專利名稱：優(yōu)化密碼子提高外源基因表達(dá)量和萊茵衣藻制氫量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及外源基因表達(dá)和生物制氫技術(shù)，具體地說是一種優(yōu)化密碼子提高外源 基因表達(dá)量和萊茵衣藻制氫量的方法。
背景技術(shù)：
光合生物制氫是未來清潔能源的重要來源之一，包括萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在內(nèi)的許多微型綠藻和藍(lán)藻可以在缺氧的條件下誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氫酶(H2aSe) 基因表達(dá)，將光合作用中產(chǎn)生的H+和e_合成H2，釋放到細(xì)胞外。這項(xiàng)技術(shù)是利用太陽能生 產(chǎn)氫氣的理想模式萊茵衣藻生長速度快，培養(yǎng)成本低，氫酶活性高，是極有開發(fā)潛力的微 藻光合制氫藻種。但是，氫酶對(duì)氧氣極其敏感，很容易受氧氣的抑制而失去活性，而氧氣又 是衣藻光合作用的主要產(chǎn)物，這一對(duì)矛盾限制了衣藻產(chǎn)氫技術(shù)的應(yīng)用。為了提高衣藻光合 產(chǎn)氫的效率，需要盡可能的降低衣藻細(xì)胞內(nèi)的氧氣含量或者提高氫化酶的氧耐受性。豆科植物根瘤中的固氮酶與氫酶有相似的特性，也對(duì)氧氣敏感，但是根瘤中的固 氮酶卻有很高的固氮活性，這與根瘤細(xì)胞中含有大量的豆血紅蛋白leghemoglobin，簡稱 Lb，有著密切的關(guān)系。豆血紅蛋白有兩個(gè)亞基構(gòu)成，一個(gè)是球蛋白亞基，由豆科植物合成；另 一個(gè)是血紅素輔基，由共生的根瘤菌合成，兩個(gè)亞基結(jié)合成為有活性的豆血紅蛋白。豆血紅 蛋白具有與氧氣可逆結(jié)合、降低細(xì)胞內(nèi)氧濃度和調(diào)節(jié)呼吸作用的特性，既能維持根瘤細(xì)胞 內(nèi)較低的氧氣含量，又能保障呼吸作用需氧和固氮需要的能量。中國專利200380107352. 7 和02138702. 8分別公開了利用表達(dá)豆血紅蛋白改變植物貯藏儲(chǔ)備物含量和提高植物抗?jié)?能力。生物發(fā)酵工程的已有技術(shù)中也有應(yīng)用其它血紅蛋白體外重組表達(dá)而使產(chǎn)量提高的報(bào) 導(dǎo)。在植物細(xì)胞內(nèi)，尤其是葉綠體中，存在著血紅素輔基合成的前體，即可以通 過葉綠素合成途徑的原撲啉在根瘤菌(Bradyrhizobium Japonicum)亞鐵螯合酶 (ferrochelatase)催化下合成血紅素輔基(Sangwan 和 0，Brain，1991 ；Santana 等，1998)。 本發(fā)明人曾將大豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)使轉(zhuǎn)基因萊 茵衣藻產(chǎn)氫量提高了 50% (中國發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010107922. 4)；將根瘤菌亞鐵螯合酶 基因hemH與1 基因共同轉(zhuǎn)入萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)使轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻產(chǎn)氫量提高了 4 倍(中國發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010115015. 4)。萊茵衣藻葉綠體基因表達(dá)的密碼子具有明顯的腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)偏向性 (Nakamura et al.，2000)，2002年，F(xiàn)ranklin等在萊茵衣藻葉綠體中成功表達(dá)了密碼子優(yōu) 化的綠色熒光蛋白基因GFP基因，表達(dá)量提高了 80倍。隨后在2003年和2004年Mayfield 等將密碼子優(yōu)化后的報(bào)告基因IuxCt轉(zhuǎn)入萊茵衣藻葉綠體，該基因得到了成功表達(dá)并具有 活性。1991年Goldschmidt-Clermont構(gòu)建的aadA基因表達(dá)原件之所以能用于萊茵衣藻葉 綠體轉(zhuǎn)化篩選的標(biāo)簽是因?yàn)棣圃跇?gòu)建時(shí)考慮了它的密碼子偏向性與衣藻葉綠體中密碼子 的偏向性一致。Franklin和Mayfield 2004年指出萊茵衣藻的核基因組也具有密碼子的偏 向性。2004年，Gustafsson等提出其它的一些生物體包括原核(Dos和flfernisch，2003)和真核生物(Kanaya等，2001)也具有密碼子的偏向性。2005年，Liu等指出在高等植物中也 存在密碼子的偏向性，同年Lavner和Kotlar指出人類基因組也存在密碼子的偏向性。因 此，除了啟動(dòng)子、內(nèi)含子和5’ UTRs和3’ UTRs之外，在外源基因的表達(dá)中密碼子偏向性也是 一個(gè)重要的調(diào)控因子。因此發(fā)明一種利用密碼偏向性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并將優(yōu)化后的hemHc基因和Ibac 基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的葉綠體內(nèi)表達(dá)，提高豆血紅蛋白基因表達(dá)量和萊茵衣藻產(chǎn)氫量的方法 是十分重要的。本發(fā)明首次對(duì)豆血紅蛋白亞鐵螯合酶基因hemH和大豆血紅蛋白球蛋白亞基基因 Iba按照衣藻葉綠體基因表達(dá)的A、U密碼偏向性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并將優(yōu)化后的hemHc基 因和Ibac基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的葉綠體內(nèi)表達(dá)，結(jié)果使重組蛋白hemH和Lba的表達(dá)量提高 了 6. 8倍，使轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的產(chǎn)氫量進(jìn)一步提高了 22%。