專利名稱：6-磷酸葡萄糖脫氫酶和(s)-羰基還原酶偶聯(lián)提高(s)-苯基乙二醇轉(zhuǎn)化效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
6-磷酸葡萄糖脫氫酶和C )-羰基還原酶偶聯(lián)提高C )-苯基乙二醇轉(zhuǎn)化效率的方 法，利用基因共表達(dá)提高全細(xì)胞不對(duì)稱轉(zhuǎn)化C )-苯基乙二醇的效率和批次穩(wěn)定性的方法， 本發(fā)明涉及利用基因工程的手段，構(gòu)建了 C )-羰基還原酶(SCR II)和6-磷酸葡萄糖脫氫 酶(G6PDH)共表達(dá)的重組畢赤酵母菌O0ZcAia pastoris)SCR II G，高效制備C )-苯基乙二 醇，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
光學(xué)純的苯基乙二醇(PED)是液晶材料中不可缺少的手性添加劑，也是制備具有 光學(xué)活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體。生物法轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純C )-苯基乙二 醇，通常以微生物全細(xì)胞或酶為催化劑，采用不同的化學(xué)反應(yīng)途徑，如Bakers’酵母不對(duì)稱 還原2-羥基苯乙酮法，環(huán)氧化物水解酶催化水解外消旋苯乙烯氧化物法，和萘雙氧化酶 (NDO)選擇性氧化苯乙烯法等，這些方法存在底物濃度低，需要昂貴的輔酶，產(chǎn)物光學(xué)純度 低等缺點(diǎn)。氧化還原酶催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)中，輔酶不能循環(huán)使用是限制其工業(yè)化應(yīng)用 的“瓶頸”因素。全細(xì)胞體系輔酶再生主要有兩種策略一是在反應(yīng)體系中添加醇或糖類輔助底 物，構(gòu)成底物耦聯(lián)再生系統(tǒng)；二是通過(guò)基因工程手段在細(xì)胞中構(gòu)建酶耦聯(lián)再生系統(tǒng)。如 Degussa公司利用該輔酶再生的原理催化三甲基丙酮酸不對(duì)稱還原合成L-叔亮氨酸，大大 提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)氨酶、醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶組成的耦聯(lián)體系用于高效轉(zhuǎn)化 O )-苯乙醇。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用重組菌株催化不對(duì)稱還原反應(yīng)，制備C )-苯基乙二醇，在此基 礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)，將釀酒酵母6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)基因ZWFl與近平滑 假絲酵母W)-羰基還原酶基因scr II整合至畢赤酵母基因組中，構(gòu)建了共表達(dá)偶聯(lián)體系 Pichia pastorII G，在 5% (w/v)葡萄糖的參與下，/^icAiaAasioris/SCR II G 不對(duì) 稱還原2-羥基苯乙酮的催化效率大大提高，反應(yīng)十個(gè)批次后，產(chǎn)物C )-苯基乙二醇光學(xué)純 度和產(chǎn)率分別高達(dá)100%和85%以上。

發(fā)明內(nèi)容
(1)要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的是提供一種基因工程方法構(gòu)建多酶偶聯(lián)體系，實(shí)現(xiàn)了多種酶功能的成功 整合。利用酶偶聯(lián)后的重組菌株/^'cAiaAastoris/SCR II G (菌種保藏號(hào)CGMCC No. 4198) 高效不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備W)-苯基乙二醇的方法。本發(fā)明根據(jù)釀酒酵母6-磷酸葡萄糖脫氫 酶和近平滑假絲酵母(5·)-羰基還原酶的功能，利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建雙酶偶聯(lián)畢赤氏酵 母體系，以酶偶聯(lián)重組菌為催化劑，實(shí)現(xiàn)了從2-羥基苯乙酮到C )-苯基乙二醇的高效轉(zhuǎn) 化。在5% (w/v)葡萄糖的參與下，當(dāng)?shù)孜餄舛葹? mg/mL時(shí)，經(jīng)過(guò)十批次的催化反應(yīng)，產(chǎn)物(5·)-苯基乙二醇光學(xué)純度高達(dá)100%，產(chǎn)率維持在85%以上。本發(fā)明為解除輔酶再生循 環(huán)的限制，成功整合雙酶功能，提高手性醇制備效率提供了一條嶄新的思路。(2)技術(shù)方案
一株不對(duì)稱制備W)-苯基乙二醇的重組菌，其分類命名為巴斯德畢赤酵母G^dia pastoris) SCR II G，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編 號(hào)=CGMCC No. 4198。利用重組菌CGMCC No. 4198不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(5)-苯基乙二醇的方法，不對(duì)稱轉(zhuǎn)化 反應(yīng)條件在0.1 mol/L pH 5. 5的醋酸緩沖液中，加質(zhì)量/體積比5%葡萄糖，底物2-羥基 苯乙酮的濃度為6 mg/mL，重組菌細(xì)胞濃度為0. 1 g/mL，不加輔助底物，反應(yīng)溫度為35°C，反 應(yīng)時(shí)間為24 h，轉(zhuǎn)速150 r/min，重組菌菌體重復(fù)利用十個(gè)批次。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心除去菌體，上清液加入2倍體積乙酸乙酯萃取，有 機(jī)相用于分析。產(chǎn)物通過(guò)手性固定相高效液相色譜(Agillent HPl 100)進(jìn)
行分析，條件為 Chiralcel 0Β-Η柱(4. 6 mm X 25 cm; Daicel Chemical Ind.，Ltd., Japan)，流動(dòng)相為正己烷/異丙醇(9/1，V/V)，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215歷。產(chǎn)物 的光學(xué)純度通過(guò)對(duì)映過(guò)量值來(lái)衡量。產(chǎn)物⑶-苯基乙二醇對(duì)映過(guò)量值的計(jì)算對(duì)映過(guò)量值(e.e.%) = [ (Cs-G)/ (CR+CS) ] *100%
產(chǎn)物C )-苯基乙二醇產(chǎn)率的計(jì)算產(chǎn)率(％)= Q/c0noo%
