專利名稱：中華鱉微衛(wèi)星dna標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分子標記技術，具體涉及一種中華鱉微衛(wèi)星DNA遺傳標記。
背景技術：
微衛(wèi)星DNA又稱為短串連重復序列(STR)、簡單重復序列(SSR)、簡單序列長度多 態(tài)性(SSLP)，是指基因組中以1-6個核苷酸為單位串聯(lián)重復組成的核苷酸序列；其中，最常 見的是雙核苷酸重復，如((AC/TG)n及(AG/TC)n。不同的生物個體由于重復基序的重復次 數(shù)不同而顯示出多態(tài)性。研究表明，可能是DNA復制過程中的“鏈滑”(strand slippage)現(xiàn) 象造成微衛(wèi)星DNA多態(tài)性信息容量(polymorphic information content, PIC)較高。微衛(wèi) 星DNA的高突變性、共顯性表達及其在真核生物基因組中的普遍性，使其成為群體遺傳多 樣性的分析、親緣關系的鑒定、基因組作圖和遺傳育種的優(yōu)越的分子標記，與等位酶、RAPD 方法相比也有一定的優(yōu)越性。由于微衛(wèi)星具有數(shù)量多、在基因組內(nèi)分布均勻、多態(tài)性信息豐 富、易于檢測等優(yōu)點被作為優(yōu)良的遺傳標記(genetic marker)而得到廣泛應用。根據(jù)重復 單元的構成與分布，微衛(wèi)星DNA序列被分為三種類型單一型(pure)，復合型(compound)， 間斷型(interrupted)，例如單一型CACACACACACACACACACA復合型CACACACACACAGAGAGAGA間斷型CACATTCACACATTCATTCA中華鱉，又稱甲魚、王八、水魚、元魚、團魚、腳魚和老鱉，英文名ChineseSoftshell Turtle，拉丁文名(Pelodiscus sinensis)，中國除寧夏、新疆、青海及西藏未見報道外， 其余各省、市、自治區(qū)均有分布，以長江流域和華南地區(qū)為多見；國外分布于日本、朝鮮和越 南。中華鱉由于其藥用價值和營養(yǎng)價值，長期被大量消耗。而且，近年來的過度捕撈、生境破 壞、化學污染等，已經(jīng)導致中華鱉野生種群數(shù)量急劇下降。因此，中華鱉已被作為易危物種 列入了 1998年《中國瀕危動物紅皮書》和2000年IUCN(世界自然保護聯(lián)盟)瀕危物種紅色 名錄中。可見對野生種群的保護已經(jīng)迫在眉睫了，但要制定切實有效的保護計劃，就必須要 了解野生種群結構和遺傳多樣性等方面的信息。已經(jīng)有學者采用不同的分子標記技術(包 括線粒體細胞色素b基因序列、12S rRNA、RAPD等)對中華鱉的遺傳多樣性進行研究，但是 上述遺傳標記不能提供足夠的遺傳信息，如張永正等，中華鱉(Pelodiscus sinensis) 5個 不同地理種群細胞色素b基因序列變異及種群遺傳結構分析；吳平等，亞洲淡水和陸生龜 鱉類12S rRNA基因片段的序列分析和系統(tǒng)發(fā)生研究；肖亞梅等，中華鱉種群RAPD分析。為 了進一步了解中華鱉野生種群結構和遺傳多樣性等方面的信息，需要開發(fā)新的分子遺傳標 記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于分離克隆中華鱉微衛(wèi)星DNA標記，建立中華鱉 微衛(wèi)星DNA的技術體系并利用這些分子標記進行中華鱉的分類，親權鑒定及遺傳多樣性的分析。本發(fā)明解決技術問題的技術方案中華鱉微衛(wèi)星DNA標記，包括中華鱉微衛(wèi)星 (CA)n, (AAC)n, (ACAG)1^P (GATA)n富集文庫的構建，含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選及測 序，得到63個含有微衛(wèi)星重復序列的克隆，確定了 22個多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標記PSW01、 PSW02、PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSfflU PSW12、PSW13、 PSW14.PSW15 ；PSffOl為472個核苷酸、PSW02為375個核苷酸、PSW03為368個核苷酸、PSW04 為416個核苷酸、PSW05為346個核苷酸、PSW06為423個核苷酸、PSW07為337個核苷酸、 PSW08為379個核苷酸、PSW09為291個核苷酸、PSWlO為336個核苷酸、PSWll為345個核 苷酸、PSW12為367個核苷酸、PSW13為356個核苷酸、PSW14為371個核苷酸、PSW15為396 個核苷酸。


圖1 :PSW01位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型2 :PSW02位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型3 :PSW03位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型4 :PSW04位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型5 :PSW05位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型6 :PSW06位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型7 :PSW07位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型8 :PSW08位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型9 :PSW09位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型10 =PSfflO位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型11 =PSffll位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型12 :PSW12位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型13 :PSW13位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型14 :PSW14位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型15 :PSW15位點的引物擴增22只中華鱉基因組DNA的STR分型圖在圖1-圖15中，1-22分別代表1-22只中華鱉。
