專利名稱：一種醋用復合酶制劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程微生物發(fā)酵領域，涉及釀醋工藝用的酶制劑，具體涉及一種 醋用復合酶制劑的制備方法。
背景技術：
大曲是釀造業(yè)生產(chǎn)的動力，在釀造過程中起著重要的糖化、發(fā)酵、生香作用，直接 影響食醋的質(zhì)量、產(chǎn)量和風格。制曲是山西老陳醋生產(chǎn)過程中的關鍵階段之一，制曲階段的 變化主要是依靠微生物分泌大量的酶，如蛋白酶、淀粉酶、肽酶、纖維素酶等，并利用這些酶 分解大分子物質(zhì)，如蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為氨基酸和多肽，淀粉酶將淀粉分解為單糖等。大 曲品質(zhì)是影響食醋內(nèi)在品質(zhì)的重要物質(zhì)基礎。多年來的釀醋實踐總結出“曲為醅之根，良曲 出佳釀”的精辟論斷，同時反映了大曲內(nèi)在品質(zhì)與食醋內(nèi)在品質(zhì)存在極為密切的關系。由 于其開放型的發(fā)酵工藝、自然接種、微生物及酶的多樣性，融有種類繁多的微生物酶系和紛 繁復雜的微生物菌系，成為傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵釀醋的重要物質(zhì)保障。制醋所用大曲，都是按照傳 統(tǒng)工藝，屬于自然網(wǎng)絡微生物，不進行人為添加種曲，環(huán)境因素對其影響較為顯著。一方面， 生產(chǎn)企業(yè)所處的自然地域條件(地理、氣候、土壤、水質(zhì))是不以人的意志為轉移的根本條 件，它直接制約著大曲微生物的繁衍棲息；另一方面，大曲、貯存等基礎，更是制約食醋內(nèi)在 品質(zhì)的具體生產(chǎn)條件；此外，我國地域遼闊，環(huán)境、氣候千差萬別，生產(chǎn)的大曲質(zhì)量也不夠穩(wěn) 定。目前市面上的大曲主要存在以下問題(1)原料利用率不高現(xiàn)有醋廠存在原料綜合利用率低、成本高、資源浪費嚴重， 出品率等問題，直接影響醋廠的經(jīng)濟效益，現(xiàn)有大曲的制作工藝采用粗放式管理，同時，老 陳醋也僅僅是用較長的釀造周期和大量糧食的消耗來換取其較高的品質(zhì)，因而，大曲與釀 醋過程中的原料利用率的關系往往被忽略，使得山西老陳醋在醋醅發(fā)酵過程中，液化、糖化 作用不全面，從而造成了原料的利用率不高、出品率偏低等因素，大大影響了醋廠的利益；(2)菌種多來源于自然環(huán)境，酶活普遍偏低大曲菌系酶系復雜，制曲生產(chǎn)是在開 放式操作條件下自然網(wǎng)羅環(huán)境中各種各樣的微生物菌群菌系并以此為菌種，因此才造就了 大曲紛繁復雜的菌系酶系構成，正是因為其制作工藝多采用粗放的環(huán)境，造成其代謝產(chǎn)物 酶活普遍偏低，因而物料分解率不高，生產(chǎn)周期偏長；(3)制曲專業(yè)化水平不高由于通風制曲的場所一般為屋頂和樓梯，制曲環(huán)境污 染太重，溫度及濕度也不易把握；(4)醋用大曲創(chuàng)新力度不夠和酒用曲比起來，醋用曲的研究和創(chuàng)新略顯的緩慢， 由于人們的守舊觀念，一味的繼承，而忽略了創(chuàng)新。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決由于現(xiàn)有釀醋用的大曲活力不高，造成的原料利用率低，環(huán)境 污染嚴重，醋的品質(zhì)低的問題，而提供了一種醋用復合酶制劑的制備方法。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種醋用復合酶制劑的制備方法，包括以下步驟(1)菌種選育將活化后的黑曲霉AS3. 