專利名稱：用于提高動物精原干細胞增殖率的培養(yǎng)液體系和使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于提高動物精原干細胞增殖率的培養(yǎng)液體系和使用方法，可使動物 精原干細胞在短期內大量增殖。
背景技術：
1971年，Huckins, Oakberg, Dym等分別通過對精原干細胞(SSCs)的研究，確認 SSCs定居在曲細精管上皮的基膜處，是由Asingle (As)細胞組成，該類細胞既可自我更新 維持其細胞數(shù)量，又可定向分化生成各級生精細胞直至最后生成精子。2003年和2006年， Wagab-Wahlgren和Anjamrooz等分別證實了表皮生長因子(EGF)可促進SSCsDNA的合成、 有絲分裂以及克隆簇的形成。1993年，Niederberger等通過研究認為EGF超家族中的EGF 和TGF- α都具有調控生殖細胞增殖的能力。且主要通過與其受體erbBl (Ullric等，1982)， erbB2 (Coussens 等，1985)，erbB3 (Krau 等，1989)和 erbB4 (Plowman 等，1993)結合之后發(fā) 揮作用。1997年，Robert等發(fā)現(xiàn)EGF和其受體復合物能夠促進環(huán)氧化酶_2的超表達，該酶 能夠改善SSCs減數(shù)分裂的活性。2008年，王凱明等通過研究發(fā)現(xiàn)10_7-10_6mol/ml的EGF能 夠有效的促進SSCs克隆簇的形成。1999年，Boussouar等確定了 EGF可以刺激支持細胞合 成乳酸鹽而后促進SSCs的增殖。2010年，余榮嬌等通過研究認為，EGF通過激活JAK-STAT 信號轉導通路刺激SSCs的增殖。1992年，loir等發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子(EGFs)與其受體 結合后可直接刺激鮭鱒魚生殖細胞DNA的合成。2002年，Yin等發(fā)現(xiàn)，干細胞因子、白血病 抑制因子和成纖維細胞生長因子都能獨立促進SSCs的增殖。
確立此種培養(yǎng)液的目的在于為精原干細胞的穩(wěn)定和高效增殖提供一整套支撐體 系，從而為瀕危物種的保護與繁衍提供可靠的實踐方案。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，提供新型的提高動物精原干細胞增殖率的培養(yǎng)液體系。三種 培養(yǎng)液以不同種類和不同配伍的生長因子為主要成分，同時配伍高糖DMEM(含4mM L-谷氨 酰胺)，胎牛血清(10%)，維生素E (5uM)，雙抗[青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100mg/ml)]。 探索最佳配伍的培養(yǎng)液，來提高精原干細胞的增殖率。
為了實現(xiàn)上目的，本發(fā)明采取如下技術方案
用于提高動物精原干細胞增殖率的培養(yǎng)液體系，包括基礎培養(yǎng)液和促生長因子； 所述基礎培養(yǎng)液為含10%胎牛血清并含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM800ul+雙抗50ul+5uM 的維生素E30ul ；所述促生長因子包括lOng/ml表皮生長因子EGF20ul。
所述的培養(yǎng)液體系，所述促生長因子包括20ng/ml表皮生長因子EGF和20ng/ml 胰島素樣生長因子-1IGF-1各10ul。
所述的培養(yǎng)液體系，所述促生長因子包括20ng/ml表皮生長因子EGF、20ng/ml胰 島素樣生長因子-lIGF-l、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF各IOul。
所述培養(yǎng)液體系的使用方法，1)，首先用所述基礎培養(yǎng)液對精原細胞進行培養(yǎng)；2)，待精原細胞生長至細胞簇較多時對其進行預先處理，所述預先處理先用10%濃度為 30ng πιΓ1的卵泡刺激素FSH對二次純化的精原細胞液處理15mins，然后接種到支持細胞飼 養(yǎng)層上，同時加入所述促生長因子，繼續(xù)培養(yǎng)。
所述培養(yǎng)液體系的使用方法，1)，首先用所述基礎培養(yǎng)液對精原細胞進行培養(yǎng)； 2)，二次純化的精原細胞液接種到支持細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)20個小時后，用10%濃度為30ng ml-1的卵泡刺激素FSH處理30分鐘，而后重新接種到支持細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，同時加入所 述促生長因子，繼續(xù)培養(yǎng)。
可使動物精原干細胞在短期內大量增殖。


圖1為傳代后第一代精原細胞的形態(tài)學觀察QOO X)；
圖2為傳代后第一代精原細胞的形態(tài)學觀察QOO X)；
圖3為傳代后第一代精原細胞的形態(tài)學觀察O00X)；
圖4為傳代后第一代精原細胞的形態(tài)學觀察(100X)；
圖5為二次純化得到的精原細胞簇的AKP染色QOO X)；
圖6為PT-PCR分析結果。
具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
本實驗設置了以下培養(yǎng)方案
1.空白對照組培養(yǎng)體系為含胎牛血清(10% )的高糖DMEM(含4mM L-谷氨酰 胺)800ul+雙抗50ul+維生素E(5uM)30ul+ 二次純化細胞液每孔IOOul。
2.單因子組培養(yǎng)體系為含胎牛血清(10%)的高糖DMEM(含4mM L-谷氨酰 胺)800ul+雙抗50ul+維生素E(5uM) 30ul+ 二次純化細胞液每孔IOOul+表皮生長因子 EGF(10ng/ml)20ul/胰島素樣生長因子IGF-I (lOng/ml) 20ul/堿性成纖維細胞生長因子 bFGF(10ng/ml)20uL·注單因子組分三個類型，其中以預先處理的EGF (lOng/ml)組效果最 優(yōu)。