具體實施例方式下面結合附圖進一步詳述本發(fā)明。1、中華鱉微衛(wèi)星DNA富集文庫的構建1. 1 基因組的提取與酶切參照 Sambrook 等(2002，Molecular Cloning, 3nd463-471)的方法提取中華鱉基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI (購自TaKaRa公司) 酶切基因組，酶切產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下400-1000bp大小的DNA片段 并用膠回收試劑盒(購自上海生工)純化回收的酶切產(chǎn)物。1. 2 加接頭將純化回收的酶切產(chǎn)物的兩端加入接頭SauL-F (5，-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)
SauL-R(5，-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC_3，)，在T4連接酶(購自Promega公司)作用下16°C水浴連接過夜。1.3PCR檢測接頭連接以SauL-F為引物，以1. 2工序制的連接產(chǎn)物為模板進行PCR，50 μ L反應體系如 下5yL IOXexTaq 緩沖液，4 μ L MgCl2,4y L dNTP,0. 25 μ L exTaq 酶(購自 TaKaRa 公 司)，2yL引物SauL-F，5yL連接產(chǎn)物，加雙蒸水(ddH20)補至50 μ L。PCR反應程序如下 95°C預變性5分鐘，94°C變性45秒，60°C退火45秒，72°C延伸1分鐘，變性至退火三個步 驟重復35次，72°C充分延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(購于Axygen公司)進行純 化。1. 4磁珠富集將1. 3所制的純化產(chǎn)物與生物素標記的寡核苷酸探針雜交探針(CA) 12、(AAC)8, (ACAG) 6和(GATA) 6分別在72°C、58°C、67°C、55°C下雜交7小時。將雜交液加入已平衡好的 磁珠，室溫放置30分鐘。將離心管依次用洗滌緩沖液(6XSSC，0. 1% SDS ；2XSSC,0. 1% SDS ； IX SSC, 0. 1% SDS)于45°C洗兩次，再用雙蒸水室溫洗一次。最后加雙蒸水，在PCR儀 上95°C變性15分鐘，收集上清。1. 5PCR 富集以磁珠富集產(chǎn)物為模板，SauL-F為引物進行PCR擴增，50 μ L反應體系如下富集后的 DNA30y L，5y L IOXexTaq 緩沖液，4 μ L MgCl2,4y L dNTP,0. 25 μ L exTaq聚合酶，2 μ L弓丨物SauL-F,加雙蒸水補至50 μ L。PCR反應程序如下95°C預變性5分 鐘，94°C變性40秒，60°C退火45秒，72°C延伸1分鐘，變性至退火三個步驟重復35次，72°C 充分延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進行純化。1. 6感受態(tài)細胞的制備將ImL過夜培養(yǎng)的E. coliDH5 α培養(yǎng)液接于50mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培 養(yǎng)2小時至對數(shù)生長期(0D·達到0. 3-0. 5)時取出。將菌液于4°C離心10分鐘。棄上清， 加入ImL 0. lmol/L預冷的CaCl2重新懸浮細胞，用槍頭輕輕打勻。4°C離心10分鐘。棄上 清，加入預冷的甘油/CaCl2混合物重新懸浮菌體，用槍頭打勻，-80°C保存。1. 7 倒平板將LB固體培養(yǎng)基完全融化，冷卻至50°C左右，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培養(yǎng) 基(比例為LB固體培養(yǎng)基IOOmL ；氨芐青霉素(Amp) 100 μ L ；20%異丙基-β -D-硫代半乳 糖苷(IPTG) 7 μ L ;2 % 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(X-Gal) 40 μ L)，混合均勻后 倒入一只培養(yǎng)皿里，待培養(yǎng)基凝固后放入37°C烘箱，晾干水蒸氣。1. 8連接轉化取1. 5工序所制的PCR富集后的純化產(chǎn)物加入PMD18-T載體(購自TaKaRa公司) 于16°C水浴連接2小時后，放于4°C冰箱過夜，制成連接產(chǎn)物。取出1.6工序制成的感受態(tài)細胞，冰上復蘇至液態(tài)，加入上述連接產(chǎn)物，混勻。冰 浴30分鐘后放入42°C水浴鍋，熱激90秒，立即放入冰中冰浴2分鐘，加入新鮮的LB培養(yǎng) 基，37°C振蕩培養(yǎng)1小時。取100 μ L培養(yǎng)液涂布于LB/Amp/X-gal/IPTG培養(yǎng)基上，37°C倒 置培養(yǎng)過夜。2、含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選、測序及微衛(wèi)星引物的設計