324接入固體斜面培養(yǎng)基中，30°C，培養(yǎng)36 40h后，用生 理鹽水將菌苔洗下，制備菌懸液，然后在紫外燈30W，距離30cm的條件下照射50 90s，之 后按照lmg/mL的加入量加入亞硝基胍，處理30min，得到高產(chǎn)糖化酶菌株；以CICC編號2475黑曲霉為出發(fā)菌株，在紫外燈25 30w，距離30cm的條件下照 射150 200s，得到高產(chǎn)纖維素酶菌株；以滬釀3042米曲霉為出發(fā)菌株，在紫外燈20w，距離28cm的條件下照射40 70s， 然后接種到氯化鋰培養(yǎng)基進行化學誘變72小時，得到高產(chǎn)蛋白酶菌株；以根霉Sp. Rhizopus 3. 105 (CICC編號40049)為出發(fā)菌株，在紫外燈30w，距離 20cm的條件下照射40 70s，得到高產(chǎn)酯化酶菌株；⑵斜面接種將上述高產(chǎn)糖化酶菌種接入固體斜面培養(yǎng)基中，30°C，培養(yǎng)36 40h，所述的固體 斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。將上述選育的高產(chǎn)纖維素酶黑曲霉菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，其中斜面培養(yǎng)基是 按照下列重量比的各組分為原料制備的羧甲基纖維素鈉(CMC)O. 5%、硫酸銨0.2%、酵母 膏 0. 1%、瓊脂2%，調(diào)？!17.0 7.2 ；將上述選育的高產(chǎn)蛋白酶米曲霉菌株在豆汁斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，豆汁培養(yǎng)基是按 照下列重量比的各組分為原料制備的豆汁(5° 8、)1000!^、可溶性淀粉2(^、磷酸二氫鉀 lg、硫酸鎂0. 5g、硫酸銨0. 5g，瓊脂20g、調(diào)pH為6. 5 7. 0 ；將上述選育的高產(chǎn)酯化酶根霉菌株接種到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在溫度30 35°C 的條件下培養(yǎng)間72h，斜面培養(yǎng)基是按照下列重量比的各組分為原料制備的麩皮20g、蔗 糖 1. 5g、瓊脂 1. 5g、水 IOOmL ；(3)搖瓶擴大培養(yǎng)將上述步驟斜面培養(yǎng)的黑曲霉接種于搖瓶培養(yǎng)基中，其中搖瓶轉速為270r/min， 32°C恒溫搖床培養(yǎng)120h，其中搖瓶培養(yǎng)基是以下列重量份的各組分為原料制備的玉米粉 14%，豆餅粉4%，麩皮1%，余量為水；將上述步驟經(jīng)斜面培養(yǎng)的黑曲霉接種于搖瓶培養(yǎng)基中，搖瓶轉速為150r/m，3rC 恒溫培養(yǎng)96h，其中搖瓶培養(yǎng)基是按照下列重量比的各組分為原料制備的稻草粉5%、麩 皮1 %、豆餅粉3 %、玉米漿2 %、磷酸二氫鉀0.5%、氯化鈣0. 3 %，調(diào)pH6. 5 7. 5 ；將經(jīng)斜面培養(yǎng)的米曲霉接種于不添加瓊脂的豆汁培養(yǎng)基中，轉速為150 190r/ m，31°C恒溫培養(yǎng)96h ；將經(jīng)斜面培養(yǎng)的根霉接種于搖瓶培養(yǎng)基，搖瓶轉速為150r/min，36°C恒溫搖床培 養(yǎng)36h，其中搖瓶培養(yǎng)基是按照下列重量比的各組分為原料制備的麩皮6g、黃豆粉5g、磷 酸氫二鉀 0. 2g、水 100mL、pH7. 0 ；(4)兩級種子罐培養(yǎng)將上述四種經(jīng)搖瓶擴大培養(yǎng)的菌株分別放入一級種子罐，接種量10%，在轉速 200 280r/min，溫度32°C的條件下培養(yǎng)45 50h ；
