ20101052764
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者俞曉平, 申屠旭萍, 董勝張, 邊亞琳, 郝培應(yīng) 申請人:中國計(jì)量學(xué)院