專利名稱：畢赤酵母菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法、菌劑及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一株畢赤酵母菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法和菌 劑及菌劑的生產(chǎn)方法，還涉及畢赤酵母菌的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物根際或自身中存在著一些有益細(xì)菌，它們可以通過直接或間接的方式對由 病原菌引起的植物病害起到防治作用，這些能夠防治病害、增加作物產(chǎn)量的微生物統(tǒng)稱 為生防菌(biocontrol bacteria)。生防菌對土壤中的有害病原微生物以及非寄生性根際有害 微生物具有生物防治作用。生防菌具有拮抗效果好、不產(chǎn)生毒素、可與化學(xué)殺菌劑共同 使用等優(yōu)點(diǎn)而成為病害防治研究的熱點(diǎn)。目前化學(xué)殺菌劑處理和簡易貯藏仍是我國控制果蔬采后損失的主要方法。但長 期使用殺菌劑，容易導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生，用藥量不斷加大，造成果蔬上農(nóng)藥殘留 量增加，直接威脅人類健康，這已成為當(dāng)今公眾最關(guān)注的食品安全問題之一。因而，尋 求一種能代替化學(xué)農(nóng)藥的安全、無毒、經(jīng)濟(jì)、有效的保鮮新技術(shù)、新方法已成為當(dāng)務(wù)之 急。果蔬采后生物防治技術(shù)是利用微生物之間的拮抗作用，選擇對農(nóng)產(chǎn)品不造成危害 的微生物或產(chǎn)物來抑制引起采后腐爛的病原微生物的生長，從而減少采后損失，近年來 被證明是最有效、最具發(fā)展?jié)摿Φ囊环N保鮮方法。酵母菌作為果蔬生物防治拮抗菌的 最大優(yōu)點(diǎn)是它能在較干燥的果蔬表面生存，可迅速利用營養(yǎng)進(jìn)行繁殖，受殺蟲劑的影響 小。且酵母菌不產(chǎn)生抗生素，能夠避免病原菌對抗生素產(chǎn)生抗性而降低生物防治的抑病 效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株具有防治病害作用的酵母菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法，還提 供以該酵母菌為活性成分的菌劑及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用。一種畢赤酵母菌，保藏編號為CGMCC No.4273。本發(fā)明所提供的畢赤酵母 (Pichiapastoris) CHOl細(xì)胞形態(tài)較大，直徑16 22 μ m，呈圓形或卵圓形，細(xì)胞為多端芽 殖菌株。菌落圓形，較小，濕潤，光滑，乳白色，不透明，邊緣整齊，質(zhì)地均勻，中部 不隆起。子囊為圓形或長橢圓形，每一個子囊內(nèi)含3個子囊孢子，子囊孢子為圓形。不 產(chǎn)生擲孢子。產(chǎn)生假菌絲，呈叢枝狀。其生理生化特性為葡萄糖、蔗糖、乳糖、半 乳糖均能發(fā)酵，不能同化可溶性淀粉，能同化麥芽糖、水解乳糖和D-木糖。同化氮源 NaNO3> Ca(N03)2、KNO30不能同化肌醇和山梨醇，能同化甘露醇，乙醇；產(chǎn)酯產(chǎn)類 淀粉；不能使牛奶胨化，不能分解尿素，但能通過耐高滲透壓測試。本發(fā)明還提供一種所述畢赤酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)將經(jīng)活 化的畢赤酵母菌接種到該菌常用發(fā)酵培養(yǎng)液中，培養(yǎng)得到種子液；2)將步驟1)制備的種 子液接種到該菌專用發(fā)酵培養(yǎng)基中，通氣培養(yǎng)，得到畢赤酵母菌菌液；步驟1)中畢赤酵母菌常用發(fā)酵培養(yǎng)液配方每IOOOmL水中馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，pH6.0。步驟2)中畢赤酵母菌專用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為每IOOOrnl水中含玉米粉5g，豆 餅粉 5g，花生粉 5g，KH2PO4 2.5g, MgSO4 0.25g, CaCl2 0.25g,尿素 0.24g，紅糖 5g， pH 5.5。所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，所述步驟1)中對所述畢赤酵母菌菌株進(jìn)行活化的方法 為將該菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，在20-30°C下培養(yǎng)48h;所述PDA培養(yǎng)基的配方 為每IOOOml水中含馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，pH6.0。所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，所述畢赤酵母菌專用發(fā)酵培養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分比 濃度為0.28%的聚丙烯聚乙烯甘油醚。所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，所述步驟1)中培養(yǎng)條件為在25°C、pH6.0、150r/min 下振蕩培養(yǎng)36-48h。所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，步驟2)中的接種比例為2%。所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，所述步驟2)的通氣培養(yǎng)是在25°C，pH 5.5的條件下，裝 液量為20%，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時間為72_96h。