2. 1 菌落 PCR 將平板上的白色單菌落分別放入事先裝有LB/Amp培養(yǎng)基的EP管中。37°C振蕩培 養(yǎng)至菌液渾濁。12. 5yL PCR反應體系包括Taq酶0. 25U(購自TaKaRa公司)，IOXBuffer 1. 25 μ L, dNTP 0. 2 μ M，MgCl22 μ M，引物 0· 4 μ M(SauL_F，primer- (CA) 12、(AAC)8, (ACAG)f^P (GATA) 6)，菌液0· 5 μ L，加雙蒸水補足體積。反應程序95°C預變性5分鐘，94°C變性40秒， 60°C退火45秒，72°C延伸1分鐘，變性至退火三個步驟重復35次，72°C充分延伸10分鐘， 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。2. 2陽性克隆測序及引物設計陽性克隆送生物公司測序，共得到63條含有微衛(wèi)星DNA的序列。根據(jù)微衛(wèi)星DNA 側翼序列，利用軟件primerprimer5設計63對微衛(wèi)星引物。并對這63對引物進行PCR擴 增檢測，最終有33對引物能穩(wěn)定擴增出目的條帶。對這33對引物的上游引物5’端分別用 FAM, HEX, TAMRA進行熒光標記。3、中華鱉多態(tài)性微衛(wèi)星位點引物的篩選及結果分析3. 1篩選有多態(tài)性的引物用1. 1工序中Sambrook等提取基因組的方法提取22只中華鱉基因組。用2. 2工 序設計所得的33對引物擴增基因組。反應程序95°C預變性5分鐘，94°C變性40秒，60°C 退火45秒，72°C延伸1分鐘，變性至退火三個步驟重復35次，72°C充分延伸10分鐘，1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)ARI PRISM 3730遺傳分析儀(Applied Biosystem公司) 進行基因分型(Genotyping)，使用Genemarkerl. 6軟件(Applied Biosystem公司)判讀等 位基因片段的具體數(shù)值。共得到15個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記(見表1) :PSW01、PSW02、 PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSfflU PSW12、PSW13、PSW14、 PSW15 ；PSffOl為472個核苷酸、PSW02為375個核苷酸、PSW03為368個核苷酸、PSW04為416 個核苷酸、PSW05為346個核苷酸、PSW06為423個核苷酸、PSW07為337個核苷酸、PSW08 為379個核苷酸、PSW09為291個核苷酸、PSfflO為336個核苷酸、PSffll為345個核苷酸、 PSW12為367個核苷酸、PSW13為356個核苷酸、PSW14為371個核苷酸、PSW15為396個核 苷酸。3. 2結果分析使用CervuS3. O軟件計算期望雜合度和觀察雜合度。使用Gen印op4. O軟件計算 哈代一溫伯格以及連鎖不平衡的值，以此來描述15個中華鱉微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點的特征。由附圖1-15可看出，本發(fā)明的15個微衛(wèi)星序列的長度在供試的22只中華鱉中都 出現(xiàn)的多樣性，由此可見，本發(fā)明的這15個微衛(wèi)星標記能用于研究中華鱉的品種分類和遺 傳關系分析。本發(fā)明提供了 15個中華鱉的新的微衛(wèi)星位點及擴增這15個微衛(wèi)星位點的引物序 列和擴增方法，可應用于中華鱉不同地理種群的遺傳多樣性研究以及親權鑒定的研究，重 復性好，是一種可靠有效的分子標記。表1引物特性表位點，重復基序，引物序列，退火溫度位點
重復基序
引物序列(5’-3’)
PSffOl PSW02 PSW03 PSW04 PSW05 PSW06 PSW07 PSW08 PSW09 PSfflO PSffll PSff 12 PSff 13 PSW14 PSff 15
(GATA)
21
(CAAAA)6 (CAA)f
(GATA)12
(GATA)17
(ATAG)21
(AAC)10
(GATA)
22
(GATA)25
(GT)19
(TAGA)17
(GATA)25
(CA)17
(AGAC)7
(TAGA)
16
(GAAA)i序列表<110>安徽師范大學<120>中華鱉微衛(wèi)星DNA標記<130>1<160>15
F TGTTGTTTTGTATGATGAGAA
RATTTGCTGTAATAGTGGCT F TGCCAATATAGTCTCAGTAGT R GAAGGAAGTTGTTAGAACATC
FGCTAAGTTTTCCTATTTTTC
RGTTGTATGGTCCTTGTTCT
FATCACCTGACCATCTGTTTC
RTTCTCTCTGCCATCTTACTT
FCCTTGAACGCACTCTGTCTA
RTTTTGCTCATAGTGTTTCCC
FTTAGAGGTAGTGGAAGACAG
RTTAGTTAGCCAATAAGGATA
FTTACTGTCAAGTGCTGTCCC
RAGCGAATCCATAATCCTGTT
FTGTCACCACACTACCTATTT
RGTGTTCTTAGTCCACTCCTC
FCGAAGGTGAAAAAAGGTGTT
RATGTTTGTTTGCTGGGAAGG
FTAGACCAGGACCCCCTTATT
RTGATGGGATGTGGTAGCAGT
FGAGGTTGTCTTATTCTCTGC
RTCACAAGCCTTACTAAAAAC
FCAAAGGATACCATCACCAAG
RGAATAAGGGAAGTCAGAGGC
FATTTTTTTGGCATCCTTGTA
RCTCTTTCCGTCTGTCTTTTT
FTAGTCCTTTATTGAACCCTG
RCTTGAAAGAGCATCTCCATA
FTAAAGTGAGGCTAGAGAAG
RAAAAAATGAGTGAGTGATG
火度 退溫
C)
58
60
58
60
58
55
56
58
58
60
60
58
58
58
58
