專利名稱：檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的試劑盒及其制備方法，具體地說(shuō)是一種 檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
連接酶可以對(duì)與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)的兩條寡核苷酸片段進(jìn)行連接，進(jìn)而形成一條 較長(zhǎng)的寡核苷酸探針，如果兩條寡核苷酸探針連接處的堿基與目標(biāo)序列不完全互補(bǔ)，那么 連接反應(yīng)就不會(huì)發(fā)生，也就不會(huì)產(chǎn)生較長(zhǎng)的寡核苷酸探針。根據(jù)這一原理，根據(jù)SNP位點(diǎn) 的基因型設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的寡核苷酸探針，可以對(duì)SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)最終產(chǎn) 物的長(zhǎng)度分類，可以確定SNP位點(diǎn)的基因型，這就是連接酶檢測(cè)反應(yīng)(Ligase Detection Reaction)。人類基因組是遺傳信息的最終載體，人類個(gè)體之間的差異根本原因也在于基因組 序列的差異。單核苷酸多態(tài)性(SNP)正是表征這種差異的常用的遺傳標(biāo)記，在人類基因組 上大概每一千個(gè)堿基對(duì)，就包含有一個(gè)SNP。雙生子實(shí)驗(yàn)等證明，精神分裂是一種復(fù)雜的遺 傳疾病，遺傳度高達(dá)80%左右?，F(xiàn)代遺傳學(xué)研究表明，各種遺傳疾病都會(huì)被某些SNP位點(diǎn) 所表征，也就是說(shuō)，某些SNP位點(diǎn)與遺傳疾病呈現(xiàn)出關(guān)聯(lián)性。全基因組關(guān)聯(lián)研究的出現(xiàn)，更 為尋找關(guān)聯(lián)位點(diǎn)提供了有力的技術(shù)支持。這些強(qiáng)關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)可以作為一種患病風(fēng)險(xiǎn)的表 征?，F(xiàn)在對(duì)SNP位點(diǎn)的分型，常用的方法有AB公司的TaqMan探針技術(shù)，測(cè)序技術(shù)等。 TaqMan探針要從AB公司定制，周期較長(zhǎng)而且價(jià)格較為昂貴。測(cè)序技術(shù)雖然結(jié)果較為可靠， 但是對(duì)特定位點(diǎn)的SNP分型，該方法相對(duì)成本較高，花費(fèi)時(shí)間也比較長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試 劑盒及其制備方法，本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，成本低廉，針對(duì)精神分裂而開(kāi)發(fā)。結(jié)果可靠，穩(wěn)定性 好，靈敏度高。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒，包括PCR試劑組和LDR(連接酶檢 測(cè)反應(yīng))試劑組，兩個(gè)試劑組包裝在同一個(gè)盒子中，PCR試劑組，包括緩沖液、dNTP混合液、 Taq DNA聚合酶、純水和四對(duì)PCR專用擴(kuò)增引物；LDR試劑組，包括緩沖液、dNTP混合液、 Taq DNA連接酶、純水和四組LDR專用探針。所述的PCR試劑組，緩沖液濃度為正常工作濃度的十倍，dNTP混合液的濃度為 IOmM, Taq DNA聚合酶的濃度為2unit/ul，四對(duì)PCR擴(kuò)增引物為2 OD的干粉，使用時(shí)，先 SOOOrpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，震蕩均勻后可以使用。所述的LDR試劑組，緩沖液濃度為正常工作濃度的十倍，Taq DNA聚合酶的濃度為 40unit/ul,四對(duì)PCR擴(kuò)增引物為2 OD的干粉，使用時(shí)，先8000rpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，混合均勻后可以使用。本發(fā)明還涉及如上述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，包括以下步 驟①PCR引物的設(shè)計(jì)及合成PCR引物采用引物設(shè)計(jì)軟件raiMER3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，TM 值選擇60度左右。②LDR探針的設(shè)計(jì)及合成LDR探針每個(gè)位點(diǎn)包括三條，兩條5’端探針和一條3’
端探針。a.兩條5’端探針長(zhǎng)度相差2個(gè)堿基，該差別反映在該探針的5’端b.兩條5’端探針的3’端的最后一個(gè)堿基根據(jù)SNP位點(diǎn)的基因型確定c.兩條5’端探針在距3’端6個(gè)堿基的位置認(rèn)為引入與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的一個(gè)堿 基，目的是增大檢測(cè)的準(zhǔn)確度d. 5’端探針的5’末端及3’端探針的3’末端均采用polyT的序列，目的是使產(chǎn)物 達(dá)到利于檢測(cè)的長(zhǎng)度。e.除上述三點(diǎn)描述外，5’端探針的其他位置與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)f. 3’端探針與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)，且在其5’端加磷酸修飾，其3’端加FAM熒光修 飾③Taq DNA聚合酶和Taq DNA連接酶選用市售TAKARA的產(chǎn)品或New England Biolabs的產(chǎn)品(配套試劑(如緩沖液，dNTP等)均選用市售常用試劑之)。所述的PCR引物的設(shè)計(jì)及合成中每個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物的序列如下