本發(fā)明方法解決了外源基因在 萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)量低的技術(shù)難題，具有實(shí)用性，而且為進(jìn)一步利用豆血紅蛋白特性 提高衣藻產(chǎn)氫的生物工程技術(shù)提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。隨著生物制氫技術(shù)的發(fā)展，本發(fā)明將 顯現(xiàn)出越來越大的實(shí)用性和重要性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)豆血紅蛋白基因hemH和Iba的密碼子偏向性進(jìn)行 優(yōu)化的方法，使之更適合于在萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)，提高外源基因在萊茵衣藻葉綠體中 表達(dá)量和提高萊茵衣藻及其它微藻制氫產(chǎn)量的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種優(yōu)化密碼子提高外源基因表達(dá)量和萊茵衣藻制氫量的方法，步驟如下(1)萊茵衣藻培養(yǎng)A、選細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849 ；B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種(a)正常培養(yǎng)條件溫度25 士 1°C ；日光燈光照強(qiáng)度100 200微摩爾光量子/平 方米·秒；50 100ml TAP培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，初始pH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速100 130rpm，每 5 6天接種繼代培養(yǎng)；(b)固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1. 5% ；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線 方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；C、產(chǎn)氫培養(yǎng)條件在缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行，把TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅 和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對(duì)數(shù)期后期的萊茵 衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫培養(yǎng)基洗3次，懸浮在缺硫培養(yǎng)基內(nèi)，分 別裝在培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶上方留IOml的空間，橡皮塞密閉；黑暗條件下培養(yǎng)M小時(shí)，然后放 在連續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50 100微摩爾光量子/平方米 秒，溫度25士 1°C ；每24 小時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測一次；D、氣相色譜儀測定氫氣和氧氣含量分子篩5X1/8，柱長2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測 器TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50°C，進(jìn)樣溫度200°C，熱導(dǎo)檢測溫度300°C ；(2)豆血紅蛋白hemHc基因和Ibac基因的密碼子優(yōu)化和合成A、從GenBank中調(diào)取序列號(hào)為M9M27的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列號(hào)為V00453的大豆1 基因序列；B、將豆血紅蛋白hemH基因和Iba基因的密碼子對(duì)應(yīng)的DNA核苷酸序列中第三位 堿基對(duì)應(yīng)的DNA核苷酸序列中的鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)改為腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)； 分別在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性內(nèi)切酶McII的酶切位點(diǎn)序列；在Ibac基因 的5’端和3’端加上限制性內(nèi)切酶Sma I和Mc I的酶切位點(diǎn)序列；C、將優(yōu)化后的hemHc基因和Ibac基因的核苷酸序列以及添加的相應(yīng)的限制性內(nèi) 切酶酶切位點(diǎn)核苷酸序列進(jìn)行核苷酸序列合成；(3) hemHc基因和Ibac基因的擴(kuò)增A、以步驟O) C合成的hemHc基因和Ibac基因核苷酸序列為模板，進(jìn)行聚合酶鏈 式反應(yīng)，分別擴(kuò)增hemHc基因和Ibac基因；反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變 性 30s，hemHc 基因 58°C, Ibac 基因 59°C;退火 30s，72°C延伸 1. 5min ；30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 15min ；反應(yīng)產(chǎn)物分別純化回收，用于測序鑒定和下一步萊茵衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建；B、PCR擴(kuò)增、測序鑒定以及hemHc基因和Ibac基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測的特異性引物hemHc基因的特異性引物為hemHc-Pl :權(quán)利要求