100066]<170>PatentIn Version3. 30067]<210>10068]<211>4720069]<212>DNA0070]<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensi0071]<400>10072]ctctctcacccacatattcccccatccatc0073]gaatagaacagattaaaaggagaggattaa0074]acgggtgatactttgaaatcatcacaaaca0075]tagatagatagatagatagatagatagata0076]tagatagatagatagatagatagataggta0077]ctgtataaaagacaggtattatataaaaga0078]atttgcaggaaacaagtataggatgttaaa0079]gcttaaatcacactgaagtgatcaggattt0080]<210>20081]<211>3750082]<212>DNA0083]<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensi0084]<400>20085]tgccaatatagtctcagtagtatagacttg0086]tcttctcctagaagcactgtgtgcaaaatt0087]tgtcaaaacaSLSLSLCSLSLSLSLCSL3.3.3. C 3.3.3.3. C 3.0088]gtttttccctaagtgagatgttctaacaac0089]ttgctacctccactagtattagctgttttt0090]accaagaaaagtgtattgctctgatagcac0091]tccaatgtcctcaca0092]<210>30093]<211>3680094]<212>DNA0095]<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensi0096]<400>30097]gctataatgtttgctaagttttcctatttt0098]aatgaaaattacaattgctttgaactggcc0099]cttgtatgcattaatattgacatataattg0100]tctttcgatagatagatagatagatagata0101]tgcatctgtctgtctgtccctgagtccatc0102]gtttaagaactcctcctaaactgtaagaac0103]cctaactt0104]<210>4
S)
caagaaacatgctgttgttttgtatgatga60ctttcaaggagggtttagctagctatactt120tttacgtcaatcacatgttccatttaacga180gatagatagatagataggtagatagataga240gatagccactattacagcaaatttaaaatg300caggtattatcccagatttatagacacatg360atcccaattcagcaaaacacttaagcacat420aagtgctttgctgaactgttta472S)ccctaaaagattaaaatggcagatatgagg60gtacactttcatatgcgctatgtttgtcaa1203.3.3. C 3.3. C 3.3. C3.3. C 3.3. C 3.3. C 3.aaaacctgct180ttccttctaggacaaggtggaaagtagcaa240ggtccaattcattacactttgttcccaaac300ttactgtagaagagttttcagaagagagaa360375S)tccatgtattttgcagttagtaagtgtttt60attctccttggggccgtaccggacgtttca120ctagacatagaattgcaagatatctacaca180gatagatagatagatagatagatagatttg240tattccatctgtctgtctgggagtccattt300aaggaccatacaactcgaaatttctcttgt360
368
11
<211>416<212>DNA<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensis)<400>4tgagccaatttccagatcgccttgactgattttcaaatcacctgaccatctgtttcaaat60
ttaagcatcccaaagtgcacaaagtctaaatagataaggcaagtcttaaattatgtacag120
agtgatactttaaatgatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatag180
atagatagatagatagatagatagaattccatccgcagggctatcgttaactttaaggca240
tataactgtatttgtatctgagagaaaaaatcattgttgagataatatatctgaagataa300
ctcacaaatgaatgcacaaagtaagatggcagagagaaagtccaaggggactcactaata360
atacttcacacagaattgttaagattgtcattctgagatattccagctag3.3. 3. 416
<210>5
<211>346
<212>DNA
<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensiS)
<400>5
aatgatgcaaagagacaaattaagtgtttgatgcatattttattccccttgaacgcactc60
tgtctaaaaataatagtgctattatttttggacagccactggcttagtggccaactgttt120
gattgctagaatgcaagttcttaagtatagatagatagatagatagatagatagatagat180
agatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagagttatgtga240
ttaaatgccattaccattatgcattccctgtttttgtgtaatgcctgcataagattttta300
gatggcataaagggaaacactatgagcaaaatgttcctgtttgatc346
<210>6
<211>423
<212>DNA
<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensiS)
<400>6
ggttggccactttaagtgaagcaggttcagctcgctgatgttagaggcaaatgtcccccc60
atttggccctgaggagagtcaggatgacactgaattagaggtagtggaagacagaagata120
tagaagggtagctccagaaaagaagtggggaaaggaggatgtggggaaatgctgaagaaa180