式中G為反應(yīng)后O )-對(duì)映體的濃度，C1s為反應(yīng)后C )-對(duì)映體的濃度，C0為反應(yīng)前底 物O )-苯基乙二醇的濃度。以全細(xì)胞為催化劑，不對(duì)稱生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，產(chǎn)物均為C )-苯基乙二醇。重組菌的培養(yǎng)
BMGY (Buffered Glycerol-complex Medium)培養(yǎng)基，以質(zhì)量 / 體積 % 計(jì)酵母膏 1%， 蛋白胨2%，甘油1%，pH 6. 0、100 mmol/L磷酸緩沖液10%, YNB1. 34%，生物素4X 10_5%，用去 離子水補(bǔ)足至100% ；
BMMY (Buffered Methanol-complex Medium)培養(yǎng)基，以質(zhì)量 / 體積 % 計(jì)酵母膏 1%， 蛋白胨 2%,甲醇 0. 5%, pH 6. 0、100 mmol/L 磷酸緩沖液 10%, YNB1. 34%，4X 10_5% 生物素，用 去離子水補(bǔ)足至100% ；
培養(yǎng)條件將重組菌CGMCC No. 4198按1%的接種量接種于裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基的 100 mL搖瓶中，在28°C、250 r/min的條件下，培養(yǎng)至菌濃徹_=2_6 ；室溫3000 g離心5 min，收集菌體，用100 mL BMMY重懸菌體，使為1. 0，置于500 mL的搖瓶中，在28°C、 250 r/min的條件下培養(yǎng)，每12 h，按培養(yǎng)基質(zhì)量/體積％計(jì)添加甲醇0. 5%至培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)96h，10，000 rpm離心10 min，沉淀用生理鹽水洗滌兩次，收集得到重組菌全細(xì)胞。所述重組菌CGMCC No. 4198的構(gòu)建方法，將scr II基因插入pPIC3. 5K中構(gòu) 建重組質(zhì)粒PPIC3. 5K-SCR II，電擊轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌 Pichia pas tor is/ pPIC3. 5K-SCR II ；同時(shí)將基因ZWFl插入載體pPICZ α，獲得重組質(zhì)粒 pPICZ α -ZWFl，用feci對(duì)pPICZ α -ZffFl進(jìn)行單酶切線性化，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)重組畢赤酵母 Pichia pastor is/ pPIC3. 5K-SCR II 的感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有 100 μ g/mL Zeocin (博來(lái)霉 素)的YPD平板，挑取陽(yáng)性單克隆得到重組菌PicAia pastor is IH II G。質(zhì)粒pPIC3. 5K和質(zhì)粒pPICZa均購(gòu)自Invitrogen公司。重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-SCR II的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶I和Afoi I分別對(duì)載 體PPIC3. 5K和基因片段II進(jìn)行酶切，純化后的基因片段與載體通過(guò)粘性末端進(jìn)行連 接，獲得重組質(zhì)粒PPIC3. 5K-SCR II。重組質(zhì)粒pPICZa-ZWFl的構(gòu)建，利用限制性內(nèi)切酶feiB I和煬ο I分別對(duì)載體 PPICZa和基因片段ZWFl進(jìn)行酶切，純化后的基因片段與載體通過(guò)粘性末端進(jìn)行連接，獲 得重組質(zhì)粒pPICZ a -ZffFl?；蚱蝫r II的獲取實(shí)驗(yàn)室已知wr II基因全序列，以近平滑假絲酵母的基因 組為模板，設(shè)計(jì)含有漢3 H I酶切位點(diǎn)的引物SCR II _pPIC3. 5K_F和含有AfoiI酶切位點(diǎn)的 引物SCR II _pPIC3. 5K_R，通過(guò)PCR，獲得^scr II基因全長(zhǎng)，全長(zhǎng)為837 bp。SCR II _pPIC3. 5K_F: CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCATAGC AGTGGCATGGGCGAAATCGAATC {Βαιπ I)
SCR II _pPIC3. 5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCATCGAC (JVot I) PCR 反應(yīng)體系10 X Taq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/yL 的弓丨物 SCR II _pPIC3. 5K_F 和 SCR II _pPIC3. 5K_R 各 1 μ L，近平滑假絲酵母 DNA
5 μ L，5 U/μ L 的 Taq DNA polymerase 0.5 μ L, ddH20 33.5 μ L，反應(yīng)總體積 50 μ L ;PCR 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 4 min ;94°C 1 min,58°C 1 min,72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循 環(huán)；72°C延伸10 min ；獲得scr II基因?；蚱蝂WFl的獲取通過(guò)NCBI檢索得到ZWFl基因全長(zhǎng)，以釀酒酵母基因組 為模板，利用含feiB I酶切位點(diǎn)的引物pPIC_G6PDH_F和含損ol酶切位點(diǎn)的引物pPIC_ G6PDH_R，通過(guò)PCR，獲得ZWFl基因的全長(zhǎng)為1518 bp ；
pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGMGGCCCCGTCAAATTTG AAMAAATACCG (BstB I) pPIC_G6PDH_R CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC {Xhol) PCR 反應(yīng)體系IOXTaq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/yL 的弓 | 物 pPIC_G6PDH_F 和 pPIC_G6PDH_R 各 1 μ L，釀酒酵母基因組 5 μ L,
5 U/ μ L 的 Taq DNA polymerase 0. 5 μ L, ddH20 33. 5 μ L,反應(yīng)總體積 50 μ L ；PCR 反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性 5 min ；94°C 1 min，55°C 1 min，72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸10 min ；獲得ZWFl基因。具體操作如下