分別將上述四種經(jīng)一級種子罐培養(yǎng)的菌種轉入二級種子罐，在轉速220r/min，電 機功率llkw，溫度34°C的條件下培養(yǎng)30 35h ；上述的種子罐培養(yǎng)基分別是按照下列重量比的各組分為原料制備的高產(chǎn)糖化酶黑曲霉菌株種子培養(yǎng)基淀粉10%、豆餅粉4%、麩皮1%、磷酸氫二鉀 0. 3%、氯化鈣 0. 1% ；高產(chǎn)纖維素酶菌株種子培養(yǎng)基稻草粉5%、玉米粉1%、麩皮1%、硫酸銨0. 3%、 氯化鈣0. 1 %、調(diào)pH7. 0 7. 2 ；高產(chǎn)蛋白酶菌株種子培養(yǎng)基麩皮高粱粉水=4 1 4 ；高產(chǎn)酯化酶菌株種子培養(yǎng)基麩皮6%，豆粕水解液7%，磷酸氫二銨0. 3%，氯化 鈣 0. 5% ；(5) 2m3罐發(fā)酵培養(yǎng)將上述四種經(jīng)二級發(fā)酵罐培養(yǎng)的菌種轉入2m3發(fā)酵罐，在電機功率55kW，攪拌轉速 160 200r/min，溫度31°C的條件下發(fā)酵，待二次測定酶活力單位不再上升時即可終止發(fā) 酵；(6)板框過濾操作壓力0. 3 0. 6Mpa ；(7)真空低溫濃縮，然后將四種濃縮液體酶按照2 2 3 3比例混合，即得得 到醋用復合酶制劑。本發(fā)明通過對關鍵微生物選育并擴大培養(yǎng)，采用液態(tài)發(fā)酵工藝，生產(chǎn)出適于釀醋 用的復合酶系，以補充大曲中相應酶系的不足，強化關鍵酶系的活性，豐富與山西老陳醋品 質(zhì)有直接關系的酶系含量，通過與大曲聯(lián)合應用于釀醋，設計最佳配比，達到提高醋品質(zhì)及 出品率的目的。通過研究，醋用復合酶主要包括上述四種酶，其中各種酶的活力分別為糖化酶 12000U/g ；酯化酶:750U/g ；纖維素酶:3000U/g ；蛋白酶:2000U/g。經(jīng)過大量試驗表明，醋用復合酶制劑與大曲的最佳配比為1 50。按照傳統(tǒng)山西老陳醋釀造工藝，分A、B兩組，每組5批，A組只加傳統(tǒng)大曲，B組添 加使用本發(fā)明醋用復合酶制劑大曲，結果如下表1和表2所示，表1產(chǎn)品對比
權利要求
一種醋用復合酶制劑的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)菌種選育將活化后的黑曲霉AS3.324接入固體斜面培養(yǎng)基中，30℃，培養(yǎng)36～40h后，用生理鹽水將菌苔洗下，制備菌懸液，然后在紫外燈30W，距離30cm的條件下照射50～90s，之后按照1mg/mL的加入量加入亞硝基胍，處理30min，得到高產(chǎn)糖化酶菌株；以CICC編號2475黑曲霉為出發(fā)菌株，在紫外燈25～30W，距離30cm的條件下照射150～200s，得到高產(chǎn)纖維素酶菌株；以滬釀3042米曲霉為出發(fā)菌株，在紫外燈20w，距離28cm的條件下照射40～70s，然后接種到氯化鋰培養(yǎng)基進行化學誘變72小時，得到高產(chǎn)蛋白酶菌株；以根霉Sp.Rhizopus 3.105(CICC編號40049)為出發(fā)菌株，在紫外燈30w，距離20cm的條件下照射40～70s，得到高產(chǎn)酯化酶菌株；(2)斜面接種將上述高產(chǎn)糖化酶菌種接入固體斜面培養(yǎng)基中，30℃，培養(yǎng)36～40h，所述的固體斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。將上述選育的高產(chǎn)纖維素酶黑曲霉菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，其中斜面培養(yǎng)基是按照下列重量比的各組分為原料制備的羧甲基纖維素鈉(CMC)0.5％、硫酸銨0.2％、酵母膏0.1％、瓊脂2％，調(diào)pH7.0～7.2；將上述選育的高產(chǎn)蛋白酶米曲霉菌株在豆汁斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，豆汁培養(yǎng)基是按照下列重量比的各組分為原料制備的豆汁(5°B’e)1000mL、可溶性淀粉20g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、硫酸銨0.5g，瓊脂20g、調(diào)pH為6.5～7.0；將上述選育的高產(chǎn)酯化酶根霉菌株接種到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在溫度30～35℃的條件下培養(yǎng)間72h，斜面培養(yǎng)基是