gcttcaggcagggaatgaacatccgtagtggttaccccgggatgggggta3.3.3.3. C 3.3. C 3.3.240
CSLSLCSLSLCSLSLCSLSLCSLSLCSLSLCSL3. C 3.3.3.3. C 3.3. Cctaggaagctgcttgaaaccctttggaatg300
aagttaaatcctgggagaagagatatggcatgtgaaagactctcgttttcctggaatgga360
agatatccttattggctaactaatatatgaaggccttgcacccacctgct420
CCC423<210>7<211>337<212>DNA<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensis)
<400>7
cttctcccccgaatcttttccaagccccacacatatcttctttattactgtcaagtgctg60
tccccctcttttgattcccaacaatagatttggactatccaagcttccgacaagaaggtg120
agatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagat180
agatagatagatagatagatagatagatagaggaattacttggggatacttctgtctgct240
cacaggaccatggacaaacaggattatggattcgcttcaacacagagtctaatagggata300
atttgttttattagtctcactgcgtcactgctactac337
<210>8
<211>379
<212>DNA
<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensiS)
<400>8
acttttggag￡l￡lC￡l￡ltC￡l￡l￡lCCCCclclclcltclttttgctttagaaatgtcaccacactacct60
atttccccaagaaggaagactattgtgcatcatggtgcatgcactatgtacagcctgcag120
gagagaccagaccatgaggcatcatagctgtatttccaaatcaatagatagatagataga180
tagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagataga240
tagatagatagatagatagatagatatcttgcttaaaagttccaagtattagaggagtgg300
actaagaacactttccaagaaatgcctccactaacacaataacactgtgcttcctctcaa360
atttcagtttgtcagagaa379
<210>9
<211>291
<212>DNA
<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensiS)
<400>9
ctagaaatctagctctgctatgatgttggtcgaaggtgaaaaaaggtgttaaaatgcagt60
aatgcttggatgaatgattt3. 3.3. C 3.3.3.3. aatgtaggcacataatttgagaaagtgtgt120
gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtaaaagagggggtgggggaagagagagat180
tgtcactcattacattatttcccttcccagC 3.3.3. C 3.3.3. C 3.tattatagaagcatttcaaa240
tcatgtttcctaagctgtggagcatacgaatgaaagcttaattgtttgtct291
<210>10
<211>336
<212>DNA
<213> 中華鱉(Pelodiscus sinensiS)
<400>10
attattaccgtggtacctaggagccctcgttatagaccaggacccccttatttagatacc60
tccgccttttaatggatttcctgccctaggaatctgccattttagatagatagatagata120
gatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagattccatctca180
ttcactctgtgaggtaactaattcctgctatggaagaaccttccctcccaatacccaaat240
ctgagactgctaccacatcccatcagggtaactccagtgggacacaccagctcttctgtt300
<400>14
cctggctaatagccattgatggatttagtc accatcaatttatctagtcctttattgaac60
cctgttaatgtcttggtcttcacaacatcc tgtggcaaggagttccacagattaattgaa120
ctctatatgaagaaaaacttccttttgttt gttttaaaactactacctattaatttaatt180
tggtcatttggggacccctagttcttatct tagatagatagatagatagatagatagata240
gatagatagatagatagatagatagataga tagaacttgaaattttgtgtcaatatcact300
tttactataactgttaatgacttatatgga gatgctctttcaagtagaattgagtttcaa360
gaaagccccaC371
<210>15
<211>396
<212>DNA
〈213〉中華鱉(Pelodiscus sinensis)
<400>15
gctaccacttagaacatgctgccccaggaa acctaaagtaattaaagtgaggctagagaa60
gcaataatgcagtgaaagaaagaaagaaag aaagaaagaaagaaagaaggaaagaaagaa120
agaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaag aaagaaagaaagaaagaaagaaagaaactg180