本發(fā)明還提供一種以畢赤酵母菌為活性成分的菌劑。本發(fā)明還提供一種權(quán)利要求8所述菌劑的生產(chǎn)方法，將畢赤酵母菌(CHOl)的菌 液注入經(jīng)滅菌處理的2.5%海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻；用蠕動泵將酵母的海藻酸鈉懸浮 液逐滴滴入經(jīng)滅菌的含4% CaCl2水溶液中，即可獲得直徑約為3mm的海藻酸鈣凝膠的固 定化酵母球形顆粒。采用這種固定化酵母方法，顆粒大小均勻、方法簡單、速度快，便 于大規(guī)模生產(chǎn)。將含酵母的海藻酸鈣小球置于培養(yǎng)液中增殖，經(jīng)分析夕小球中酵母密度 高達(dá)1.92 X IO9個酵母/ml。所述的畢赤酵母菌可以在防治蔬菜瓜果采收前和采收后病害中應(yīng)用。畢赤酵母菌(Pichia pastoris)發(fā)酵周期短，其菌劑制備工藝簡單，具有工業(yè)化生 產(chǎn)的可能性。本發(fā)明在果蔬采后病害的生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有百分比濃度均為質(zhì)量 百分比濃度，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為水。實施例1PDA培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL水中含馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，
pH6.0。PDA培養(yǎng)液的配方為不加瓊脂，其他同上。畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl專用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為每IOOOmL水中含玉米粉 5g，豆餅粉 5g，花生粉 5g，KH2PO4 2.5g, MgSO4 0.25g, CaCl2 0.25g,尿素 0.24g，紅糖 5g, pH5.50實施例2、畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl的保藏及其發(fā)酵培養(yǎng)1、菌種的保藏畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)甜瓜表面，已于2010年11月
01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.4273;參據(jù)的生物 材料CHOl ；分類命名巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。2、畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl的發(fā)酵畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)菌種的活化將畢赤酵母菌(Rpastoris) CHOl菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，在25°C下培養(yǎng)48h。2)種子罐培養(yǎng)將步驟1)經(jīng)活化的畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl接種到該菌常用發(fā)酵培養(yǎng)液 PDA中，在25°C、pH6.0、150r/min下振蕩培養(yǎng)36_48h，得到種子液。3)發(fā)酵罐培養(yǎng)將步驟2)制備的種子液按2%接種比例接種到該菌專用發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 25°C pH5.5的條件下，裝液量為20%，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)72_96h即可到達(dá)培養(yǎng)終 點(diǎn)，得到畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl菌液。實施例3、檢測畢赤酵母菌(Pichia pastoris)CHOl對果蔬采前及采后防治效果的
試驗以甜瓜鐮刀菌果腐病(Fusarium spp.)為例(1)檢測畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl對甜瓜采后病害的田間防治效果，具體方 法為試驗設(shè)兩個處理分別為空白對照和生防畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl處理。3次 重復(fù)共6個小區(qū)，小區(qū)隨機(jī)排列，每個小區(qū)保證有十株生長良好健壯的甜瓜植株。在甜 瓜開花期和坐果期分別進(jìn)行生防畢赤酵母(Rpastoris)CHOl菌液的噴施，生防菌濃度為 lX108CFU/mL。在甜瓜成熟后，分別裝入紙箱中，室溫下保存。結(jié)果經(jīng)畢赤酵母菌 (Rpastoris)CHOl菌液處理的甜瓜防治效果達(dá)46.88%(2)檢測畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl對甜瓜采后病害的室內(nèi)防治效果，具體方 法為:選取成熟度一致大小均勻的甜瓜先用60°C熱水浸泡3min后取出，室溫下自然晾 干。然后將晾干的甜瓜分別放入濃度為IX IO8CFUAnl酵母菌CHOl的菌懸液中，IOmin 后取出，室溫下自然晾干。晾干后分類裝入紙箱中室溫下保存，觀察記錄發(fā)病時間及發(fā) 病數(shù)并計算發(fā)病率。此實驗共兩個處理3次重復(fù)，10顆甜瓜為一次重復(fù)，將用60°C熱水 浸泡并晾干后沒用生防菌處理的設(shè)為對照。結(jié)果經(jīng)畢赤酵母菌(Rpastoris)CHOl菌液處理 的甜瓜防治效果達(dá)57.17%。上述試驗結(jié)果均表明本發(fā)明的畢赤酵母菌(Pichiapastoris)CHOl可顯著降低甜瓜 的發(fā)病率，延長貯藏時間。實施例4實驗證明該菌株對甜瓜采后病害，如鐮刀菌果腐病(Fusarium spp.)、軟腐病 (Rhizopus spp.) > 鏈格孢斑點(diǎn)病(Alternaria spp.) > 霉腐病(Cladosporium spp.)等具有顯