一、近平滑假絲酵母(Cparapsilosis) CCTCC M203011 (中國(guó)專利 03132140. 2，已公 開(kāi))禾口酉良酒酵母(SaccAarofflj^e1S cerevisiae)培養(yǎng)
近平滑假絲酵母的培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)葡萄糖40，酵母膏5，(NH4)2HPO4 13, KH2PO4 7， ZnSO4 · 7H20 0. 3，NaCl 0. 1，pH 7. 0 ；將近平滑假絲酵母菌種CCTCC M203011接種于培養(yǎng)基 裝液量為20%的250 mL搖瓶中于30°C、150 rpm振蕩培養(yǎng)48h ；
釀酒酵母的培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，葡萄糖10，pH 7.0;將釀酒酵母菌種接種于培養(yǎng)基裝液量為20%的250 mL搖瓶中于30°C、150 rpm振蕩培 養(yǎng) 48h ；
二、近平滑假絲酵母(Cparapsilosis) CCTCC NO =M 203011基因組和釀酒酵母 (Saccharomyces cere visiae )基因組的獲取近平滑假絲酵母CCTCC M203011和釀酒酵母培養(yǎng)結(jié)束后，分別將菌體于6，000 g離 心20 min，用生理鹽水洗滌兩次后收集細(xì)胞，利用VI0GENE公司的基因組DNA提取試劑盒 Genomic DNA Extraction Miniprep System提取近平滑假絲酵母基因組和釀酒酵母的基因組。三、scr II基因的獲得
以近平滑假絲酵母(C parapsilosis) CCTCC M203011基因組作為PCR反應(yīng)模板，利 用含有I酶切位點(diǎn)的引物SCR II _pPIC3. 5K_F和含有AfoiI酶切位點(diǎn)的引物SCR II _ pPIC3. 5K_R，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得scr II基因，全長(zhǎng)為837 bp。SCR II _pPIC3. 5K_F CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCAT AGCAGTGGCATGGGCGAAATCGAATCI)
SCR II _pPIC3. 5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCAT CGAC (JVot I) PCR 反應(yīng)體系10XTaq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/yL 的弓| 物 SCR II _pPIC3. 5K_F 和 SCR II _pPIC3. 5K_R 各 1 μ L，近平滑假絲酵母 DNA 5 μ L，5 U/ μ L 的 Taq DNA polymerase 0.5 μ L, ddH20 33.5 μ L，反應(yīng)總體積 50 μ L。PCR 反應(yīng)條 件95°C預(yù)變性 4 min ；94°C 1 min, 58°C 1 min,72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min，獲得 scr II 基因；利用 3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit (上海申能博彩 生物科技有限公司)純化scr II基因。四、ZWFl基因的獲得
以釀酒酵母基因組為模板，利用含feiB I酶切位點(diǎn)的引物pPIC_G6PDH_F和含損ol酶 切位點(diǎn)的引物pPIC_G6PDH_R，通過(guò)PCR獲得ZWFl基因，全長(zhǎng)為1518 bp。pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAAT TTGAAAAAAATACCG WstB I)
pPIC_G6PDH_R: CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC (Jhol) PCR 反應(yīng)體系IOXTaq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/yL 的弓 | 物 pPIC_G6PDH_F 禾口 pPIC_G6PDH_R 各 1 μ L，釀酒酵母基因組 5 μ L，5 U/ μ L 的 Taq DNA polymerase 0. 5 μ L，ddH20 33. 5 μ L，反應(yīng)總體積 50 μ L ；PCR 反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性 5 min ； 94 0C 1 min，55°C 1 min，72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 10 min;獲得 ZWFl 基 因。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit (上海申能博彩生物科技有限公 司)純化ZWFl基因。五、重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-SCR II的構(gòu)建
用BemM I和Afoi I分別對(duì)載體pPIC3. 5K和基因片段scr II進(jìn)行酶切，純化后的基因 片段scr II與載體pPIC3. 5K通過(guò)粘性末端連接，獲得帶有目標(biāo)基因片段scr II的重組質(zhì)粒 pPIC3. 5K-SCR II。六、重組質(zhì)粒pPICZ α -ZffFl的構(gòu)建
利用限制性內(nèi)切酶損ol和feiB I分別對(duì)載體pPICZ α和基因片段ZWFl進(jìn)行酶切，純 化后的基因片段ZWFl與載體pPICZ α通過(guò)粘性末端連接，獲得帶有目標(biāo)基因片段ZWFl的 重組質(zhì)粒pPICZ α -ZWFl。七、重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-SCR II轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母
取20 μ L重組質(zhì)粒PPIC3. 5K-SCR II，用限制性內(nèi)切酶feci單酶切線性化后，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115，30°C靜置1 h，涂布于MD平板上，挑取克隆經(jīng)PCR驗(yàn)證，獲得重組 菌/^icAiaAasioris/pPICS. 5K-SCR II。PCR 驗(yàn)證反應(yīng)體系10 X Taq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/ μ L 的引物 SCR II _pPIC3. 5K_F 和 SCR II _pPIC3. 5K_R 各 1 μ L，畢赤氏酵母 DNA 5 μ L，5 U/μ L 的 Taq DNA polymerase 0.5 μ L, ddH20 33. 5 μ L，反應(yīng)總體積 50 μ L。PCR 驗(yàn)證 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 4 min ；94°C 1 min，58°C 1 min，72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10 min。八、重組質(zhì)粒pPICZ α -ZffFl 轉(zhuǎn)化重組菌/^icAiaAasioris/pPICS. 5K-SCR II