3.雙因子組培養(yǎng)體系為含胎牛血清(10%)的高糖DMEM(含4mM L-谷氨酰 胺)800ul+雙抗50ul+維生素E(5uM)30ul+ 二次純化細胞液每孔IOOul+[20ng/ml表皮生 長因子EGF和20ng/ml胰島素樣生長因子-1IGF-1各IOul]/[20ng/ml表皮生長因子EGF 和20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF各IOul] / [20ng/ml胰島素樣生長因子IGF-I和 20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF各IOul]。雙因子組分三個類型，其中以后處理的 表皮生長因子和胰島素樣生長因子(20ng/ml 20ng/ml)組效果最優(yōu)。
4.三因子組培養(yǎng)體系為含胎牛血清(10%)的高糖DMEM(含4mM L-谷氨酰 胺)800ul+雙抗50ul+維生素E(5uM)30ul+ 二次純化細胞液每孔IOOul+[20ng/ml表皮生 長因子EGF，20ng/ml胰島素樣生長因子-1IGF-1和lOng/ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF 各IOul]。三因子組分三個類型，其中以后處理20ng/ml表皮生長因子，20ng/ml胰島素樣 生長因子和lOng/ml堿性成纖維生長因子組效果最優(yōu)。
四種培養(yǎng)方式中，空白對照組不加任何生長因子。也不做關于FSH的預前處理和后處理，所謂預先處理指的是經(jīng)過純化的精原干細胞在向純化的支持細胞接種以前先用 10%濃度為30ng πιΓ1的FSH處理15分鐘，所謂后處理指的是經(jīng)過純化的精原干細胞在向純 化的支持細胞接種20小時后，吸棄每孔中1/3的培養(yǎng)液，而后用含10%濃度為SOngmr1FSH 的培養(yǎng)基處理30分鐘，離心去上清，重新接種到培養(yǎng)板中。上述單因子組，雙因子組和三因 子組都要做關于FSH的預前處理和后處理。不同的處理方式和培養(yǎng)液對精原干細胞促增殖 影響作用不同，關于促生長因子的促增殖影響見表1、表2，、表3，和圖1，2，3。
精原干細胞的檢測方法(1)形態(tài)學觀察法。典型特征是鏈狀分布，8細胞鏈和16 細胞鏈，根據(jù)這些典型特征可以確定其為精原細胞(圖4)。(2) AKP染色。原理是在堿性磷 酸酯酶的催化下，BCIP會被水解產(chǎn)生強反應性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會和NBT發(fā)生反應，會形成不 溶性的深藍色至藍紫色的終產(chǎn)物NBT-formazan (圖5)。(3) RT-PCR鑒定。根據(jù)NCBI發(fā)表 的關于基因β -actin和Ngn3的序列信息，采用primer5. 0軟件設計引物，并由華大基因公 司合成，引物信息見下表4，電泳圖見圖6。
表1單因子的促增值率(％ )
權利要求
1.用于提高動物精原干細胞增殖率的培養(yǎng)液體系，其特征在于，包括基礎培養(yǎng)液和促 生長因子；所述基礎培養(yǎng)液為含10%胎牛血清并含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEMSOOul+雙 抗50ul+5uM的維生素E30ul ；所述促生長因子包括lOng/ml表皮生長因子EGF20ul。
2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)液體系，其特征在于，所述促生長因子包括20ng/ml表皮 生長因子EGF和20ng/ml胰島素樣生長因子-1IGF-1各IOul。
3.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)液體系，其特征在于，所述促生長因子包括20ng/ml表皮 生長因子EGF、20ng/ml胰島素樣生長因子-1IGF-I、lOng/ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF 各 IOul。
4.權利要求1所述培養(yǎng)液體系的使用方法，其特征在于，1)，首先用所述基礎培養(yǎng)液 對精原細胞進行培養(yǎng)；2)，待精原細胞生長至細胞簇較多時對其進行預先處理，所述預先處 理先用10%濃度為30ng πιΓ1的卵泡刺激素FSH對二次純化的精原細胞液處理15mins，然 后接種到支持細胞飼養(yǎng)層上，同時加入所述促生長因子，繼續(xù)培養(yǎng)。
5.權利要求2或3所述培養(yǎng)液體系的使用方法，其特征在于，1)，首先用所述基礎培養(yǎng) 液對精原細胞進行培養(yǎng)；幻，二次純化的精原細胞液接種到支持細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)20個小 時后，用10%濃度為30ng πιΓ1的卵泡刺激素FSH處理30分鐘，而后重新接種到支持細胞 飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，同時加入所述促生長因子，繼續(xù)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于提高動物精原干細胞增殖率的培養(yǎng)液體系，包括基礎培養(yǎng)液和促生長因子；所述基礎培養(yǎng)液為含10％胎牛血清并含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM800ul+雙抗50ul+5uM的維生素E30ul；所述促生長因子包括10ng/ml表皮生長因子EGF20ul。所述促生長因子還可以包括20ng/ml表皮生長因子EGF和20ng/ml胰島素樣生長因子-1IGF-1各10ul。所述促生長因子還可以包括20ng/ml表皮生長因子EGF、20ng/ml胰島素樣生長因子-1IGF-1、10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF各10ul，還公開了培養(yǎng)液體系的使用方法。可使動物精原干細胞在短期內大量增殖。
文檔編號C12N5/076GK102031242SQ20101055060
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權日2010年11月19日
發(fā)明者凡志國, 劉玉, 李青旺, 江中良, 索麗娟, 胡建宏 申請人:西北農林科技大學