專利名稱：食品中三種致病菌的多重熒光定量pcr同時快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于食品質量安全檢測技術領域，具體涉及應用多重熒光定量PCR法對食 品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的同時快速檢測方法及其應用。
背景技術：
金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌是三種常見的食源性致病菌，也是我國食 品國家衛(wèi)生標準中致病菌檢測的三項強制指標。其中金黃色葡萄球菌是引起人類化膿性感 染最常見的致病菌；沙門氏菌作為人畜共患的的腸道致病菌，其導致的食物中毒數(shù)量一直 處于世界食物中毒病例前列；志賀氏菌通稱痢疾桿菌，是引起人類細菌性痢疾的主要病原 菌。目前，國家標準中對上述致病菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)、生化鑒定的方 法，步驟復雜、檢測周期長，已不能完全適應大規(guī)?？焖贆z測的需要。近年來，隨著微生物分 子生物學的發(fā)展，PCR和實時熒光定量PCR技術為食品中致病菌的高通量快速檢測開辟了 新的途徑，相關的方法學研究國內外已有大量探索。然而，針對我國各類食品國標中均須 強制檢驗的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌三種致病菌，其同時檢測的多重熒光定量 PCR方法尚未見報導。此外，目前國內對食品中致病菌的熒光定量PCR檢測研究均缺乏陽性 內參(IPC)對反應體系進行監(jiān)控。因此，建立以多重熒光定量PCR為基礎的食品中金黃色 葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的快速同時檢測方法將對食品安全的快速監(jiān)管具有重要的 創(chuàng)新性實踐意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的問題包括首先，探索食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀 氏菌三種目標致病菌的同時快速增菌策略，并選擇穩(wěn)定高效的細菌基因組DNA提取方法； 然后，根據(jù)三種致病菌的保守基因分別設計引物和Taqman熒光探針，并自行設計、構建作 為陽性內參的重組DNA作為PCR反應的質控；最后，進行多重熒光定量PCR檢測方法優(yōu)化及 特異性、靈敏度考察，并應用此方法對大量食品盲樣進行檢測以驗證其實用價值。本發(fā)明中，我們從金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌基因組中保守序列出發(fā)， 探索并完善了食品中這三種致病菌同時快速檢測的多重Taqman熒光定量PCR檢測方法，并 設計了陽性內參確保檢測的可靠性。本發(fā)明彌補了這三種重要食源性致病菌同時快速檢測 的技術空白，為食品中致病菌污染的控制探索了新的途徑。本發(fā)明的技術方案包括1.通過使用不同配比的混合培養(yǎng)基對食品中的三種目 標致病菌進行共增菌，通過比較增菌效果確認最佳的培養(yǎng)基配比。2.比較多種細菌基因組 總DNA提取方法所提取的培養(yǎng)液中DNA的濃度與純度，確認最佳的提取方法。3.設計并合 成多重熒光定量的引物與Taqman探針，設計并構建重組陽性內參DNA。4.針對提取的細菌 基因組總DNA進行多重熒光定量PCR檢測，考察方法的特異性與靈敏度。5.對大量食品樣 品進行盲樣檢測驗證多重熒光定量PCR方法的實用性。