洛Pichia pas tori s/pPIC3. 5K-SCR II涂布MD平板，兩天后挑取單克隆，制備感受態(tài)， 采用feci單酶切后的質(zhì)粒pPICZ α -ZffFl,電轉(zhuǎn)化PicAiaAasioris/pPICS. 5K-SCR II感受態(tài) 細(xì)胞，通過(guò)100 μ g/mL Zeocin的YPD平板篩選，獲得重組菌PicAia pas toris/SCR II G, 即 CGMCC No. 4198。九、重組菌CGMCC No. 4198的培養(yǎng)
BMGYCBuffered Glycerol-complex Medium)培養(yǎng)基1% 酵母膏，2% 蛋白胨，1% 甘油， 10% 100 mmol/L 磷酸緩沖液 pH 6. 0，1. 34% YNB, 4 X 10-5% 生物素；
BMMY (Buffered Methanol-complex Medium) 1% 酵母膏，2% 蛋白胨，0.5% 甲醇，10% 100 mmol/L磷酸緩沖液pH 6.0,1.34% YNB, 4 X 10-5%生物素，以去離子水補(bǔ)足至100%。培養(yǎng)條件將重組菌CGMCC No. 4198按1%接種量接種于裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基 的100 mL搖瓶中，在28°C、250 r/min的條件下，培養(yǎng)至菌濃徹6(1(1為2-6 ；以3,000 g離心 5 min,收集菌體，用100 mL BMMY重懸菌體，使菌體ODim達(dá)1. 0左右，轉(zhuǎn)至500 mL的搖瓶 中，在28°C、250 r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；每隔12 h，添加0. 5%甲醇于培養(yǎng)基中，菌體連 續(xù)培養(yǎng)96h后，于10，000 rpm離心10 min，收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，重新收集菌 體細(xì)胞。(3)有益效果
通過(guò)將C )-羰基還原酶SCR II (編碼基因的GenBank登記號(hào)FJ939563)和6-磷酸 葡萄糖脫氫酶G6PDH (編碼基因的GenBank登記號(hào)BK006947. 2)進(jìn)行偶聯(lián)，共表達(dá)于畢赤 酵母細(xì)胞中。利用成功構(gòu)建的重組菌CGMCC No. 4198 {P. pastoris/^ II G)不對(duì)稱催化 2-羥基苯乙酮，轉(zhuǎn)化⑶-苯基乙二醇。通過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化，在pH5. 5的0.1 mol/L醋酸緩 沖液中，利用0.1 g/mL重組菌CGMCC No. 4198催化6 mg/mL底物2-羥基苯乙酮，35°C下 反應(yīng)24h，連續(xù)反應(yīng)十個(gè)批次，最終產(chǎn)物(5·)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為 86. 2%。這些工作為從2-羥基苯乙酮到(5·)-苯基乙二醇的轉(zhuǎn)化提供了有效途徑，為輔酶再 生循環(huán)途徑耦合入(5·)-苯基乙二醇的生物轉(zhuǎn)化途徑提供了新的研究思路，而且通過(guò)菌體 多批次循環(huán)使用，大大降低了(5·)-苯基乙二醇制備成本，為手性醇工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí) 的基礎(chǔ)。生物材料樣品保藏
巴斯德畢赤氏酵母(A'dia pas tor is) SCR II G，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó) 科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)=CGMCC No. 4198。保藏日期2010年9月26日。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
近平滑假絲酵母和釀酒酵母的培養(yǎng)。近平滑假絲酵母培養(yǎng)基組成葡萄糖4%，酵母膏0. 5%，(MM)2HPO4 1. 3%，KH2PO4 0. 7%, ZnSO4 · 7H20 0. 03%, NaCl 0. 01%, pH7. 0。將菌種 CCTCC NO :M 203011 接種于 50 mL 培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C、150 rpm振蕩培養(yǎng)48 h。釀酒酵母培養(yǎng)基組成胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 1%，葡萄糖1%，pH 7.0;將釀酒酵母菌種接種于培養(yǎng)基裝液量為20%的250 mL搖瓶中于30°C、150 rpm振蕩培 養(yǎng) 48h。實(shí)施例2
近平滑假絲酵母和釀酒酵母的基因組的獲得近平滑假絲酵母和釀酒酵母培養(yǎng)結(jié)束 后，分別將菌體于6，000 g離心20 min，用生理鹽水洗滌兩次后收集細(xì)胞，利用VI0GENE公 司的基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取近平滑假絲 酵母基因組及釀酒酵母的基因組。實(shí)施例3
■scr II基因的獲得。以近平滑假絲酵母基因組為模板，利用含有I酶切位點(diǎn)的引 物SCR II _pPIC3. 5K_F和含有AfoiI酶切位點(diǎn)的引物SCR II _pPIC3. 5K_R,通過(guò)PCR,獲得 SCR II基因全長(zhǎng)。SCR II _pPIC3. 5K_F CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCA TAGCAGTGGCATGGGCGAAATCGAATC {Βαιπ I)
SCR II _pPIC3. 5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCATC GAC (JVot I) PCR 反應(yīng)體系10XTaq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/yL 的弓| 物 SCR II _pPIC3. 5K_F 和 SCR II _pPIC3. 5K_R 各 1 μ L，近平滑假絲酵母 DNA 5 μ L，5 U/ μ L 的 Taq DNA polymerase 0.5 μ L, ddH20 33.5 μ L，反應(yīng)總體積 50 μ L。PCR 反應(yīng)條 件95°C預(yù)變性 4 min ；94°C 1 min, 58°C 1 min,72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min。獲得scr II基因片段。實(shí)施例4