tagcagaaaagcaattttttaaaaaagcga gaatataagaaaagtataatttcaggagta240
acatgtttctttatcttgcagctgagtgtg ggtatcccagaatggagtgaatgagtttca300
ccccccaaagacctaatttctgtatttgca aatgggataccatcactcactcatttttta360
gggataccatgctttagctcattcagcttt tggggt39權利要求
中華鱉微衛(wèi)星DNA標記，其特征在于所述的微衛(wèi)星標記編號分別為PSW01、PSW02、PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSW11、PSW12、PSW13、PSW14、PSW15；其核苷酸序列為PSW01ctctctcacc cacatattcc cccatccatc caagaaacat gctgttgttt tgtatgatga60gaatagaaca gattaaaagg agaggattaa ctttcaagga gggtttagct agctatactt120acgggtgata ctttgaaatc atcacaaaca tttacgtcaa tcacatgttc catttaacga180tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagataggta gatagataga240tagatagata gatagataga tagataggta gatagccact attacagcaa atttaaaatg300ctgtataaaa gacaggtatt atataaaaga caggtattat cccagattta tagacacatg360atttgcagga aacaagtata ggatgttaaa atcccaattc agcaaaacac ttaagcacat420gcttaaatca cactgaagtg atcaggattt aagtgctttg ctgaactgtt ta472PSW02tgccaatata gtctcagtag tatagacttg ccctaaaaga ttaaaatggc agatatgagg60tcttctccta gaagcactgt gtgcaaaatt gtacactttc atatgcgcta tgtttgtcaa120tgtcaaaaca aaacaaaaca aaacaaaaca aaacaacaac aacaacaaca aaaacctgct180gtttttccct aagtgagatg ttctaacaac ttccttctag gacaaggtgg aaagtagcaa240ttgctacctc cactagtatt agctgttttt ggtccaattc attacacttt gttcccaaac300accaagaaaa gtgtattgct ctgatagcac ttactgtaga agagttttca gaagagagaa360tccaatgtcc tcaca 375PSW03gctataatgt ttgctaagtt ttcctatttt tccatgtatt ttgcagttag taagtgtttt60aatgaaaatt acaattgctt tgaactggcc attctccttg gggccgtacc ggacgtttca120cttgtatgca ttaatattga catataattg ctagacatag aattgcaaga tatctacaca180tctttcgata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagatttg240tgcatctgtc tgtctgtccc tgagtccatc tattccatct gtctgtctgg gagtccattt300gtttaagaac tcctcctaaa ctgtaagaac aaggaccata caactcgaaa tttctcttgt360cctaactt 368PSW04tgagccaatt tccagatcgc cttgactgat tttcaaatca cctgaccatc tgtttcaaat60ttaagcatcc caaagtgcac aaagtctaaa tagataaggc aagtcttaaa ttatgtacag120agtgatactt taaatgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag180atagatagat agatagatag atagaattcc atccgcaggg ctatcgttaa ctttaaggca240tataactgta tttgtatctg agagaaaaaa tcattgttga gataatatat ctgaagataa300ctcacaaatg aatgcacaaa gtaagatggc agagagaaag tccaagggga ctcactaata360atacttcaca cagaattgtt aagattgtca ttctgagata ttccagctag aattat416PSW05aatgatgcaa agagacaaat taagtgtttg atgcatattt tattcccctt gaacgcactc60tgtctaaaaa taatagtgct attatttttg gacagccact ggcttagtgg ccaactgttt120gattgctaga atgcaagttc ttaagtatag atagatagat agatagatag atagatagat180agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag agttatgtga240ttaaatgcca ttaccattat gcattccctg tttttgtgta atgcctgcat aagattttta300gatggcataa agggaaacac tatgagcaaa atgttcctgt ttgatc 346 PSW06ggttggccac tttaagtgaa gcaggttcag ctcgctgatg ttagaggcaa atgtcccccc60atttggccct gaggagagtc aggatgacac tgaattagag