專利名稱：熒光pcr法對食品中葡萄球菌腸毒素的快速檢測與分型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品科學(xué)與技術(shù)中的微生物毒素的分子檢測領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用熒光 定量PCR法對食品中葡萄球菌腸毒素的11種血清型基因進行快速高通量檢測與分型方法 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌CJia/^j^ococcm aare^s，金葡菌)是最常見的食源性致病菌 之一，其不僅導(dǎo)致大量的食物中毒與化膿性感染病例，并可造成爆發(fā)性流行。金葡菌的毒 力因子包括入侵時產(chǎn)生的多種蛋白，如耐熱核酸酶、透明質(zhì)酸酶、脂肪酶、溶血素及腸毒素 等。其中，葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin, SE)是引起人類食物中毒和感 染性休克的關(guān)鍵致病因子，其本質(zhì)是與抗原遞呈細胞的主要組織相容性復(fù)合物II (MHCII) 通過T細胞受體結(jié)合的超級抗原，結(jié)合后導(dǎo)致T細胞大量增殖及細胞因子釋放，從而引起 嘔吐與中毒性休克等癥狀。在不考慮僅能引起中毒性休克而不能引起食物中毒的類腸毒 素(SEL)的前提下，葡萄球菌腸毒素分為11種血清型，除上世紀(jì)六十年代確認的五種(SEA、 SEB、SEC、SED, SEE)外，近年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了 6 種，包括 SEG、SHE、SEI、SER、SES、SET。近年來的研究表明，不同的葡萄球菌腸毒素血清型在宿主類別、致病能力、分布情 況、時序性表達等方面均具有很大的差異，流行病學(xué)調(diào)查也證明了不同的金葡菌性食物中 毒爆發(fā)流行是由于不同類別的腸毒素血清型而引起的。如2009年末，法國就爆發(fā)了大規(guī)模 的腸毒素E導(dǎo)致的食物中毒。目前在歐美發(fā)達國家，對金葡菌性食物中毒的風(fēng)險評價和診 斷已精確到腸毒素血清型的水平。因此，對食品中金葡菌腸毒素血清型的鑒定與分型具有 重要的現(xiàn)實意義，分型方法的準(zhǔn)確性、靈敏度、速度與通量均對食品安全檢測與預(yù)警的水平 具有顯著的決定性影響。目前在我國，對食品中葡萄球菌腸毒素檢測與分型的方法主要有兩種免疫法與 PCR法。免疫法以酶聯(lián)免疫分析法與VIDAS法為代表，每次只能特異性檢測1種或幾種腸毒 素，且完全不能對多種腸毒素血清型進行區(qū)分；現(xiàn)有的PCR法均采用針對不同腸毒素血清 型的特異性引物進行PCR擴增，并進行電泳檢測，通過區(qū)分條帶分子量大小對腸毒素進行 分型。如申請?zhí)枮?00910071033. 4的發(fā)明專利“葡萄球菌腸毒素基因型的檢測方法及基因 分型的檢測方法”即采用上述方法，其弊端包括檢測時間長，PCR擴增加電泳檢測須花費3 小時以上；檢測通量小，每次電泳檢測最多只能檢測十幾個樣品中的一種腸毒素或一個樣 品中的十幾種腸毒素；電泳檢測使用的熒光染料對操作者健康危害極大；未對可導(dǎo)致食物 中毒的11種腸毒素進行專門區(qū)分，而將腸毒素與類腸毒素混為一談等等。在上述的研究背景下，建立以熒光定量PCR的自動檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的食品中11種 可導(dǎo)致食物中毒的腸毒素血清型的快速高通量分型方法，將對食品安全的快速評價和風(fēng)險 預(yù)測具有重要的實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題包括首先，對于各類金黃色葡萄球菌血漿凝固酶呈陽性 的食品樣本，在無菌狀態(tài)下提取其中的總DNA成分，解決提取的效率與純度問題；然后，根 據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的不同腸毒素血清型基因sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、 sei、ser、ses、set的特征序列設(shè)計特異性引物，針對上述提取的總DNA，使用ABI 7500 FAST熒光定量PCR儀的快速模式進行這11種葡萄球菌腸毒素基因的STOR Green熒光定量 PCR檢測與分型，并應(yīng)用VIDAS酶聯(lián)熒光自動分析儀對含有sea、seb、sec、sed、see的樣品 進行方法學(xué)驗證，從而為各類食品的金葡菌性食物中毒風(fēng)險提供評價依據(jù)。