1.將三種目標致病菌各IX 101 cfu同時于不同配比的革蘭氏陰性菌通用GN培 養(yǎng)基/7.5% NaCl肉湯混合培養(yǎng)基中快速擴增，并使用傳統(tǒng)國標方法計數(shù)。由表1中可見， 當混合培養(yǎng)基體積比為2:1時，可于6小時內將三種致病菌同時擴增至106 cfu/ml ；當配比 小于2:1時，金黃色葡萄球菌的擴增占顯著優(yōu)勢，沙門氏菌和志賀氏菌生長受到抑制；當配 比大于2:1則反之。因此，為適應同時定性檢測的需要，確定GN培養(yǎng)基和7.5% NaCl肉湯 的體積比為2:1，37°C振搖培養(yǎng)6 h為食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌同時快 速增菌的最佳條件。表1.快速共增菌后的細菌計數(shù)(cfu/ml)
GN/7. 5%NaCl 肉湯(V/V)1:31:21:12:13:1沙門氏菌2. 1X1043. 9X1042. 9X1053. 3X1066. 2X107金黃色葡萄球菌4. 2X1086. 8X1073. 3X1077. 1X1069. 5X104志賀氏菌3. 8X1055. 5X1059. 1X1055. 2X1067. 6X107
2.分別使用Qiagen公司柱離心式細菌基因組快速提取試劑盒和溶菌酶-蛋白酶K法 手工提取細菌基因組DNA，測定濃度與純度后表明，柱離心法提取后DNA濃度均達0. 5Pg/ML 以上，且0D260/0D280在1. 75-1. 85之間；而手工抽提后溶于同樣體積的DNA濃度僅有約 0. 2Pg/ML左右，0D260/0D280在1. 85-1. 90之間。因此，使用Qiagen柱離心式細菌基因組 DNA快速提取試劑盒較溶菌酶_蛋白酶K法具有更高的提取效率，且DNA純度更高。通過提 取10倍梯度稀釋的細菌培養(yǎng)物中的基因組DNA證明，當細菌濃度在104-108之間時，使用進 口柱離心式試劑盒可使基因組DNA提取效率保持穩(wěn)定，且對G+和G_菌無明顯差異。因此， 本發(fā)明選擇Qiagen柱離心式試劑盒為提取細菌的基因組DNA的最佳方法。
3.本發(fā)明分別根據(jù)沙門氏菌的復制原點C基因、金黃色葡萄球菌的Nuc基因、志 賀氏菌的IpaH基因設計了用于多重熒光定量PCR檢測的擴增引物和Taqman探針，分別使 用熒光基團FAM、TAMARA及CY5作為探針的發(fā)光基團，以對應于熒光定量PCR儀的不同波長 段用于同時檢測。引物與探針序列見表2。 表2.熒光定量PCR引物與探針序列
目標致病菌引物與探針序列(5 to 3，)目標基因正向:CGCTACTAGTTGCTTAGTGTTAACTTTAGTTGjfffF金黃色葡萄球菌反向:TGCWZTATATACTGTTG'SATCTTCAGAA(342-438,探針:FAW-TGCATCACAAACAGATAACGGCCTAMTAGMCt-BHQ 197bp)正向:TTATTAOJATCGCGCCAtKCOtj'C沙門ft菌反向:GGACCACGATCACCCrATC(165-264,探針:TMM-TCMIGCGTTGGAMGGATCACTAGCTGT-BmZlOObp)正向:TCCGATACCCTCTCTGCACGCMTIpalf\ 志Sift菌反向:AGCGAAAfJACTGCTGTCClMGCTC(280-384,探針:CY5-ATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATG :TG-BHa2105bp)陽性內參(IPC)探針:J0I-TCCTCCTGCATCAGAGGTGCTTCGA-BH32重組序列
4用于監(jiān)控多重熒光定量PCR擴增的陽性內參DNA構建流程見附

圖1。重組質粒 PUC57-IPC經測序，其序列與設計完全吻合。用于擴增陽性內參的Taqman探針序列見表2。 將雙酶切后回收的內參小片段用雙蒸水梯度稀釋后分別加入多重熒光定量PCR反應體系 進行擴增，選擇Ct值為35左右的稀釋度為實際使用的陽性內參濃度。4.將42種已知菌株快速擴增并提取總DNA后，分別使用單重和多重熒光定量PCR 方法對目標致病菌進行檢測，同時加入陽性內參及其探針監(jiān)控反應體系。使用特異性引物 /探針對相應目標致病菌進行單重熒光定量PCR反應，均由相應的報告基團在35個循環(huán)內 出現(xiàn)典型的擴增曲線；使用混合引物/探針對42種已知菌株進行多重熒光定量PCR檢測， 其檢測結果也與設計完全相符三種目標致病菌均由相應報告基團出現(xiàn)顯著擴增，且未出 現(xiàn)其他擴增，對除目標致病菌外的其他細菌的多重熒光定量PCR檢測均未見任何擴增。