ZWFl基因的獲得。以釀酒酵母的基因組為模板，利用含利用含feiB I酶切位點(diǎn)的引物 pPIC_G6PDH_F和含損ol酶切位點(diǎn)的引物pPIC_G6PDH_R，PCR獲得ZWFl基因。pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAAT TTGAAAAAAATACCG WstB I)
pPIC_G6PDH_RCACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC {Xhol) PCR 反應(yīng)體系IOXTaq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/yL 的弓 | 物 pPIC_G6PDH_F 和 pPIC_G6PDH_R 各 1 μ L，釀酒酵母基因組 5 μ L,
5 U/ μ L 的 Taq DNA polymerase 0. 5 μ L, ddH20 33. 5 μ L,反應(yīng)總體積 50 μ L ；PCR 反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性 5 min ；94°C 1 min，55°C 1 min，72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸10 min ；獲得ZWFl基因。實(shí)施例5
重組質(zhì)粒PPIC3. 5K-SCR II的獲得。利用限制性內(nèi)切酶I和AfeiI分別對(duì)載體PPIC3. 5K和基因片段SCR II進(jìn)行酶切，純化后的基因片段與載體通過(guò)粘性末端進(jìn)行連接， 獲得重組質(zhì)粒PPIC3. 5K-SCR II。采用feci對(duì)其進(jìn)行單酶切線性化，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤 酵母GS115，30°C靜置1 h，涂布于MD平板上，挑取單克隆，經(jīng)PCR驗(yàn)證后獲得重組菌八 pastoris/^lC >. 5K-SCR II?；騭cr II及質(zhì)粒pPIC3. 5K的酶切
利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技 術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pPIC3. 5K。分別按照水、緩沖液、基因scr II和酶的順序，及水、緩沖液、質(zhì)粒pPIC3. 5K和酶的 順序分別加到不同的Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)離心2 s使液體集中于管底，37°C水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C 保溫10 min，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收和濃縮目的片段。反應(yīng)體系組成10X Buffer H 4 μ L，基因 scr II 或質(zhì)粒 pPIC3. 5K 10 μ L，漢警HI 2 μ L,Notl 2 μ L，ddH20 將體系補(bǔ)足 40 μ L?；騭cr II及質(zhì)粒pPIC3. 5K的連接
連接反應(yīng)體系組成質(zhì)粒PPIC3. 5Κ 0.8 μ L，基因scr II 4.2 μ L, Ligation Solution 5 UL0混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接12-16 h。實(shí)施例6
重組質(zhì)粒PPICZa-ZWFl的獲得。利用限制性內(nèi)切酶損ol和feiB I分別對(duì)載體 PPICZa和ZWFl基因進(jìn)行酶切，純化后的基因片段與載體通過(guò)粘性末端進(jìn)行連接，獲得重 組質(zhì)粒 pPICZ a-ZWFl?；騔WFl及質(zhì)粒pPICZa的酶切
利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技 術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pPICZ α。分別按照水、緩沖液、基因ZWFl和酶的順序，及水、緩沖液、質(zhì)粒pPICZ α和酶的順 序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)離心2 s使液體集中 于管底，37°C水浴3 h，在管中加入的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10 min，終止酶 切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收和濃縮目的片段。反應(yīng)體系組成10XBuffer H 4 μ L，基因 ZWFl 或質(zhì)粒 pPICZ α 10 μ L, Xhol 2 μ L，feiB I 2 μ L，ddH20 將體系補(bǔ)足 40 μ L?；騔WFl與質(zhì)粒pPICZ α的連接
連接反應(yīng)體系組成質(zhì)粒pPICZ α 0.8 μ L，基因 ZWFl 4.2 μ L, Ligation Solution 5 UL0混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接12-16 h。實(shí)施例7
重組菌Λ pastoris/ pPIC3. 5K- SCR II 的獲得。畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備將畢赤酵母單克隆接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基， 30°C, 200 r/min，培養(yǎng)過(guò)夜；取50 ？ L過(guò)夜培養(yǎng)物至100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30°C，200 r/min,培養(yǎng)至OD600為2-6 ；于4°C，5000 r/min離心5 min收集菌液，用100 mL冰預(yù)冷的 無(wú)菌水洗滌兩次，收集菌體；分別用10 mL和1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液洗滌菌 體，并收集菌體，每80 ？ L分裝保存。
重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母感受態(tài)細(xì)胞