按照下列重量比的各組分為原料制備的麩皮20g、蔗糖1.5g、瓊脂1.5g、水100mL；(3)搖瓶擴大培養(yǎng)將上述步驟斜面培養(yǎng)的黑曲霉接種于搖瓶培養(yǎng)基中，其中搖瓶轉速為270r/min，32℃恒溫搖床培養(yǎng)120h，其中搖瓶培養(yǎng)基是以下列重量份的各組分為原料制備的玉米粉14％，豆餅粉4％，麩皮1％，余量為水；將上述步驟經(jīng)斜面培養(yǎng)的黑曲霉接種于搖瓶培養(yǎng)基中，搖瓶轉速為150r/m，31℃恒溫培養(yǎng)96h，其中搖瓶培養(yǎng)基是按照下列重量比的各組分為原料制備的稻草粉5％、麩皮1％、豆餅粉3％、玉米漿2％、磷酸二氫鉀0.5％、氯化鈣0.3％，調(diào)pH6.5～7.5；將經(jīng)斜面培養(yǎng)的米曲霉接種于不添加瓊脂的豆汁培養(yǎng)基中，轉速為150～190r/m，31℃恒溫培養(yǎng)96h；將經(jīng)斜面培養(yǎng)的根霉接種于搖瓶培養(yǎng)基，搖瓶轉速為150r/min，36℃恒溫搖床培養(yǎng)36h，其中搖瓶培養(yǎng)基是按照下列重量比的各組分為原料制備的麩皮6g、黃豆粉5g、磷酸氫二鉀0.2g、水100mL、pH7.0；(4)兩級種子罐培養(yǎng)將上述四種經(jīng)搖瓶擴大培養(yǎng)的菌株分別放入一級種子罐，接種量10％，在轉速200～280r/min，溫度32℃的條件下培養(yǎng)45 50h；分別將上述四種經(jīng)一級種子罐培養(yǎng)的菌種轉入二級罐，在轉速220r/min，電機功率11kW，溫度34℃的條件下培養(yǎng)30～35h；上述的種子罐培養(yǎng)基分別是按照下列重量比的各組分為原料制備的高產(chǎn)糖化酶黑曲霉菌株種子培養(yǎng)基淀粉10％、豆餅粉4％、麩皮1％、磷酸氫二鉀0.3％、氯化鈣0.1％；高產(chǎn)纖維素酶菌株種子培養(yǎng)基稻草粉5％、玉米粉1％、麩皮1％、硫酸銨0.3％、氯化鈣0.1％、調(diào)pH7.0～7.2；高產(chǎn)蛋白酶菌株種子培養(yǎng)基麩皮∶高粱粉∶水＝4∶1∶4；高產(chǎn)酯化酶菌株種子培養(yǎng)基麩皮6％，豆粕水解液7％，磷酸氫二銨0.3％，氯化鈣0.5％；(5)2m3罐發(fā)酵培養(yǎng)將上述四種經(jīng)二級發(fā)酵罐培養(yǎng)的菌種轉入2m3發(fā)酵罐，在電機功率55kW，攪拌轉速160 200r/min，溫度31℃的條件下發(fā)酵，待二次測定酶活力單位不再上升時即可終止發(fā)酵；(6)板框過濾操作壓力0.3 0.6Mpa；(7)真空低溫濃縮，然后將四種濃縮液體酶按照2∶2∶3∶3比例混合，即得得到醋用復合酶制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種醋用復合酶制劑的制備方法，涉及生物工程微生物發(fā)酵領域，解決現(xiàn)有釀醋用的大曲活力不高，造成的原料利用率低，環(huán)境污染嚴重，醋的品質(zhì)低的問題。一種醋用復合酶制劑的制備方法，包括以下步驟菌種選育；斜面接種；搖瓶擴大培養(yǎng)；兩級種子罐培養(yǎng)；2m3罐發(fā)酵培養(yǎng)；板框過濾；真空低溫濃縮，然后將四種濃縮液體酶按照2∶2∶3∶3比例混合，即得到醋用復合酶制劑。本發(fā)明通過對關鍵微生物選育并擴大培養(yǎng)，采用液態(tài)發(fā)酵工藝，生產(chǎn)出適于釀醋用的復合酶系，以補充大曲中相應酶系的不足，強化關鍵酶系的活性，豐富與老陳醋品質(zhì)有直接關系的酶系含量，通過與大曲聯(lián)合應用于釀醋，設計最佳配比，達到提高醋品質(zhì)及出品率的目的。
文檔編號C12N9/34GK101979526SQ201010532430
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權日2010年11月5日
發(fā)明者丁靜, 宋春雪, 張春杰, 張茜, 林汲, 趙紅年 申請人:山西三盟實業(yè)發(fā)展有限公司