著的防治效果；溫室盆栽和田間試驗證明該菌株可以對馬鈴薯晚疫病具有顯著的防治效
果 ο防治植物病害的主要機(jī)制是其良好的植物果面、葉面定殖能力和抑制病原菌各 類孢子萌發(fā)的能力。植物病理生理學(xué)研究表明該菌株防治甜瓜采后病害的主要機(jī)制首先 是生防酵母菌與病原菌在傷口處的營養(yǎng)和空間競爭，其次生防酵母菌能夠通過誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性物質(zhì)抑制病原菌的生長。畢赤酵母菌(Pichia pastoris) CHOl發(fā)酵周期短，其菌劑 制備工藝簡單，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。本發(fā)明在果蔬采后病害的和控制馬鈴薯晚疫 病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景 應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變 換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種畢赤酵母菌，保藏編號為CGMCC No.4273。
2.—種如權(quán)利要求1所述畢赤酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將經(jīng)活化的畢赤酵母菌接種到該菌常用發(fā)酵培養(yǎng)液中，培養(yǎng)得到種子液；2)將步驟1) 制備的種子液接種到該菌專用發(fā)酵培養(yǎng)基中，通氣培養(yǎng)，得到畢赤酵母菌菌液；步驟1)中畢赤酵母菌常用發(fā)酵培養(yǎng)液配方每IOOOmL水中馬鈴薯200g，葡萄糖 20g, pH 6.0 ；步驟2)中畢赤酵母菌專用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為每IOOOmL水中含玉米粉5g，豆餅 粉 5g，花生粉 5g，KH2PO4 2.5g, MgSO4 0.25g, CaCl2 0.25g,尿素 0.24g，紅糖 5g，pH 5.5ο
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟1)中對畢赤酵母菌 菌株進(jìn)行活化的方法為將該菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，在20-30°C下培養(yǎng)48h;所述 PDA培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL水中含馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，pH6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述畢赤酵母菌專用發(fā)酵培 養(yǎng)基中還添加有質(zhì)量百分比濃度為0.28%的聚丙烯聚乙烯甘油醚。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟1)中培養(yǎng)條件為 在 25°C、pH6.0、150r/min 下振蕩培養(yǎng) 36-48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)中的接種比例為2%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟2)的通氣培養(yǎng)是在 25°C, pH 5.5的條件下，裝液量為20%，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時間為72_96h。
8.一種以權(quán)利要求1所述畢赤酵母菌為活性成分的菌劑。
9.一種權(quán)利要求8所述菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于，將所述畢赤酵母菌的菌液注入 經(jīng)滅菌處理的2.5%海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻；用蠕動泵將酵母的海藻酸鈉懸浮液逐滴 滴入經(jīng)滅菌的含4% CaCI2水溶液中，即可獲得直徑約為3mm的海藻酸鈣凝膠的固定化酵 母球形顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的畢赤酵母菌在防治蔬菜瓜果采收前和采收后病害中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株畢赤酵母菌(Pichia pastoris)CH01及其發(fā)酵培養(yǎng)方法與應(yīng)用。畢赤酵母菌CH01，保藏編號為CGMCC No.4273。畢赤酵母菌CH01的發(fā)酵培養(yǎng)方法，1)將經(jīng)活化的畢赤酵母菌CH01接種到該菌常用發(fā)酵培養(yǎng)液中，培養(yǎng)得到種子液；2)將步驟1)制備的種子液接種到該菌專用發(fā)酵培養(yǎng)基中，通氣培養(yǎng)，得到畢赤酵母菌CH01菌液。畢赤酵母菌(Pichia pastoris)CH01發(fā)酵周期短，其菌劑制備工藝簡單，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。本發(fā)明在果蔬采后病害的控制和馬鈴薯晚疫病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/84GK102021123SQ20101054325
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者周洪友, 宋娟, 張一名, 李小娟, 楊繼峰, 王丹 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)