專利名稱：一種rpoB基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種rpoB基因 突變檢測特異性引物和液相芯片。
背景技術(shù)：
rpoB 基因(RNA Polymerase β -Subunit Gene)是 RNA 聚合酶 β 亞基的編碼基 因，全長3543個堿基，其中，結(jié)核分枝桿菌耐利福平的分子機(jī)制與rpoB基因相關(guān)，利福平通 過與RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合，從而阻礙RNA的轉(zhuǎn)錄和延伸。此基因編碼507-533氨基 酸位點(diǎn)的核心區(qū)域是禾丨J福平而才藥決定區(qū)(rifampicin resistance-determining region, RRDR)，當(dāng)此區(qū)域發(fā)生突變，包括點(diǎn)突變或短的插入、缺失突變等，DNA依賴性RNA聚合酶β 亞單位酶活性改變，利福平不能與細(xì)菌RNA聚合酶β亞單位結(jié)合，從而表現(xiàn)為耐藥。rpoB基因突變常見單個堿基突變或數(shù)個堿基聯(lián)合突變，約80% -86%的堿基突 變發(fā)生在3個氨基酸位點(diǎn)上即第531位的絲氨酸轉(zhuǎn)換為亮氨酸(TCG — TAC)、第526位 的組氨酸轉(zhuǎn)換為酪氨酸(CAC — TAC)、第526位的組氨酸轉(zhuǎn)換為其他氨基酸。其中，此區(qū)域 65% 86%的突變發(fā)生在第526位的組氨酸突變?yōu)槔野彼岷偷?31位的絲氨酸突變?yōu)榱涟?酸，而且此突變將導(dǎo)致對利福平的高度耐藥。此外還有513、516、529、533、545位點(diǎn)的突變 也會產(chǎn)生高度耐藥，而522位點(diǎn)的突變則產(chǎn)生低水平耐藥。因此，檢測rpoB基因突變情況 具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前對rpoB基因突變的檢測產(chǎn)品主要有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、直接測序法、變性梯 度凝膠電泳、DHPLC等，存在靈敏度低、樣品易污染、假陽性率高、不能確定突變位置、價(jià)格昂 貴等缺點(diǎn)，同時(shí)由于檢測通量的局限性，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供rpoB基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于 檢測 rpoB 基因八種常見突變型 codon513(CAA — AAA)、codon 516 (GAC — GTC)、codon 522 (TCG — TTG)、codon 526 (CAC — TAC/CTC/GAC/CGC)、codon 529 (CGA — CCA)、codon 531 (TCG — TGG/TTG)、codon 533 (CTG — CCG)、codon 545 (CTG — ATG)的野生型和突變型。一種rpoB基因突變檢測液相芯片，主要包括有(A)針對rpoB基因的突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對每 種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對突變位點(diǎn)的特異性引物組成，所述特異性引物 是SEQ IDN0. 21 及 SEQ ID N0. 22、SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28 SEQ ID NO. 31 中的一種以上、SEQ ID NO. 32 及 SEQID NO. 33、SEQ ID NO. 34 及 SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 36 中的一種以上、SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38、和 / 或 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 20中的序列；(B)分別包被有特 的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 41 SEQ ID NO. 60中的序列，所述anti-tag序列能相應(yīng)地 與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序 列；(C)用于擴(kuò)增具有 codon513、codon 516、codon 522、codon 526、codon 529、 codon 531、codon 533、和/或codon 545的突變位點(diǎn)的rpoB基因目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物為SEQ ID N0. 61和SEQ ID N0. 62。優(yōu)選地，所述ASPE引物對為針對codon513突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0. 21組成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 22組成的序列、針對codon 516突變 位點(diǎn)的由SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 23組成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 24組 成的序列、針對codon 522突變位點(diǎn)的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 25組成的序列及由 SEQ IDN0. 6和SEQ ID N0. 26組成的序列、針對codon526突變位點(diǎn)的由SEQ ID N0. 7和SEQ IDN0. 27組成的序列及選自如下至少一種序列由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 28組成的序 列，由 SEQ ID N0. 9 和 SEQ ID N0. 29 組成的序列，由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0. 30 組成 的序列，由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0. 31組成的序列、針對codon529突變位點(diǎn)的由SEQ IDN0. 12和SEQ ID N0. 32組成的序列及由SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 33組成的序列、針 對codon531突變位點(diǎn)的由SEQ ID N0. 14和SEQ ID N0. 34組成的序列及選自如下至少一 種序歹丨J 由 SEQ ID N0. 15 和 SEQ ID N0. 35 組成的序列，由 SEQ ID N0. 16 和 SEQ ID N0. 36 組成的序列、針對codon533突變位點(diǎn)的由SEQ ID N0. 17和SEQ ID N0. 37組成的序列及由 SEQ IDN0. 18和SEQ ID N0. 38組成的序列、和針對codon545突變位點(diǎn)的由SEQ ID N0. 19 和SEQ IDN0. 39組成的序列及由SEQ ID N0. 20和SEQ ID N0. 40組成的序列。優(yōu)選地，所述間隔臂序列為5-10個T。本發(fā)明還提供了一種rpoB基因突變檢測特異性引物，包括有SEQ ID N0. 21及SEQ IDN0. 22、SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28 SEQ ID NO. 31 中的一種以上、SEQ ID NO. 32及 SEQ ID NO. 33、SEQ IDN0. 34 及 SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 36 中的一種以上、SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38、和 / 或 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明所提供的rpoB基因突變檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率 高達(dá)100%，但所需時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于常規(guī)測序方法。所制備的rpoB基因突變檢測液相芯片具 有很好的信號_噪聲比，并且所涉及的探針以及anti-TAG序列之間基本上不存在交叉反 應(yīng)，TAG標(biāo)簽序列、anti-TAG標(biāo)簽序列的選取以及TAG標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，均 能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個突變位點(diǎn)的并行檢測。(2)本發(fā)明所提供的ASPE引物特異性序列，能夠靈敏特異地識別目標(biāo)檢測的突變 位點(diǎn)。在同一個反應(yīng)體系中，不同的特異性序列之間、特異性序列與非目標(biāo)檢測的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，除了能夠單獨(dú)檢測codon 513、codon 516、codon 522或 codon 526等突變情況，也能夠同時(shí)并行檢測多個突變位點(diǎn)的突變情況，檢測效果一致。(3)本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE特異引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種型號的基 因型。(4)本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，8種突變檢測可通過一步PCR即可完成目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高 檢測的準(zhǔn)確率，同時(shí)能夠定性、定量分析的特征。(5)本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高、檢測結(jié)果可重復(fù)性差的缺陷，同 時(shí)對現(xiàn)有的液相芯片進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備的微球能適用于不同的檢測項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的 拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增 強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1rpoB基因突變檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對rpoB基因的8種常見突變位點(diǎn)codon513 (CAA — AAA)、codon 516 (GAC — GTC)、codon 522 (TCG — TTG)、codon 526(CAC — TAC/CTC/GAC/CGC)、 codon 529 (CGA — CCA)、codon 531 (TCG — TGG/TTG)、codon 533 (CTG — CCG)、codon 545 (CTG — ATG)，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性引物序列”組 成。ASPE引物序列如下表所示表1 ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
