專利名稱：一種人的Smac基因真核表達載體pcDNA3.1-Smac的構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人的Smac基因真核表達載體pcDNA3. I-Smac的構建方法。
背景技術：
肺癌居全球惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率之首。在我國，肺癌已代替肝癌成為惡性腫瘤最主要的死亡原因，占據惡性腫瘤死亡的22. 7%，且發(fā)病率和死亡率還在逐年上升。目前， 約80%的肺癌患者就診時已錯過最佳手術機會，而采用常規(guī)的化療藥物治療不能有效控制肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此，有必要探索新基因靶點有效治療肺癌，以提高肺癌患者的預后。伴隨著分子生物醫(yī)學技術的迅速發(fā)展，對癌癥發(fā)生源于細胞凋亡傳導通路異常的觀點已達成共識，由此而產生的基因治療方法日趨成為治療癌癥的重要手段之一。近年石if 究發(fā)現(xiàn):Smac (the second mitochondrial-derivedactivator of caspase)基因是通過線粒體途徑誘導細胞凋亡的重要調控基因之一。它在人體睪丸、心臟、 肝臟、脾臟、腎臟、卵巢和前列腺等多個正常組織中表達較高。而在胃癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、橫紋肌肉瘤，平滑肌肉瘤等惡性腫瘤組織中的表達均較低，提示其可能成為一種新的惡性腫瘤的抑制基因。因此，該基因具有重要的研究價值。線粒體蛋白 Smac (second mitochondria-derived activator ofcaspase)又禾爾 DIABLO (direct IAP binding protein with low PI)是 2000 年由 Wang[1]和 Verhagen[2] 同時發(fā)現(xiàn)的一種蛋白。在宮頸癌的研究中，發(fā)現(xiàn)它在凋亡信號刺激作用下，從線粒體釋放到細胞質，并與IAP結合，抑制其抗凋亡活性，從而產生促進宮頸癌細胞凋亡的作用。為了研究Smac基因對肺癌細胞的促凋亡作用，首先需要研究Smac基因在肺癌細胞中的表達，此時就需要一種Smac基因真核表達載體的構建方法。參考文獻[l]Du C, Fang Μ, Li Y, et. al. Smac, a mitochondrial proteinthat promotes cytochrome c-dependent caspase activation byeliminating IAP inhibition[J]. Cell 2000,102(1) :33-42.[2]Verhagen AM, Ekert PG, Pakusch M， et al.Identfiicationof DIABLO, amammalian ρ rotein that promotes apoptosis bybinding to and antagonizing IAP proteins[J], Cell 2000,102(1) :43-53.

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了一種構建人的Smac基因真核表達載體pcDNA3. I-Smac的方法，將通過本方法得到的表達載體轉染至肺癌A549細胞，驗證Smac基因在轉染后肺癌A549細胞中的表達，為進一步研究Smac基因對肺癌細胞的促凋亡作用奠定基礎。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種人的Smac基因真核表達載體pcDNA3. I-Smac的構建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)從前列腺癌患者去勢手術中獲取正常睪丸組織，采用TRIzoI法從人正常睪丸組織中提取總RNA ；(2)取0. 1 μ g步驟⑴制得的RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，以此為模板， 用高保真酶進行PCR擴增Smac基因，擴增產物電泳后，回收目的片段；(3)用BamH I.Hindlll分別酶切pcDNA3. 1㈠和步驟(2)制得的目的基因片段， DNA凝膠回收試劑盒提取酶切片段；(4)將步驟C3)制得的酶切片段通過連接酶連接，得到Smac基因真核表達載體 pcDNA3. I-Smac ；(5)制備大腸桿菌感受態(tài)細胞，將步驟(4)制得的載體轉化、擴增并提取質粒。所述步驟(2)擴增Smac基因時，反應體系為50 μ L :5XbufferlO μ L，2. 5mM dNTP 4 μ L，上下游引物各 1 μ L，5U/ μ L，高保真酶 0. 5 μ L，ddH20 31. 5 μ L，模板 DNA 2yL( < 200ng)，擴增條件:98°C 10s，55°C 15s，72°C lmin,35個循環(huán)，所述上游引物序列為5' -CGGGATCCCACAATGGCGGCTCTGA-3‘，下游引物序列為5' -CCCAAGCTTGGCCCTCAATC CTCACGC-3‘。所述步驟(3)中，在引物5'端分別加入BamHI、HindIII，其酶切位點位于引物下劃線內部分上游引物5' -CGGGATCCCACAATGGCGGCTCTGA-3‘，下游引物5' -CCCAAGCTT GGCCCTCAATCCTCACGC-3‘。