本發(fā)明中，我們?yōu)槭称分械闹匾虏∫蜃悠咸亚蚓c毒素的分型提供了一種高 效、快速、簡便、靈敏的STOR Green熒光定量PCR方法，該方法與原有方法相比，在檢測速 度、檢測通量、靈敏度、安全性等方面均具有顯著的創(chuàng)新性優(yōu)勢，為食品中致病菌毒素污染 的控制和評價探索了新的途徑。本發(fā)明的技術(shù)方案包括1.將不同種類的金黃色葡萄球菌血漿凝固酶呈陽性的 食品樣本在無菌狀態(tài)下粉碎、均質(zhì)后，使用TIANGEN食品總基因組總DNA提取試劑盒提取 其總DNA，并確認提取的效率與純度。2.根據(jù)Genbank已發(fā)表的上述11種腸毒素基因序 列，采用人工設(shè)計與軟件輔助的方法，設(shè)計并合成每種腸毒素基因的特異性擴增引物，使得 擴增片段的大小均在75-200bp之間，可用于STOR Green熒光定量PCR檢測。3.應(yīng)用ABI 7500 FAST熒光定量PCR儀的快速模式，分別使用上述引物，對11種可導(dǎo)致食物中毒的葡萄 球菌腸毒素基因進行檢測與分型。4.應(yīng)用VIDAS酶聯(lián)熒光自動分析儀對含有sea-see的 樣品的鑒定結(jié)果進行方法驗證。1.分別將多份金黃色葡萄球菌血漿凝固酶呈陽性的奶酪牛奶等乳制品、生豬肉 生牛肉等肉制品、速凍水餃速凍肉串等速凍食品樣品在無菌狀態(tài)下粉碎，使用無菌生理鹽 水1 10稀釋并拍擊均質(zhì)后，使用TIANGEN食品總基因組總DNA提取試劑盒對0. Ig食品中 總DNA進行提取，并使用紫外分光光度法測定其濃度與純度。結(jié)果表明，各種食品中提取的 DNA濃度均在0. 2μδ/μ 以上，且0擬60/0D280在1. 85-1. 90之間，證明其濃度和純度均可用 于下一步的STOR Green熒光定量PCR分型。2.使用I^rimer Premier 6.0及人工設(shè)計相結(jié)合的方法，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的 序列，設(shè)計不同腸毒素血清型基因sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、ser、ses、set的 特異性引物，引物序列見表1。其擴增片段的大小在73-195bp之間，可用于熒光定量PCR儀 檢測器的自動分析。表1用以對葡萄球菌腸毒素基因分型的引物序列
權(quán)利要求
1.一種對食品中的葡萄球菌腸毒素進行同時快速檢測與分型的STOR Green熒光定量 PCR方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成(1)將金黃色葡萄球菌呈陽性的食品樣本在無菌狀態(tài)下粉碎、均質(zhì)后，使用食品總DNA 提取試劑盒進行食品中總DNA的提取與純化；(2)分別根據(jù)11種葡萄球菌腸毒素血清型基因sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、 series,set的特征序列設(shè)計用于STOR Green熒光定量PCR的擴增引物，并針對上述提取 的食品中總DNA，應(yīng)用ABI 7500 FAST熒光定量PCR儀的快速模式進行這11種葡萄球菌腸 毒素基因的檢測與分型，通過熒光定量PCR儀的熒光檢測器自動記錄的熒光信號，根據(jù)35 個PCR循環(huán)內(nèi)是否出現(xiàn)顯著擴增曲線從而對食品中的葡萄球菌腸毒素血清型進行有效的 分型。
2.權(quán)利要求1所述對葡萄球菌腸毒素11種血清型進行同時快速檢測與分型的STOR Green熒光定量PCR方法在食品質(zhì)量安全檢測、出入境檢驗檢疫、分子流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品科學(xué)與技術(shù)中的微生物毒素的分子檢測領(lǐng)域。具體涉及應(yīng)用總DNA成分提取、SYBRGreen熒光定量PCR快速檢測的流程對食品中11個血清型的葡萄球菌腸毒素進行快速檢測與分型。結(jié)果表明，應(yīng)用以上方法可根據(jù)35個PCR循環(huán)內(nèi)是否出現(xiàn)顯著擴增曲線從而對食品中的葡萄球菌腸毒素進行有效的分型，具有良好的針對不同血清型腸毒素基因的特異性，具備靈敏、準(zhǔn)確、快捷、方便等特征，相比于已有方法大大提高了檢測與分型的效率，為不同類型葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致的食品污染風(fēng)險分析提供了新的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102061336SQ20101055013
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者凌睿, 劉新梅, 周駿貴, 張馳, 楊軍 申請人:南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院