一種rpoB基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對rpoB基因的突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對突變位點(diǎn)的特異性引物組成，所述特異性引物是SEQ IDNO.21及SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.31中的一種以上、SEQ ID NO.32及SEQID NO.33、SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35～SEQ ID NO.36中的一種以上、SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、和/或SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40；所述tag序列選自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20中的序列；(B)分別包被有特異的anti tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti tag序列選自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.60中的序列，所述anti tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對，且所述anti tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)用于擴(kuò)增具有codon513、codon 516、codon 522、codon 526、codon 529、codon 531、codon 533、和/或codon 545的突變位點(diǎn)的rpoB基因目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rpoB基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物為 SEQID NO. 61 和 SEQ ID NO. 62。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的rpoB基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引 物對為針對codon513突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 21組成的序列及由SEQ IDN0. 2和SEQ ID NO. 22組成的序列、針對codon 516突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDN0. 23組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 24組成的序列、針對codon 522突變 位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 25組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 26組 成的序列、針對codon526突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 27組成的序列及選自 如下至少一種序列由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 28組成的序列，由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 29組成的序列，由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 30組成的序列和由SEQ ID NO. 11和 SEQ IDN0. 31組成的序列、針對codon529突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 32組成 的序列及由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 33組成的序列、針對codon531突變位點(diǎn)的由SEQ IDN0. 14和SEQ ID NO. 34組成的序列及選自如下至少一種序列由SEQ ID NO. 15和SEQ IDN0. 35組成的序列和由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 36組成的序列、針對codon533突變 位點(diǎn)的由 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 37 組成的序列及由 SEQ ID NO. 18 和 SEQ ID NO. 38 組成的序列、和/或針對codon545突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 39組成的序 列及由SEQID NO. 20和SEQ ID NO. 40組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的rpoB基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)ASPE引物對為針對codon513突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 21組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 22組成的序列、針對codon 516突變位點(diǎn)的由SEQ IDN0. 3和SEQ ID NO. 23組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 24組成的序列、針對 codon 522突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 25組成的序列及由SEQ ID NO. 6和 SEQID NO. 26組成的序列、針對codon526突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 27組成 的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 28組成的序列，由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 29 組成的序列，由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 30組成的序列，和由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 31組成的序列、針對codon529突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 32組成的序列及由SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 33組成的序列、針對codon531突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 34組成的序列及由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 35組成的序列，和由 SEQ IDN0. 16和SEQ ID NO. 36組成的序列、針對codon533突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 17和 SEQ IDN0. 37組成的序列及由SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 38組成的序列、和針對codon545 突變位點(diǎn)的由SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 39組成的序列及由SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 40組成的序列；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼 的微球，所述anti-tag序 列選自SEQ ID NO. 41 SEQ ID NO. 60中的序列，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所 選的tag序列互補(bǔ)配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；(C)所述擴(kuò)增引物為SEQID NO. 61和SEQ ID NO. 62。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rpoB基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為 5-10 個 T0
6.一種rpoB基因突變檢測特異性引物，其特征是，包括有SEQ ID N0. 21及SEQ ID N0. 22、SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28 SEQ ID NO. 31 中的一種以上、SEQ ID NO. 32及 SEQ ID NO. 33、SEQ IDN0. 34 及 SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 36 中的一種以上、SEQ ID NO. 37 及 SEQ ID NO. 38、和 / 或 SEQ ID NO. 39 及 SEQ ID NO. 40。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種rpoB基因突變檢測液相芯片和特異性引物，液相芯片主要包括有5’端的tag序列和3’端針對突變位點(diǎn)的特異性引物組成的ASPE引物，所述特異性引物是SEQ IDNO.21及SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.31中的一種以上、SEQ ID NO.32及SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35～SEQ ID NO.36中的一種以上、SEQ ID NO.37及SEQ IDNO.38、和/或SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40；所述tag序列選自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20中的序列；分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100％。所制備的rpoB基因突變檢測液相芯片具有很好的信號-噪聲比，并可實(shí)現(xiàn)多個突變位點(diǎn)的并行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101962686SQ20101053963
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者劉志明, 甘丹翠, 許嘉森, 鄧晶晶 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司