專利名稱：一種提高l-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法
一種提高L-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高L-纈氨酸發(fā)酵過(guò)程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法， 屬于發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
黃色短桿菌是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)纈氨酸的常用菌株。在纈氨酸生產(chǎn)菌生 物合成的代謝途徑已經(jīng)清楚的前提下，理論上通過(guò)計(jì)算可以得出L-纈氨酸生產(chǎn)的得率在 0. 651g L-纈氨酸/g葡萄糖，而目前實(shí)際得率僅有約0. 25-0. 35gL_纈氨酸/g葡萄糖，較理 論值有較大的差距，所以仍具有很大的研究空間。但是，提高糖酸轉(zhuǎn)化率相對(duì)于提高產(chǎn)率而 言卻有相當(dāng)大的難度。近年來(lái)，代謝工程領(lǐng)域的研究結(jié)果表明，黃色短桿菌細(xì)胞內(nèi)主要由EMP和HMP途徑 進(jìn)入TCA。研究資料表明，在以葡萄糖為底物發(fā)酵時(shí)，乙醛酸循環(huán)并未出現(xiàn)，而且L-纈氨酸 生產(chǎn)菌黃色短桿菌XV0505菌株是亮氨酸和異亮氨酸雙重缺陷突變株，故代謝途徑中無(wú)亮 氨酸、異亮氨酸和乙醛酸循環(huán)。因此，過(guò)量碳的溢流會(huì)導(dǎo)致有機(jī)酸和其他物質(zhì)的生成。在黃 色短桿菌中，分析葡萄糖在胞內(nèi)的代謝途徑，明顯可以看到產(chǎn)物L(fēng)-纈氨酸的生物合成過(guò)程 中，HMP途徑所提供的能量是十分重要的，這樣代謝流在EMP、TCA和HMP之間的合理分配就 成為提高L-纈氨酸產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的前提。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用在培養(yǎng)基中添加一定量的檸檬酸或其鹽的方法來(lái)提高纈 氨酸生產(chǎn)菌L-纈氨酸發(fā)酵過(guò)程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。本發(fā)明采用代謝流量分析方法，定量研究了檸檬酸或檸檬酸鹽添加前后黃色短桿 菌XV0505合成L-纈氨酸代謝流量分布的變化。黃色短桿菌細(xì)胞內(nèi)主要由EMP和HMP途徑 進(jìn)入TCA。PEP通過(guò)CO2固定反應(yīng)生成OAA (草酰乙酸)，而OAA是合成L-蘇氨酸等雜酸的 前體。添加檸檬酸或鹽可以有效減少這一 TCA循環(huán)的回補(bǔ)反應(yīng)，以使更多的PEP參與L-纈 氨酸的合成，同時(shí)減少L-蘇氨酸等雜酸積累。丙酮酸是L-纈氨酸合成的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，丙 酮酸是L-纈氨酸生物合成的直接前體，同時(shí)副產(chǎn)物(L-丙氨酸和HAc)的合成和TCA均需要 丙酮酸的直接或間接參與。檸檬酸或檸檬酸鹽可以抑制丙酮酸激酶的活性，造成磷酸烯醇 式丙酮酸的積累。磷酸烯醇式丙酮酸是EMP途徑限速酶磷酸果糖激酶的抑制劑，所以磷酸 烯醇式丙酮酸的積累降低了磷酸果糖激酶的活性，從而降低了 EMP途徑的通量，緩解了 EMP 和TCA之間的代謝溢流，從而減少流向副產(chǎn)物(L-丙氨酸和HAc)的代謝流量，同時(shí)，葡萄糖 總通量沒(méi)有變化，所以更多的葡萄糖進(jìn)入HMP途徑生成了 L-纈氨酸合成所必需的能量。另 外，α-KG以谷氨酸脫氫酶作用生成谷氨酸或以氧化脫羧反應(yīng)生成琥珀酰輔酶A進(jìn)而合成 0ΑΑ,而L-谷氨酸為生成L-纈氨酸途徑中的轉(zhuǎn)氨作用提供氨基。添加適量檸檬酸鈉可以提 高合成谷氨酸的代謝流量，提高由L-谷氨酸生成L-纈氨酸的轉(zhuǎn)液氨平，有利于L-纈氨酸 合成。此方法在不增加額外設(shè)備和人力投入的情況下，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)發(fā)酵周期的縮短和 L-纈氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的大幅提高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的一種提高L-纈氨酸發(fā)酵過(guò)程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法，其特征 是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽，使其在培養(yǎng)基中的濃度均為0. 01 10g/L，優(yōu)選
30. 05 5g/L，更優(yōu)選0. 1 3g/L。其中所說(shuō)的檸檬酸鹽為檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。根據(jù)調(diào)整代謝流分配的原理提出了適用于提高纈氨酸生產(chǎn)菌L-纈氨酸發(fā)酵過(guò)程 中糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法，它通過(guò)添加檸檬酸或檸檬酸鹽降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激 酶的活力，減弱糖酵解途徑通量，降低有機(jī)酸的合成，緩解EMP和TCA之間的代謝溢流，使更 多的葡萄糖進(jìn)入HMP途徑生成了 L-纈氨酸合成所必需的能量，從而在糖耗相同的基礎(chǔ)上， 合成較多的L-纈氨酸，即提高了糖酸轉(zhuǎn)化率。