(1)質(zhì)粒線性化提取pPIC3.5k- SCR II質(zhì)粒，酶切體系為IOXbuffer 5 μ L，質(zhì)粒(約 20 ？ g)43 μ L, Sacl 2 μ L, 37°C 4 h，1%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，檢測(cè)酶切是否完全， 膠回收酶切產(chǎn)物；
(2)取10？ L (約5 ？ g 10 ？ g)的線性化質(zhì)粒與80 μ L的感受態(tài)GSl 15菌體混 勻，轉(zhuǎn)至0. 2 cm冰預(yù)冷的電擊杯中；
(3)冰上放置5min,電壓1500 V，電容25 ？ F，電阻200 Ω，電擊時(shí)間為5 ms，進(jìn)行電
擊；
(4)電擊完畢后，立即加入1mL冰預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液，混勻；
(5)30°C靜置1h，涂布于MD平板上，30°C培養(yǎng)2 d。重組巴斯德畢赤酵母的鑒定
以提取的近平滑假絲酵母基因組DNA為模板，用引物SCR II _pPIC3. 5K_F和SCR II _ pPIC3. 5K_R 進(jìn)行 PCR，PCR 反應(yīng)體系10XTaq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/ μ L 的引物 SCR II _pPIC3. 5K_F 和 SCR II _pPIC3. 5K_R 各 1 μ L,畢赤氏酵母 DNA 5 μ L,5 U/μ L 的 Taq DNA polymerase 0.5 μ L, ddH20 33. 5 μ L，反應(yīng)總體積 50 μ L。PCR 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 4 min ；94°C 1 min, 58°C 1 min，72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物檢測(cè)PCR結(jié)果。并保藏陽(yáng)性克隆八pastor is/ pPIC3. 5K- SCR II。實(shí)施例8
重組菌Λ /^asioris/SCR II G 的獲得。將代 pasioris/pPICS. 5K-SCR II 涂布 MD 平 板，兩天后挑取單克隆，制備感受態(tài)，采用fe/ I單酶切后的質(zhì)粒pPICZa-ZWFl，電轉(zhuǎn)化八 pastor is/ pPIC3. 5K- SCR II感受態(tài)畢赤酵母，涂布含有100 μ g/ml Zeocin的YPD平板， 挑取陽(yáng)性單克隆得到重組菌代pastor is/^CR II G。實(shí)施例9
重組畢赤氏酵母的誘導(dǎo)表達(dá)。將重組菌八/^astoriWSCR II G按1%的接種量接種于 裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中，在28°C、250 r/min的條件下，培養(yǎng)至菌濃徹_ 為2-6 ；室溫3000 g離心5 min,收集菌體，用100 mL BMMY重懸菌體，使OD_為1. 0左右， 置于500 mL的搖瓶中，在28°C、250 r/min的條件下培養(yǎng)；每12 h，添加培養(yǎng)體系體積0. 5% 的甲醇至培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)96h，10，000 rpm離心10 min，用生理鹽水洗滌兩次，收集重組菌 細(xì)胞。實(shí)施例10
用實(shí)施例9中收集的菌體細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液 (pH5. 5)，分別加入6 mg/mL底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. 1 g/mL重組畢赤酵 母R pas tor is/SCR II G菌體，混勻后于35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心取上 清液萃取，產(chǎn)物C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為97. 2%。離心收集的菌體， 用生理鹽水洗兩次用于第二批次的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例11
用實(shí)施例10中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6 mg/mL底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. lg/mL實(shí)施例10中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°c恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心，取上清液萃 取，產(chǎn)物C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為93. 4%。離心收集的菌體，用生理 鹽水洗兩次再用于第三批次的轉(zhuǎn)化 實(shí)施例12
用實(shí)施例11中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6mg/mL底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. lg/mL實(shí)施例 11中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，離心取上清液萃取，產(chǎn)物 C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為91. 7%。離心收集的菌體，用生理鹽水洗兩 次，用于第四批次的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例13
用實(shí)施例12中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6 g/L底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. lg/mL實(shí)施例12 中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心，取上清液萃取， 產(chǎn)物C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為90. 2%。離心收集的菌體，用生理鹽 水洗兩次用于第五批次的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例14
