專利名稱：一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量急性毒性測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量急性毒性測試方法，屬于環(huán)境檢測和評(píng)價(jià)技術(shù)范疇。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)進(jìn)步和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，越來越多的化學(xué)品被生產(chǎn)和使用，目前已登記的化學(xué)品數(shù)量超過數(shù)千萬種之多，日常使用的化學(xué)品超過10萬種。這些化學(xué)品在生產(chǎn)和使用過程中可能通過多種途徑進(jìn)入環(huán)境，進(jìn)而蓄積在人體、生物體中，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重威脅。為有效管理化學(xué)品、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)環(huán)境樣品的安全性，生物毒性測試逐漸發(fā)展成為一種必不可少且最為直觀有效的方法。發(fā)光細(xì)菌毒性檢測是建立在細(xì)菌發(fā)光生物傳感方法基礎(chǔ)上的毒性檢測技術(shù)，具有快速、經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性好、與魚等其他毒性測試結(jié)果可比性高等諸多優(yōu)勢(shì)。發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光過程是菌體內(nèi)一種新陳代謝的生理過程，發(fā)光的波長在490nm左右。當(dāng)有毒有害物質(zhì)與發(fā)光細(xì)菌接觸時(shí)會(huì)影響發(fā)光菌的新陳代謝，發(fā)光強(qiáng)度的減弱與毒性物質(zhì)的濃度成正比。目前，發(fā)光細(xì)菌法已廣泛應(yīng)用于質(zhì)檢、環(huán)境監(jiān)測、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，被國內(nèi)外多國權(quán)威機(jī)構(gòu)列為標(biāo)準(zhǔn)方法，如 IS011348,GB/T15441-1995,DIN38412 等。傳統(tǒng)的發(fā)光細(xì)菌毒性檢測方法是，在15°C溫度下，以不含毒性物質(zhì)的溶液作為對(duì)照，化學(xué)品或環(huán)境樣品溶液與測試菌液接觸15min后，測定化學(xué)品對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制率。待測樣品的毒性結(jié)果以LID值(達(dá)到一定抑制率時(shí)樣品的稀釋倍數(shù))、EC值(造成一定抑制率時(shí)樣品的濃度)表示。而我國標(biāo)準(zhǔn)GB/T15441-1995中水質(zhì)的毒性水平是以氯化汞的當(dāng)量濃度來表征。然而，傳統(tǒng)的發(fā)光細(xì)菌毒性測試方法或多或少存在一些不足，首先，傳統(tǒng)方法多推薦使用凍干粉保存發(fā)光細(xì)菌菌種，凍干粉菌種的復(fù)蘇過程一般比較費(fèi)時(shí)，快的需要幾個(gè)小時(shí)，慢的需要幾天，這樣需要花費(fèi)較多時(shí)間進(jìn)行菌種的復(fù)蘇或前培養(yǎng)，延長了毒性測試的時(shí)間。其次，大多數(shù)傳統(tǒng)毒性測試方法采用試管作為暴露容器，測試所需的樣品量較大，而且工作菌液的加入量也較多，這樣不可避免地稀釋了待測溶液的濃度，導(dǎo)致結(jié)果不夠準(zhǔn)確。此夕卜，傳統(tǒng)方法測試一般每次可以測試的樣品數(shù)量有限，不利于對(duì)大量樣品的毒性篩查。因此，開發(fā)一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量急性毒性測試方法十分迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服傳統(tǒng)發(fā)光細(xì)菌急性毒性測試中工作菌液前培養(yǎng)時(shí)間長、待測樣品需要量較大、實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間長、難以保證準(zhǔn)確的暴露時(shí)間和暴露濃度、測試誤差較大、難以開展大量樣品的快速篩查等不足，提供一種發(fā)光細(xì)菌快速的復(fù)蘇方法，為有毒化學(xué)污染物和環(huán)境樣品的高通量毒性篩查方法提供技術(shù)保障。本發(fā)明的目的通過以下方式實(shí)現(xiàn)開發(fā)出一種復(fù)蘇溶液，能快速復(fù)蘇以凍干粉、或冷凍保存的發(fā)光細(xì)菌菌種，將保存的菌種接入復(fù)蘇溶液后經(jīng)過一定時(shí)間的攪拌，即可直接
3用于毒性測試；同時(shí)，采用微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，既減少了測試所需樣品的體積，又避免了傳統(tǒng)測試過程中對(duì)待測樣品的不必要稀釋；通過采用多道移液器轉(zhuǎn)移溶液和酶標(biāo)儀檢測發(fā)光強(qiáng)度，既縮短了測試時(shí)間，又提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了高通量化。