gtagtggaag acagaagata120tagaagggta gctccagaaa agaagtgggg aaaggaggat gtggggaaat gctgaagaaa180gcttcaggca gggaatgaac atccgtagtg gttaccccgg gatgggggta aaaacaacaa240caacaacaac aacaacaaca acaaaacaac ctaggaagct gcttgaaacc ctttggaatg300aagttaaatc ctgggagaag agatatggca tgtgaaagac tctcgttttc ctggaatgga360agatatcctt attggctaac taatatatga aataccacta aggccttgca cccacctgct420ccc 423PSW07cttctccccc gaatcttttc caagccccac acatatcttc tttattactg tcaagtgctg60tccccctctt ttgattccca acaatagatt tggactatcc aagcttccga caagaaggtg120agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat180agatagatag atagatagat agatagatag aggaattact tggggatact tctgtctgct240cacaggacca tggacaaaca ggattatgga ttcgcttcaa cacagagtct aatagggata300atttgtttta ttagtctcac tgcgtcactg ctactac 337PSW08acttttggag aacaatcaaa ccccaaaata ttttgcttta gaaatgtcac cacactacct60atttccccaa gaaggaagac tattgtgcat catggtgcat gcactatgta cagcctgcag120gagagaccag accatgaggc atcatagctg tatttccaaa tcaatagata gatagataga180tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga240tagatagata gatagataga tagatatctt gcttaaaagt tccaagtatt agaggagtgg300actaagaaca ctttccaaga aatgcctcca ctaacacaat aacactgtgc ttcctctcaa360atttcagttt gtcagagaa 379PSW09ctagaaatct agctctgcta tgatgttggt cgaaggtgaa aaaaggtgtt aaaatgcagt60aatgcttgga tgaatgattt ataacaaaat aatgtaggca cataatttga gaaagtgtgt120gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtaaaagagg gggtggggga agagagagat180tgtcactcat tacattattt cccttcccag caaacaaaca tattatagaa gcatttcaaa240tcatgtttcc taagctgtgg agcatacgaa tgaaagctta attgtttgtc t 291PSW10attattaccg tggtacctag gagccctcgt tatagaccag gaccccctta tttagatacc60tccgcctttt aatggatttc ctgccctagg aatctgccat tttagataga tagatagata120gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga ttccatctca180ttcactctgt gaggtaacta attcctgcta tggaagaacc ttccctccca atacccaaat240ctgagactgc taccacatcc catcagggta actccagtgg gacacaccag ctcttctgtt300ttcagcgact gtgaggattt ctctcagcta tgtgca 336PSW11tacaaaaaat cattcaatag taattatggg ataatctgct ccagagaaag tttcttctta60atccttaata ggtagaggtt gtcttattct ctgcagcagg agagtttata tctctttcaa120aactcatttt tggtattgtt tgtttgtagg gatttatttt aaatcctcac tgttatatgt180ccagagtgta gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga240tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata tccaactctc300taagtctaaa ttggttcatt tgtttttagt aaggcttgtg agatc 345PSW12tagggtcctt ctcccatgaa ggatttttat tcttttatct ggttgatttc tcttaacgta60 atccagcaaa ggataccatc accaagcaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca120ctgccttgaa tcaggtgacc tcaaagggtt tgtctacaca gcagggctta tctcgaaata180agcgatgcaa attgaactac atcaattgtg tattatttca aaagagctta tttcgaaata240gggagcgtct acacagcact tatttcaaaa tagagcactc ggcctctgac ttcccttatt300ccttgtacaa gggttacagg agtcagaata agtcgtcctc cagcttgaca gtattttgac360actattt 367PSW13aatttcggaa