用實(shí)施例13中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6 g/L底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. 1 g/mL實(shí)施例13 中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心，取上清液萃取， 產(chǎn)物C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為89. 2%。離心收集的菌體，用生理鹽 水洗兩次用于第六批次的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例15
用實(shí)施例14中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6 g/L底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. 1 g/mL實(shí)施例14 中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心，取上清液萃取， 產(chǎn)物C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為88. 9%。離心收集的菌體，用生理鹽 水洗兩次用于第七批次的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例16
用實(shí)施例15中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6 g/L底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. 1 g/mL實(shí)施例15 中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心，取上清液萃取， 產(chǎn)物C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為88. 0%。離心收集的菌體，用生理鹽 水洗兩次用于第八批次的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例17
用實(shí)施例16中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6 g/L底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. 1 g/mL實(shí)施例16 中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心，取上清液萃取， 產(chǎn)物C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為87. 6%。離心收集的菌體，用生理鹽 水洗兩次用于第九批次的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例18
用實(shí)施例17中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6 g/L底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. lg/mL實(shí)施例17 中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心，取上清液萃取， 產(chǎn)物C )-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為87. 2%。離心收集的菌體，用生理鹽 水洗兩次用于第十批次的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例19
用實(shí)施例18中生理鹽水洗滌后的菌體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在1 mL 0. 1 mol/L醋酸緩 沖液(pH5. 5)，分別加入6 g/L底物2-羥基苯乙酮，5% (w/v)葡萄糖和0. lg/mL實(shí)施例18 中收集的菌體細(xì)胞，混勻后在35°C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)24 h，混合物離心取上清液萃取，產(chǎn) 物(5·)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100%e. e.，產(chǎn)率為86. 2%。
權(quán)利要求
一株不對(duì)稱制備(S) 苯基乙二醇的重組菌，其分類命名為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)SCRⅡG ，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.4198。
2.利用重組菌CGMCCNo. 4198不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備C )-苯基乙二醇的方法，其特征在于 不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件在0. 1 mol/L pH 5. 5的醋酸緩沖液中，加質(zhì)量/體積比5%葡萄糖， 底物2-羥基苯乙酮的濃度為6 mg/mL，重組菌細(xì)胞濃度為0. 1 g/mL，不加輔助底物，反應(yīng)溫 度為35°C，反應(yīng)時(shí)間為24 h，轉(zhuǎn)速150 r/min，重組菌菌體重復(fù)利用十個(gè)批次。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于重組菌的培養(yǎng)BMGY培養(yǎng)基，以質(zhì)量/體積％計(jì)酵母膏1%，蛋白胨2%，甘油1%，pH 6. 0、100 mmol/L 磷酸緩沖液10%，YNB 1. 34%，生物素4X 10_5 %，用去離子水補(bǔ)足至100% ；BMMY培養(yǎng)基，以質(zhì)量/體積％計(jì)酵母膏1%，蛋白胨2%，甲醇0. 5%，pH 6. 0、100 mmol/ L磷酸緩沖液10%，YNB 1. 34%，生物素4X 10_5 %，用去離子水補(bǔ)足至100% ；培養(yǎng)條件將重組菌CGMCC No. 4198按1%的接種量接種于裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基的 100 mL搖瓶中，在28°C、250 r/min的條件下，培養(yǎng)至菌濃徹_=2_ 6 ；室溫3000 g離心5 min，收集菌體，用100 mL BMMY重懸菌體，使為1. 0，置于500 mL的搖瓶中，在28°C、 250 r/min的條件下培養(yǎng)，每12 h，按培養(yǎng)基質(zhì)量/體積％計(jì)添加甲醇0. 5%至培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)96h，10，000 rpm離心10 min，沉淀用生理鹽水洗滌兩次，收集得到重組菌全細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述重組菌CGMCCNo. 4198的構(gòu)建方法，其特征在于將scr II基因插入 PPIC3. 