圖1為Smac基因RT-PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，M為DNAmarker，1為Smac PCR擴增產物。Smac基因的RT-PCR擴增以總RNA為模板反轉錄，以Smac基因的上下游引物進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析得到746bp的條帶，與預期目的片段大小一致。圖2為重組質粒PCDNA3. I-Smac酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，M為DNA marker, 1 為 BamH I 單切 pcDNA3. I-Smac 質粒，2 為 BamH I、HindIII 雙切 pcDNA3. I-Smac 質粒，3 為 HindIII 單切 pcDNA3. I-Smac 質粒。重組質粒 pcDNA3. I-Smac 經 BamH I、HindIII 雙酶切后，出現(xiàn)2條片段，約750bp和6000bp，酶切片段大小與預期值相符。圖3為Smac基因測序結果圖。圖4為Smac基因比對結果圖，BLAST比對結果和GenBank公布的Smac基因序列
完全一致。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步描述，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照料常規(guī)條件，例如基因的RT-PCR擴增或試劑盒按照制造廠商所建議的條件使用。一、實驗材料1、主要試劑(I)RT-PCR 相關試劑
Trizol美國 Invitrogen逆轉錄試劑盒日本TaKaRa高保真PCR試劑盒日本TaKaRa瓊脂糖西班牙biowest溴化乙錠(EB)北京百泰克膠回收試劑盒日本TaKaRaBamHI 及 HindIII 內切酶日本 TaKaRaSolutionl 連接酶日本 TaKaRa(2)質粒擴增相關試劑pcDNA3. 1 (-)美國 Invitrogen大腸桿菌TOPlO實驗室保存蛋白胨美國Gibco瓊脂粉美國Gibco酵母提取物美國Gibco質粒小提試劑盒北京天根去內毒素質粒小提試劑盒美國Omega Biotek(3)細胞培養(yǎng)及轉染相關試劑A549細胞實驗室保存1640 培養(yǎng)基Hyclone胎牛血清美國Gibco小牛血清美國Gibco胰蛋白酶美國Sartorius月旨質體 lipofectamine2000美國 InvitrogenDMSO上海普飛2、主要儀器(1)實驗室提供設備微波爐美的258水浴鍋日本諾蘭公司3751電動攪拌器日本Nichiryo低溫冰箱(_20°C 4°C)德國 SIMENS精密微量可調移液器日本Nichiryo電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)公司倒置顯微鏡Olympus BH-2臺式高速離心機北京醫(yī)用離心機廠電熱恒溫干燥箱天津泰斯特儀器公司電熱恒溫箱天津泰斯特儀器公司PCR電泳儀美國BioRad臺式高速離心機上海躍進醫(yī)療器械廠低溫離心機美國Bekman
細菌培養(yǎng)箱美國Hiermo細胞培養(yǎng)超凈工作臺蘇州凈化細菌培養(yǎng)工作臺蘇州凈化顯微鏡日本Nikon凝膠分析系統(tǒng)美國BioRad恒溫細菌培養(yǎng)搖床上海醫(yī)用分析儀器廠細胞培養(yǎng)瓶實驗室酒精燈實驗室(2)自購設備濾過網及碾磨棒(一次性)，EP 管 QOO μ 1，1500 μ 1)—DEPC水處理后高溫高壓蒸汽消毒30分鐘裝盒備用大中小槍頭若干—DEPC水處理后高溫高壓蒸汽消毒30分鐘裝盒備用錐形瓶，培養(yǎng)皿，涂布器——高溫高壓蒸汽消毒30分鐘裝盒備用凍存管，血球計數板，6孔板，9孔板標記筆一支和信息記錄單若干(3)實驗液體配制A、DEPC 水DEPC 1ml，雙蒸水1000ml，搖床搖過夜，裝入瓶中高溫高壓處理。B、1640 培養(yǎng)液(1000ml)一包1640培養(yǎng)液粉(1000ml)，NaHCO3L 2g，溶于IOOOml純水，磁力攪拌至液體清亮無沉淀。過濾除菌并分裝保存在4°C冰箱。C、0. 25%胰酶(1000ml)0. 25g胰酶充分溶解于100ml PBS液，磁棒攪拌0. 5h，過濾除菌，_20°C分裝保存。D、Hank，s 平衡鹽緩沖液(1000ml)CaC120. Hg，KCIO. 4g, KH2P040. 06g, MgCl2 · 6H20 0. lg，加去離子水定容至 1 OOOml，高壓滅菌，4 0C保存。E、磷酸鹽緩沖液(PBS，10x，10(X)ml)1包PBS粉(1000ml規(guī)格)溶于IOOOml純水中，磁力攪拌至液體清亮無沉淀，分裝至250ml玻璃瓶中，高溫高壓滅菌，4°C下可保存一周，需經常高溫高壓滅菌。F、5 X TBE (1000ml)Tris堿Mg，硼酸27. 5g，0. 5M EDTA20ml，加去離子水定容1000ml，至常溫保存，使用時稀釋10倍。G、瓊脂糖凝膠(1% )瓊脂糖0. 5g，IXTBE 50ml，微波爐高溫溶解lmin，冷卻至50_60°C后加入EB 2. 5 μ 1，導入制膠板，插入梳子。H、瓊脂糖凝膠)瓊脂糖lg，1 X TBE 50ml，微波爐高溫溶解lmin，冷卻至50-60 °C后加入EB2. 