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面(1)開發(fā)了一種針對(duì)發(fā)光細(xì)菌凍干粉和冷凍保存菌種的復(fù)蘇溶液，可快速復(fù)蘇菌種，無需繁瑣、費(fèi)時(shí)的菌液前培養(yǎng)，即可用于毒性測試；(2)采用微孔板既作為毒性測試中暴露容器，又作為菌液發(fā)光強(qiáng)度的檢測池，減少了測試所需樣品的體積；(3)采用多道移液器轉(zhuǎn)移待測樣品和工作菌液，減少了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間；(4)用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀檢測發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度，加快了檢測速度，也提高了檢測的靈敏度和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；( 采用微孔板測試，可以同時(shí)測定多個(gè)樣品，通過設(shè)定平行樣，降低了實(shí)驗(yàn)誤差，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)現(xiàn)了毒性測試的高通量化。綜上，本發(fā)明通過開發(fā)一種針對(duì)發(fā)光細(xì)菌菌種快速復(fù)蘇的溶液、采用微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，既實(shí)現(xiàn)了菌種的快速復(fù)蘇，又縮短了毒性測試時(shí)間，也提高了測試的靈敏度和測試數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了急性毒性測試方法的快速、準(zhǔn)確和高通量化， 所得測試結(jié)果與原標(biāo)準(zhǔn)方法一致。


圖1.發(fā)光細(xì)菌快速毒性測定法與國標(biāo)方法測試結(jié)果比較圖2.發(fā)光強(qiáng)度隨復(fù)蘇時(shí)間的變化實(shí)施例取一支市售的發(fā)光細(xì)菌凍干粉或冷凍保存的凍存管，在20°C條件下快速解凍，向管中加入LOmL復(fù)蘇溶液，混合均勻后，小心將管中的混合液轉(zhuǎn)入IOOmL復(fù)蘇溶液，在20°C 條件下以500轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌30分鐘。在一只96微孔板上，用8通道移液器向微孔板中移入245 μ L體積的待測樣品溶液，然后再快速向每孔移入5 μ L體積的工作菌液，開始計(jì)時(shí)。15分鐘后在化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀上測試微孔板每個(gè)孔的發(fā)光強(qiáng)度，并記錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量測試方法，屬于環(huán)境檢測和評(píng)價(jià)技術(shù)范疇。通過開發(fā)一種發(fā)光細(xì)菌的復(fù)蘇溶液，能在30分鐘內(nèi)快速復(fù)蘇發(fā)光細(xì)菌的凍干粉或冷凍保存的菌種，復(fù)蘇后的菌液無需前培養(yǎng)即可作為毒性測試的工作菌液。同時(shí)采用微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，縮短了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，減少了待測樣品的用量，加快了測試速度，提高了測試的準(zhǔn)確性，便于推廣應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量測試方法，其特征在于不僅適用于明亮發(fā)光桿菌T3小種、費(fèi)氏弧菌等海洋型菌，也適用于青?；【鹊途?。
3.權(quán)利要求1所述的一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量測試方法，其特征還在于不僅適用于發(fā)光細(xì)菌的凍干粉菌種，也適用于冷凍保存的菌種。
4.權(quán)利要求1所述的一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量測試方法，其特征還在于快速復(fù)蘇溶液的組成，包括氯化鈉、磷酸鹽、氯化鎂、氯化鉀等無機(jī)組分，以及胰蛋白胨、酵母膏、氨基酸、甘油、維生素、葡萄糖等有機(jī)組分。
5.權(quán)利要求1所述的一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量測試方法，其特征還在于采用微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，減小了待測樣品的體積，縮短了實(shí)驗(yàn)操作的時(shí)間，提高了毒性測試的速度和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
6.權(quán)利要求1所述的一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量測試方法，其特征還在于不僅適用于12孔板、M孔板、96孔板、還適用于384孔板。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)光細(xì)菌的快速、高通量急性毒性測試方法，屬于分析檢測與技術(shù)范疇。通過研發(fā)一種發(fā)光細(xì)菌的復(fù)蘇溶液，可在30分鐘內(nèi)將發(fā)光細(xì)菌凍干粉、冷凍保存的菌種快速復(fù)蘇，復(fù)蘇后的菌液無需前培養(yǎng)，攪拌一定時(shí)間后即可作為工作菌液直接用于毒性測試。同時(shí)，選擇微孔板作為毒性測試的暴露容器和檢測池，在孔中加入待測樣品和工作菌液，暴露15分鐘后即可采用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度測試。采用該方法既省去了煩瑣、耗時(shí)的工作菌液前培養(yǎng)程序，又節(jié)省了檢測時(shí)間，降低了成本，提高了測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了毒性測試的高通量化，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102465167SQ20101053705
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者杜宇國, 譚卓威, 魏東斌 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心