5K中構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-SCR II，電擊轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，獲得 重組菌PicAia pastoris/x> lC ,. 5K-SCR II ；同時(shí)將基因ZWFl插入載體pPICZa，獲得重組 質(zhì)粒pPICZ a -ZWFl，用feci對(duì)pPICZ a -ZffFl進(jìn)行單酶切線性化，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)重組畢赤 酵母/7ZcAia pastor is/ pPIC3. 5K-SCR II 的感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有 100 μ g/mL Zeocin 的 YPD平板，挑取陽(yáng)性單克隆得到重組菌PicAia pastoris/^CR II G。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征是重組質(zhì)粒pPIC3.5K-SCR II的構(gòu)建利用 限制性內(nèi)切酶I和Afoi I分別對(duì)載體PPIC3. 5K和基因片段scr II進(jìn)行酶切，純化后 的基因片段與載體通過(guò)粘性末端進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒PPIC3. 5K-SCR II。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征是重組質(zhì)粒pPICZa-ZWFl的構(gòu)建，利用限 制性內(nèi)切酶feiB I和損ο I分別對(duì)載體pPICZ α和基因片段ZWFl進(jìn)行酶切，純化后的基因片段與載體通過(guò)粘性末端進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pPICZ a -ZffFl。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征是基因片段scrII的獲取實(shí)驗(yàn)室已知 scr II基因全序列，以近平滑假絲酵母的基因組為模板，設(shè)計(jì)含有BamR I酶切位點(diǎn)的引物SCR II _pPIC3. 5K_F和含有AfoiI酶切位點(diǎn)的引物SCR II _ PPIC3. 5K_R，通過(guò)PCR，獲得scr II基因全長(zhǎng)。
8.SCR II _pPIC3. 5K_F: CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCATAGC AGTGGCATGGGCGAAATCGAATCSCR II _pPIC3. 5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCATCGACPCR 反應(yīng)體系10 X Taq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/yL 的弓丨物 SCR II _pPIC3. 5K_F 和 SCR II _pPIC3. 5K_R 各 1 μ L，近平滑假絲酵母 DNA`5 μ L，5 U/μ L 的 Taq DNA polymerase 0.5 μ L, ddH20 33.5 μ L，反應(yīng)總體積 50μ L ;PCR 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 4 min ;94°C 1 min,58°C 1 min,72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循 環(huán)；72°C延伸10 min ；獲得scr II基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征是基因片段ZWFl的獲取通過(guò)NCBI檢索得 到ZWFl基因全長(zhǎng)，以釀酒酵母基因組為模板，利用含feiB I酶切位點(diǎn)的引物pPIC_G6PDH_ F和含煬ol酶切位點(diǎn)的引物pPIC_G6PDH_R，通過(guò)PCR，獲得ZWFl基因的全長(zhǎng)為1518 bp; pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAATTTG AAAAAAATACCG pPIC_G6PDH_R: CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGCPCR 反應(yīng)體系10XTaq buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 4 μ L,50 pmol/yL 的弓| 物 pPIC_G6PDH_F 和 pPIC_G6PDH_R 各 1 μ L，釀酒酵母基因組 5 μ L,5 U/ μ L 的 Taq DNA polymerase 0. 5 μ L, ddH20 33. 5 μ L,反應(yīng)總體積 50 μ L ；PCR 反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性 5 min ；94°C 1 min，55°C 1 min，72°C 1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸10 min ；獲得ZWFl基因。
全文摘要
6-磷酸葡萄糖脫氫酶和(S)-羰基還原酶偶聯(lián)提高(S)-苯基乙二醇轉(zhuǎn)化效率的方法，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一株重組畢赤酵母CGMCCNo.4198，及其多批次催化2-羥基苯乙酮，制備(S)-苯基乙二醇的方法。本發(fā)明將釀酒酵母6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因與近平滑假絲酵母(S)-羰基還原酶基因同時(shí)整合至畢赤酵母基因組中，在5%(w/v)葡萄糖的參與下，全細(xì)胞重復(fù)利用10個(gè)批次，不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度和產(chǎn)率始終維持在100%和85%以上。該重組菌株利用多基因共表達(dá)提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化(S)-苯基乙二醇的批次穩(wěn)定性，不僅很好地解除了生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中輔酶再生循環(huán)的制約；同時(shí)也為工業(yè)上多批次、低成本制備(S)-苯基乙二醇提供了一種高效途徑。
文檔編號(hào)C12R1/84GK101993828SQ20101053423
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月8日
發(fā)明者張波濤, 張榮珍, 徐巖, 耿亞維 申請(qǐng)人:江南大學(xué)