aagcagacgc atttttttgg catccttgta aaccttgttg tatgaggaag60aagagatgtt ctgaaagagg gttcttttct gacatttggc ctcgtgcaga tgggccagat120gtcggaaaag cctctttcgg aagaaaagca gaaaaagata tgcaaattgc acttcacaat180ttgcgtattt tttaccagct tttctttgca gtgttgacac agcctgagag attgtgaggg240gctcagatag acagacagac agacacagac agacagacaa aaagacagac ggaaagagag300aaagagacaa aaattacaga ggtgtatcta gactacacct ctctgtcgac agagag356PSW14cctggctaat agccattgat ggatttagtc accatcaatt tatctagtcc tttattgaac60cctgttaatg tcttggtctt cacaacatcc tgtggcaagg agttccacag attaattgaa120ctctatatga agaaaaactt ccttttgttt gttttaaaac tactacctat taatttaatt180tggtcatttg gggaccccta gttcttatct tagatagata gatagataga tagatagata240gatagataga tagatagata gatagataga tagaacttga aattttgtgt caatatcact300tttactataa ctgttaatga cttatatgga gatgctcttt caagtagaat tgagtttcaa360gaaagcccca c 371PSW15gctaccactt agaacatgct gccccaggaa acctaaagta attaaagtga ggctagagaa60gcaataatgc agtgaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaagg aaagaaagaa120agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaactg180tagcagaaaa gcaatttttt aaaaaagcga gaatataaga aaagtataat ttcaggagta240acatgtttct ttatcttgca gctgagtgtg ggtatcccag aatggagtga atgagtttca300ccccccaaag acctaatttc tgtatttgca aatgggatac catcactcac tcatttttta360gggataccat gctttagctc attcagcttt tggggt 396。
2.根據(jù)權利要求1所述的中華鱉微衛(wèi)星標記，其特征在于所述的PSW01、PSW02、 PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSW11、PSW12、PSW13、PSW14、PSW15 十五個位點的引物序列為PSffOlFTGTTGTTTTGTATGATGAGAAPSffOlR:ATTTGCTGTAATAGTGGCTPSW02FTGCCAATATAGTCTCAGTAGTPSW02RGAAGGAAGTTGTTAGAACATCPSW03F:GCTAAGTTTTCCTATTTTTCPSW03R:GTTGTATGGTCCTTGTTCTPSW04F:ATCACCTGACCATCTGTTTCPSW04RTTCTCTCTGCCATCTTACTTPSW05FCCTTGAACGCACTCTGTCTAPSW05RTTTTGCTCATAGTGTTTCCCPSW06FTTAGAGGTAGTGGAAGACAGPSW06RTTAGTTAGCCAATAAGGATAPSW07FTTACTGTCAAGTGCTGTCCCPSW07R:AGCGAATCCATAATCCTGTTPSW08FTGTCACCACACTACCTATTTPSW08R:GTGTTCTTAGTCCACTCCTCPSW09FCGAAGGTGAAAAAAGGTGTTPSW09R:ATGTTTGTTTGCTGGGAAGGPSfflOFTAGACCAGGACCCCCTTATTPSfflORTGATGGGATGTGGTAGCAGTPSffllF:GAGGTTGTCTTATTCTCTGCPSffllRTCACAAGCCTTACTAAAAACPSW12FCAAAGGATACCATCACCAAGPSW12R:GAATAAGGGAAGTCAGAGGCPSW13F:ATTTTTTTGGCATCCTTGTAPSW13R:CTCTTTCCGTCTGTCTTTTTPSW14FTAGTCCTTTATTGAACCCTGPSW14RCTTGAAAGAGCATCTCCATAPSW15FTAAAGTGAGGCTAGAGAAGPSW15RAAAAAATGAGTGAGTGATG。
全文摘要
本發(fā)明公開了中華鱉微衛(wèi)星DNA標記，包括中華鱉微衛(wèi)星(CA)n、(AAC)n、(ACAG)n和(GATA)n富集文庫的構建，微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選及測序，得到63個含有微衛(wèi)星重復序列的克隆，確定了15個多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標記PSW01、PSW02、PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSW11、PSW12、PSW13、PSW14、PSW15；本發(fā)明可應用于中華鱉不同地理種群的遺傳多樣性研究以及親權鑒定的研究，重復性好，是一種可靠有效的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK101984055SQ201010528420
公開日2011年3月9日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權日2010年11月2日
發(fā)明者劉羅, 卜興江, 聶劉旺 申請人:安徽師范大學