陽 性內參DNA在多重熒光定量PCR體系中擴增的Ct值均保持在35左右。對42種已知單菌 株進行多重熒光定量PCR檢測的特異性考察結果見表3 ；對三種目標致病菌標準菌株單重 和多重熒光定量PCR檢測的典型擴增曲線見附圖2。同時，對隨機制備的兩種以上已知標準菌株同時污染的樣本21份進行多重熒光 定量PCR檢測也表明，不同目標致病菌的基因組DNA未對檢測產生交叉干擾，不同組合的目 標致病菌均可被同時檢出，且未出現(xiàn)未預知的其他擴增。表3多重熒光定量PCR檢測的特異性考察
權利要求
一種對食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進行同時快速檢測的多重熒光定量PCR方法，其特征是由以下步驟構成 (1)應用一定配比的含7.5%氯化鈉肉湯和GN的混合培養(yǎng)基對含有上述致病菌的食品進行快速同時增菌，并使用離心柱式細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)液中的細菌基因組總DNA； (2)應用根據(jù)沙門氏菌的復制原點C基因、金黃色葡萄球菌的Nuc基因、志賀氏菌的IpaH基因設計的擴增引物和Taqman探針對上述細菌基因組總DNA進行多重熒光定量PCR同時檢測，并使用自行設計的重組DNA片段作為陽性內參監(jiān)控反應體系，根據(jù)分別代表三種致病菌的熒光信號在一定循環(huán)數(shù)內是否出現(xiàn)顯著擴增判定食品中是否存在上述致病菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的對食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進行同時 快速檢測的多重熒光定量PCR方法，其特征在于在檢測中使用自行設計并構建的重組陽 性內參DNA片段，內參的擴增片段結合了本發(fā)明中志賀氏菌熒光定量PCR檢測的引物結合 序列與人對氧磷酶基因的小片段，為原核基因與真菌來源的真核基因的重組基因片段，與 食品中細菌基因組DNA及其他DNA成分的同源性很低，確保了其在多重熒光定量PCR體系 中的獨立性，有效防止假陰性檢測結果的出現(xiàn)，與市售的陽性內參相比，反應體系中減少了 一對內參引物，降低了對多重熒光定量PCR體系產生干擾的風險，用于本發(fā)明及所有包含 志賀氏菌為目標致病菌的單重或多重熒光定量PCR檢測的反應體系監(jiān)測。
3.權利要求1所述食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進行同時快速檢測 的多重熒光定量PCR方法在食品質量控制和質量安全檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品質量安全檢測技術領域。具體涉及應用快速共增菌、細菌基因組提取、多重Taqman熒光定量PCR的流程對食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進行同時快速檢測，并設計用以保證檢測結果準確性的重組陽性內參DNA監(jiān)控PCR反應。結果表明，以上方法具有良好的針對目標致病菌的特異性，檢測限可達101cfu/PCR反應，且反應體系各組分間未見交叉干擾。對人工污染的食品盲樣檢測驗證了方法的實用性。陽性內參DNA有效地保證了檢測的可靠性，避免了假陰性結果的出現(xiàn)。總之，本發(fā)明建立了一種食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌同時快速檢測的多重熒光定量PCR方法，為食源性致病菌的高通量檢測提供了新的方法。
文檔編號C12Q1/10GK101974641SQ20101055013
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權日2010年11月19日
發(fā)明者凌睿, 劉新梅, 周駿貴, 張馳, 楊軍 申請人:南京市產品質量監(jiān)督檢驗院