權(quán)利要求
一種檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒，其特征在于，包括PCR試劑組和LDR試劑組，其中PCR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA聚合酶，純水，四對(duì)PCR專用擴(kuò)增引物；LDR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA連接酶，純水，四組LDR專用探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒，其特征是，所述的PCR試劑 組，dNTP混合液的濃度為10mM，Taq DNA聚合酶的濃度為2unit/ul，四對(duì)PCR擴(kuò)增引物為2 OD的干粉，使用時(shí)，先SOOOrpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，震蕩均勻后可以使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1中所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒，其特征是，所述的LDR 試劑組，Taq DNA聚合酶的濃度為40unit/ul，四對(duì)PCR擴(kuò)增引物為2 OD的干粉，使用時(shí)，先 SOOOrpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，混合均勻后可以使用。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟①PCR引物的設(shè)計(jì)及合成PCR引物采用引物設(shè)計(jì)軟件raiMER3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，TM值選 擇60度左右；②LDR探針的設(shè)計(jì)及合成LDR探針每個(gè)位點(diǎn)包括三條，兩條5’端探針和一條3’端探針；③TaqDNA聚合酶和Taq DNA連接酶采用TAKARA的產(chǎn)品或New England Biolabs的Φ 口廣 BFI ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針兩條5’端探針長(zhǎng)度相差2個(gè)堿基，反映在該探針的5’端。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針兩條5’端探針的3’端的最后一個(gè)堿基根據(jù)SNP位點(diǎn)的基因型確定。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針兩條5’端探針在距3’端6個(gè)堿基的位置認(rèn)為引入與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的一 個(gè)堿基，目的是增大檢測(cè)的準(zhǔn)確度。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針5’端探針的5’末端及3’端探針的3’末端均采用polyT的序列，目的是使 產(chǎn)物達(dá)到利于檢測(cè)的長(zhǎng)度。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針除上述三點(diǎn)描述外，5’端探針的其他位置與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所 述的LDR探針3’端探針與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)，且在其5’端加磷酸修飾，其3’端加FAM熒 光修飾。
全文摘要
一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)精神分裂關(guān)聯(lián)基因的試劑盒及其制備方法。試劑盒PCR試劑組和LDR試劑組，其中PCR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA聚合酶，純水，四對(duì)PCR專用擴(kuò)增引物；LDR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA連接酶，純水，四組LDR專用探針。制備方法包括PCR引物的設(shè)計(jì)及合成PCR引物采用引物設(shè)計(jì)軟件PRIMER3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，TM值選擇60度左右；LDR探針的設(shè)計(jì)及合成LDR探針每個(gè)位點(diǎn)包括三條，兩條5’端探針和一條3’端探針；Taq DNA聚合酶和Taq DNA連接酶采用TAKARA的產(chǎn)品或New England Biolabs的產(chǎn)品。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)精神分裂關(guān)聯(lián)基因內(nèi)特定SNP位點(diǎn)的快速、高效、準(zhǔn)確的分型。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101985659SQ20101054312
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月13日
發(fā)明者馮國(guó)鄞, 師詠勇, 李志強(qiáng), 李濤, 賀林 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)