具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范 圍實(shí)施例1:采用的菌株為谷氨酸棒桿菌或黃色短桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng) 基[葡萄糖 80. 0，玉米漿 20mL,豆餅水解液 25mL，(NH4) 2S042. 0，K2HPO4 1. 2，MgSO4 · 7H20 0. 4，MnSO4 · 7H20 0. 015，lie 0. 06，Leu 0. 2，Met 0. 5，VB1 0. 3mg，生物素 0. 2mg]中添加 0. lg/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法將菌種接入種子培養(yǎng)基[葡萄糖25.0，玉米漿20mL，豆餅水解 液 15mL，酵母粉 4. 0，尿素 0. 6，K2HPO4 1. 0，MgSO4 · 7H20 0. 4，MnSO4 · 7H20 0. 01，VB1 0. 3mg, 生物素0. 2mg]中，接種量為5%;在32°C、pH為7. 0和溶氧為20%條件下于5L自動(dòng)控制發(fā) 酵罐中培養(yǎng)6h至對(duì)數(shù)期，按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中， 溫度控制在32°C，通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段供氧模式控制溶氧0 IOh為20%，10 32h為5%，通過(guò)自動(dòng)流加液氨控制pH在7. 0 7. 2，通過(guò)流加適量泡敵 消泡，并通過(guò)流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?.0%，發(fā)酵至32h停止。放罐 時(shí)，L-纈氨酸的產(chǎn)量為58. 7g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為26. 9%，分別比對(duì)照實(shí)驗(yàn)(L-纈氨酸產(chǎn)量為 57. Og/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為26. 0% )提高了 3.0%和3.5%。實(shí)施例2:采用的菌株為谷氨酸棒桿菌或黃色短桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng) 基(同實(shí)施例1)中添加1. Og/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。放罐時(shí)，L-纈氨酸的產(chǎn)量 為60. 5g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為27.9%，分別比對(duì)照實(shí)驗(yàn)(L-纈氨酸產(chǎn)量為57. Og/L,糖酸轉(zhuǎn)化率 為 26.0%)提高了 6.1%和 7.3%。實(shí)施例3:采用的菌株為谷氨酸棒桿菌或黃色短桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng) 基(同實(shí)施例1)中添加3g/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。放罐時(shí)，L-纈氨酸的產(chǎn)量為 61. 2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為28. 3 %，分別比對(duì)照實(shí)驗(yàn)(L-纈氨酸產(chǎn)量為57. Og/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為 26. 0% )提高了 7. 4%和 8. 8%。
權(quán)利要求
一種提高L 纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法，其主要步驟為采用谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等谷氨酸生產(chǎn)菌經(jīng)發(fā)酵獲得L 纈氨酸，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽，使其在培養(yǎng)基中的濃度均為0.01～10g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說(shuō)的檸檬酸或其鹽的濃度為0.05 5g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說(shuō)的檸檬酸或其鹽的濃度為0.1 3g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3所述的任意一種方法，其特征是其中所說(shuō)的檸檬酸鹽為檸檬 酸鈉或檸檬酸鉀。
全文摘要
一種提高L-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法。本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法制備L-纈氨酸的改進(jìn)方法。本發(fā)明根據(jù)調(diào)整細(xì)胞代謝流分配的原理，采用在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽的方法，來(lái)有效提高L-纈氨酸發(fā)酵過(guò)程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12P13/08GK101979626SQ20101052773
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日 公開號(hào)201010527736.發(fā)明者馮寧, 劉淑云, 徐慶陽(yáng), 謝希賢, 陳寧 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)