5 μ 1，導入制膠板，插入梳子。I、IM CaCl2(20ml)CaC121.08g，純水100ml，磁力攪拌至液體清亮無沉淀，用濾器過濾除菌，保存在-20°C冰箱。J、LB (Luria-Bertain)液體培養(yǎng)基(IOOml)氯化鈉lg，蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，加純水至1L，分裝至250ml玻璃瓶或搖菌瓶中，高溫高壓滅菌，保存于4 °C冰箱。K、LB (Luria-Bertain)固體培養(yǎng)基(1000ml)氯化鈉lg，蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，瓊脂粉1.6g，加純水至1L，分裝至250ml 玻璃瓶或搖菌瓶中，高溫高壓滅菌，保存于4°C冰箱或鋪板。二、實驗步驟1、從前列腺癌患者去勢手術中獲取正常睪丸組織，采用TRIzoI法，從人正常睪丸組織中提取總RNA。(1)從液氮中取出組織并切取50mg，加入Iml Trizol液研磨。(2)研磨液室溫放置5分鐘，然后加入0. 2ml氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。(3)取上層水相于一新的離心管，加0. 5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心 10分鐘。(4)棄去上清液，加入Iml 75%乙醇，渦旋混勻，4°C下7500g離心5分鐘。(5)小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，加入50μ 1無RNase的水， 用槍頭吸打幾次，55 60°C放置10分鐘使RNA溶解。2、用逆轉錄試劑盒逆轉錄RNA，用高保真酶進行PCR擴增Smac基因，擴增產物電泳后，回收目的片段。(1)用Takara逆轉錄試劑盒逆轉錄反應；逆轉錄反應體系如下表
權利要求
1.一種人的Smac基因真核表達載體pcDNA3. I-Smac的構建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)從前列腺癌患者去勢手術中獲取正常睪丸組織，采用TRIzoI法從人正常睪丸組織中提取總RNA ；(2)取0.1 μ g步驟(1)制得的RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，以此為模板，用高保真酶進行PCR擴增Smac基因，擴增產物電泳后，回收目的片段；(3)用BamHI、HindIII分別酶切pcDNA3. 1㈠和步驟(2)制得的目的基因片段，DNA 凝膠回收試劑盒提取酶切片段；(4)將步驟(3)制得的酶切片段通過連接酶連接，得到Smac基因真核表達載體 pcDNA3. I-Smac ；(5)制備大腸桿菌感受態(tài)細胞，將步驟(4)制得的載體轉化、擴增并提取質粒。
2.根據權利要求1所述的一種人的Smac基因真核表達載體pcDNA3.I-Smac的構建方法，其特征在于步驟⑵擴增Smac基因時，反應體系為50μ L ^XbufferlOyL, 2. 5mM dNTP 4 μ L，上下游引物各 1 μ L, 5U/ μ L,高保真酶 0. 5 μ L, ddH20 31. 5 μ L,模板 DNA 2yL( < 200ng)，擴增條件:98°C 10s，55°C 15s，72°C lmin,35個循環(huán)，所述上游引物序列為5' -CGGGATCCCACAATGGCGGCTCTGA-3‘，下游引物序列為5' -CCCAAGCTTGGCCCTCAATC CTCACGC-3‘。
3.根據權利要求1所述的一種人的Smac基因真核表達載體pcDNA3.I-Smac的構建方法，其特征在于步驟(3)中，在引物5'端分別加入BamHI、HindIII，其酶切位點位于引物下劃線內部分上游引物5' -CGGGATCCCACAATGGCGGCTCTGA-3‘，下游引物5' -CCCMGC TTGGCCCTCAATCCTCACGC-3‘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人的Smac基因真核表達載體pcDNA3.1-Smac的構建方法，它采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術，從人體正常睪丸組織中擴增到Smac全長基因片段，通過BamHI、HindIII雙酶切Smac基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切過的目的基因，制備空質粒pcDNA3.1轉化并擴增質粒，提取質粒后運用BamHI、HindIII雙酶切空質粒pcDNA3.1，電泳并回收酶切產物，與酶切后的目的基因Smac連接，構建重組真核表達載體pcDNA3.1-Smac。通過本方法得到的表達載體測序成功后，轉染至肺癌A549細胞，驗證Smac基因在轉染后肺癌A549細胞中的表達，為進一步研究Smac基因對肺癌細胞的促凋亡作用奠定基礎。
文檔編號C12N15/66GK102453726SQ20101052930
公開日2012年5月16日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權日2010年11月1日
發(fā)明者任宏, 楊成成, 秦思達 申請人:任宏, 秦思達