1. 一種優(yōu)化密碼子提高外源基因表達(dá)量和萊茵衣藻制氫量的方法，步驟如下(1)萊茵衣藻培養(yǎng)A、選細(xì)胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種(a)正常培養(yǎng)條件溫度25士1°C ；日光燈光照強(qiáng)度100 200微摩爾光量子/平方 米 秒；50 100ml TAP培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，初始pH7. 2，水平搖床轉(zhuǎn)速100 130rpm，每5 6天接種繼代培養(yǎng)；(b)固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1.5% ；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法 接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；C、產(chǎn)氫培養(yǎng)條件在缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行，把TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫 酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對(duì)數(shù)期后期的萊茵衣藻 3000rpm室溫離心5min，收集藻細(xì)胞并用缺硫培養(yǎng)基洗3次，懸浮在缺硫培養(yǎng)基內(nèi)，分別裝 在培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶上方留IOml的空間，橡皮塞密閉；黑暗條件下培養(yǎng)M小時(shí)，然后放在連 續(xù)光照件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度50 100微摩爾光量子/平方米·秒，溫度25士 1°C ；每M小 時(shí)進(jìn)行氣體成分和含量檢測一次；D、氣相色譜儀測定氫氣和氧氣含量分子篩5X1/8，柱長2m，內(nèi)徑3mm，熱導(dǎo)檢測器 TCD，以氬氣作為載氣，柱溫50°C，進(jìn)樣溫度200°C，熱導(dǎo)檢測溫度300°C ；(2)豆血紅蛋白hemHc基因和Ibac基因的密碼子優(yōu)化和合成A、從GenBank中調(diào)取序列號(hào)為M9M27的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列號(hào)為 V00453的大豆Iba基因序列；B、將豆血紅蛋白hemH基因和Iki基因的密碼子對(duì)應(yīng)的DNA核苷酸序列中第三位堿基 對(duì)應(yīng)的DNA核苷酸序列中的鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)改為腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)；將優(yōu) 化后的基因命名為hemHc和Ibac ；分別在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性內(nèi)切酶 SacII的酶切位點(diǎn)序列；在Ibac基因的5’端和3’端加上限制性內(nèi)切酶Sma I和Mc I的 酶切位點(diǎn)序列；C、將優(yōu)化后的hemHc基因和Ibac基因的核苷酸序列以及添加的相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶 酶切位點(diǎn)核苷酸序列進(jìn)行核苷酸序列合成；(3)hemHc基因和Ibac基因的擴(kuò)增A、以步驟O)C合成的hemHc基因和Ibac基因核苷酸序列為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)，分別擴(kuò)增hemHc基因和Ibac基因；反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性 30s, hemHc 基因 58°C，Ibac 基因 59°C ；退火 30s，72°C延伸 1. 5min ；30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 15min ；反應(yīng)產(chǎn)物分別純化回收，用于測序鑒定和下一步萊茵衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建；B、PCR擴(kuò)增、測序鑒定以及hemHc基因和Ibac基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測的特異性引物hemHc基因的特異性引物為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化密碼子提高外源基因表達(dá)量和萊茵衣藻制氫量的方法， 其特征在于TAP培養(yǎng)基為三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及外源基因表達(dá)和生物制氫技術(shù)，優(yōu)化密碼子提高外源基因表達(dá)量和萊茵衣藻制氫量的方法?，F(xiàn)有技術(shù)外源豆血紅蛋白基因hemH和lba在萊茵衣藻葉綠體中的表達(dá)效率低，影響萊茵衣藻產(chǎn)氫量的提高。本發(fā)明公開了一種對(duì)豆血紅蛋白基因hemH和lba的密碼子偏向性分別優(yōu)化的方法，并將密碼子優(yōu)化后的hemHc和lbac基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是顯著提高了外源重組蛋白的表達(dá)量，外源豆血紅蛋白hemH和Lba在萊茵衣藻葉綠體中的表達(dá)量提高6.8倍；萊茵衣藻產(chǎn)氫量比轉(zhuǎn)未優(yōu)化密碼子的hemH和lba基因的萊茵衣藻提高22％；本發(fā)明適用于具有密碼偏向性的更多物種的外源基因表達(dá)調(diào)控。
文檔編號(hào)C12R1/89GK102146344SQ20101052872
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者吳雙秀, 王全喜, 許麗麗, 閻光宇, 黃瑞 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)