專利名稱：一種具有防腐功能的紫紅曲菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種紫紅曲菌。
背景技術(shù)：
在肉制品加工領(lǐng)域，亞硝酸鈉是應用最為廣泛的食品添加劑，其具有防腐劑及增 色劑的作用，廣泛用于熟肉類、灌腸類及罐頭等動物性食品。但是亞硝酸鈉具有毒性，它能 將血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，使其失去運輸氧的能力而引起組織缺氧性 損害，人體攝入0. 2 0. 5g即可引起食物中毒，3g即可致死。并且，亞硝酸鈉在一定條件下 會生成亞硝酸胺，而亞硝酸胺則是致癌物質(zhì)。因此，食品加工過程中亞硝酸鈉的用量及殘留 量受到嚴格控制。為了提高肉制品的品質(zhì)，人們還會添加一些輔料及其它添加劑，這些都可 能影響產(chǎn)品的顏色。隨著人們健康意識的不斷提高，人們尋求天然、安全與高效的防腐劑及 增色劑的愿望也越來越強烈，同時這也是食品添加劑領(lǐng)域所面臨的十分重要和急待解決的 問題。紫紅曲菌(Monascus purpureas)早在《本草綱目》中對其藥用保健作用就有記 載。在現(xiàn)代食品加工領(lǐng)域中，國內(nèi)外對紅曲菌的研究與應用大多集中在傳統(tǒng)的釀酒、制醋與 著色劑領(lǐng)域。紅曲菌是目前世界上唯一生產(chǎn)食用色素的微生物，紅曲色素即是紅曲菌在生 長代謝過程中產(chǎn)生的紅色天然色素。利用紫紅曲菌(Monascus purpureas)經(jīng)液態(tài)深層發(fā) 酵提取精致而成的紅曲是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑，紅曲中含 有糖化酶、蛋白酶，最常用于生產(chǎn)紅豆腐乳、含有少量降膽固醇的紅曲米粉及其他保健食品 等。目前，將紫紅曲菌用于食品著色已經(jīng)得到了廣泛認可，也是其主要應用方向。但其抑菌 防腐作用卻少有報道，這主要是因為紫紅曲菌雖有抑菌功能，但抑菌效果較弱。由此可見， 如果能夠獲得一株抑菌效果好的紫紅曲菌，應用到傳統(tǒng)肉制品等相關(guān)食品加工中，進而在 減少亞硝酸鈉的用量的同時，起到著色劑和防腐劑雙重作用，將成為食品添加劑領(lǐng)域的一 項重大突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫紅曲菌菌株，其在保持了原有著色功能的同時，具有 良好的抑菌防腐功能，對食品中常見的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及酵母菌均有抑制效果，同 時具有純天然、安全性高、對人體沒有危害的優(yōu)點。本發(fā)明為生物防腐劑在食品防腐領(lǐng)域中 的應用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明具有防腐功能的紫紅曲菌為紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)， 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4174。本發(fā)明紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)屬于子囊菌門(Ascomycota) 真子囊菌綱(Euascomecetes)散子囊菌目(Eurotiales)紅曲菌科(Monascaceae)紅曲菌 屬(Monascus)，通過對食品中常見的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及酵母菌進行抑菌性試驗，結(jié) 果表明紫紅曲菌W5S7對上述幾種菌均有明顯的抑制作用。
本發(fā)明紫紅曲菌W5S7是從克東腐乳中分離、純化后，經(jīng)微波輻照誘變技術(shù)進行誘 變篩選得到。本發(fā)明紫紅曲菌W5S7在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上菌落生長較慢，25°C紫外 照射黑暗培養(yǎng)7天菌落直徑18 20mm，黃褐色，有皺褶，表面叢卷毛狀，氣生菌絲少量菌 落背面黃褐色，無水溶性色素。菌絲光滑，多分枝，具分隔，寬2. 5 5.0 μ m，有脂滴。無性 孢子大量生產(chǎn)，近球形，基部平截，壁光滑或略粗糙，5. 5 9. 0 μ m，生于非特化的側(cè)生小梗 或菌絲頂端。閉囊殼大量形成，白色至黃褐色，單生于類似菌絲的短柄上，直徑22 50 μ m, 子囊早期消解，子囊孢子卵圓形、近球形，壁光滑，4. 4-5. 8X4. 2-4. 7 μ m。本發(fā)明紫紅曲菌 W5S7可在PDA培養(yǎng)基和查氏合成培養(yǎng)基上可以很好的生長和產(chǎn)孢子，其中最適培養(yǎng)基為 PDA培養(yǎng)基。將本發(fā)明紫紅曲菌W5S7的發(fā)酵液以5000r/min的速度離心20min，保留發(fā)酵上清 液，將沉淀與95%乙醇混合，在超聲波振蕩器頻率為IOkHz時提取60min，再將提取液離心 分離，重復三次；將乙醇提取液與發(fā)酵上清液合并，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在轉(zhuǎn)數(shù)80r/min、蒸 發(fā)溫度60°C的條件下濃縮至原體積1/4，將濃縮液置于80°C鼓風干燥箱中，干燥至恒重，研 磨成粉末，即制得紫紅曲菌W5S7粉劑。本發(fā)明制成的紫紅曲菌W5S7粉劑具有制作簡單、性 質(zhì)穩(wěn)定、易于保存、成本低廉的優(yōu)點。本發(fā)明的紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)屬于紅曲菌屬(Monascus)， 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號中科院微生物研究所，保藏日期為2010年9月16日，保藏號為CGMCC No.4174。


圖1為本發(fā)明紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)菌株在固體培養(yǎng)基上的 菌落形態(tài)圖。圖2為本發(fā)明紫紅曲菌W5S7 (Monascuspurpureus W5S7)菌株的分生孢子形態(tài)圖。圖3為本發(fā)明紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)菌株的菌絲與分生孢子 形態(tài)圖。圖4為具體實施方式
一中紫紅曲菌W5S7防腐劑對枯草芽胞桿菌的抑菌實驗結(jié)果 圖。圖5為具體實施方式
一中紫紅曲菌W5S7防腐劑對酵母菌的抑菌實驗結(jié)果圖。圖6為具體實施方式
一中紫紅曲菌W5S7防腐劑對大腸桿菌的抑菌實驗結(jié)果圖。圖7為具體實施方式
一中紫紅曲菌W5S7防腐劑對白色葡萄球菌的抑菌實驗結(jié)果 圖。圖8為用不同濃度紫紅曲菌W5S7防腐劑水溶液處理后的熟五花肉。圖9為具體實施方式
一中紫紅曲霉菌W5S7與Genbank中收錄的相近菌株所構(gòu)建 的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖10為具體實施方式
一中紫紅曲霉菌W5S7與現(xiàn)有相近似菌株的基因比對結(jié)果。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的具有防腐功能的紫紅曲菌為紫紅曲菌W5S7 (Monascuspurpureus W5S7)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏號為CGMCC No. 4174。本實施方式的紫紅曲菌W5S7是從克東腐乳中分離、純化后，經(jīng)微波輻照誘變技術(shù) 進行誘變篩選得到。具體步驟如下(一)菌種的分離純化用接種針挑取小塊腐乳外皮， 在查氏合成培養(yǎng)基上進行多次劃線分離，28 30°C恒溫培養(yǎng)5 6d，觀察菌落生長，將紅色 或紫色的菌落作為初篩菌落；將初篩菌落接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在28 30°C恒溫純化 培養(yǎng)；(二)菌種的微波誘變及選育將純化后的菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫 培養(yǎng)7d，用無菌生理鹽水將孢子洗滌下來，倒入裝有已滅菌玻璃珠的三角瓶中，震蕩將孢子 打散，濾去菌絲體，得到的孢子懸液，并用無菌水調(diào)整孢子濃度IO5個/mL ；將IOmL孢子懸液 移入無菌試管內(nèi)，并將試管置于微波裝置中，微波頻率2450MHz，輻照功率100 800W (間隔 100W)；輻照時間10 150S(間隔IOs)的條件下對孢子懸液進行輻照。對輻照后孢子懸液 進行倍比稀釋，涂布于PDA培養(yǎng)基上，于30°C恒溫培養(yǎng)3d，記錄總菌落數(shù)和存活菌落數(shù)，計 算致死率和突變率，確定最佳誘變條件為微波功率500W，輻照時間70s ；(三)初篩將輻 照后孢子懸液涂布于PDA培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)，7 IOd后觀察菌落形態(tài)差異，選取顏 色變化較大的菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)7d,用無菌水洗滌孢子，分別制 得孢子懸液，進行復篩備用；(四)復篩分別將初篩到的紅曲霉菌孢子懸液吸取10mL，接 種于150mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)數(shù)200r/min的條件培養(yǎng)14d，根據(jù) 《GB4926-2008食品添加劑紅曲米粉》國標中色價的測定方法一分光光度法對發(fā)酵液進行 檢測，在波長為505nm處，測得發(fā)酵液吸光度值最大的即為抑菌物質(zhì)產(chǎn)量最高菌株，選定為 紫紅曲菌W5S7菌株。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米粉60，黃豆粉5，葡萄糖3，NaN034， 酵母粉 5，ZnSO4O. 2，MgSO4I, K2HP035。將本發(fā)明紫紅曲菌W5S7的孢子濃度為IO5的菌懸液按體積比5%接種于液體發(fā) 酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 30°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180r/min，培養(yǎng)基初始pH4. 5，培養(yǎng)14d后得到 液態(tài)發(fā)酵液。將發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心20min，保留上清液，將沉淀與95%乙醇 混合，在超聲波振蕩器頻率為IOkHz提取60min，再將提取液離心分離，重復三次。將發(fā)酵 上清液與乙醇提取液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中轉(zhuǎn)數(shù)80r/min，蒸發(fā)溫度60°C時，濃縮至原體積 1/4，將濃縮液置于80°C鼓風干燥箱中，干燥至恒重，研磨成粉末，即制成紫紅曲菌W5S7防 腐劑粉劑。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米粉60，黃豆粉5，葡萄糖3，NaN034，酵母粉5， ZnSO4O. 2，MgSO4I, K2HP035。本發(fā)明對紫紅曲菌W5S7防腐劑粉劑進行了抑菌性試驗，試驗選取大腸桿菌、白 色葡萄球菌、枯草芽孢、霉菌、酵母菌作為指示菌。用移液管分別吸取預先培養(yǎng)的濃度均 為IO5 IO6CfuAiL的大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、白色葡萄球菌、酵母菌及青霉菌的菌液各 0. 5mL，分別均勻涂布的在平板培養(yǎng)基上，將已滅菌的中性濾紙片(直徑為6mm)貼在涂布菌 液的平板培養(yǎng)基上。其中，大腸桿菌、枯草芽胞桿菌及白色葡萄球菌采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基； 青霉菌采用PDA培養(yǎng)基；酵母菌采用麥芽汁培養(yǎng)基。取紫紅曲菌W5S7防腐劑粉劑2g溶于 IOOmL 95%乙醇溶液中，用微量進樣器取紫紅曲菌W5S7防腐劑乙醇溶液10 μ L滴加到濾紙 片上，同時以滴加95%乙醇的中性濾紙片做空白對照，細菌37°C培養(yǎng)24h，酵母菌28°C培養(yǎng) 24h，青霉菌28°C培養(yǎng)48h，測量抑菌圈直徑大小并計算抑菌率，試驗結(jié)果如表1所示。其中 抑菌率的計算公式為
抑菌率=(抑菌圈直徑-濾紙片直徑)/濾紙片直徑X 100%表1紫紅曲菌W5S7防腐劑對指示菌的抑菌效果
權(quán)利要求
一種具有防腐功能的紫紅曲菌，其為紫紅曲菌W5S7(Monascus purpureus W5S7)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4174。
全文摘要
一種具有防腐功能的紫紅曲菌。屬于微生物領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種紫紅曲菌菌株，其在保持了原有著色功能的同時，具有良好的抑菌防腐功能，對食品中常見的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及酵母菌均有抑制效果。本發(fā)明具有防腐功能的紫紅曲菌為紫紅曲菌W5S7(MonascuspurpureusW5S7)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.4174。本發(fā)明為生物防腐劑在食品防腐領(lǐng)域中的應用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/14GK101988037SQ20101052997
公開日2011年3月23日 申請日期2010年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月3日
發(fā)明者徐偉 申請人:哈爾濱商業(yè)大學