專利名稱：一種利用蛻皮檢測大鯢群虹彩病毒帶毒情況的試劑盒和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用蛻皮檢測大鯢群虹彩病毒帶毒情況的試劑盒和方法。
技術背景
大鯢在全球的分布主要是日本、北美和我國，在大鯢資源保護與產業(yè)發(fā)展方面，雖 然日本大鯢與美國隱鰓鯢在資源保護上不同程度的有所重視，我國在大鯢馴馴養(yǎng)繁殖術研 究和開發(fā)利用等方面已經(jīng)處于國際領先地位，人工養(yǎng)殖大鯢不僅成為生態(tài)環(huán)境保護的手 段，而且已經(jīng)成為一部分地區(qū)的特色養(yǎng)殖產業(yè)。人工養(yǎng)殖大鯢具有重大的生態(tài)價值和經(jīng)濟 價值。
我國大鯢主要分布于長江、黃河及珠江中上游支流的山澗溪流中。野生大鯢原產 地自然分布主要集中在我國的五個省，包括陜西、湖北、湖南、貴州和四等。目前全國范圍內 均不同程度的開展了大鯢馴養(yǎng)繁殖工作，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各種傳染性疾病不斷 爆發(fā)和流行，已嚴重制約了大鯢養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。從2009年到2010年，根據(jù)不完全的統(tǒng) 計，全國因虹彩病毒病死亡的大鯢數(shù)量達到10萬條以上，經(jīng)濟損失嚴重，同時也危害著野 生大鯢群的健康繁衍。利用電子顯微鏡和PCR等方法從死亡大鯢體內的肝臟、脾臟和腎臟 檢測虹彩病毒是可行的的方法，但是很難應用于實際生產中。
已經(jīng)有報道的均是從死亡的或生病大鯢的肝臟和脾臟進行檢測，這種檢測方法僅 僅對已發(fā)病或死亡的大鯢進行檢測是有效的，對未表現(xiàn)臨床癥狀或者健康的大鯢群仍然采 用這種方法則造成大鯢個體傷害，完全不適用于健康大鯢群的監(jiān)控。到目前為止，還沒有一 種對大鯢個體無傷害的檢測方法。如何快捷方便確診大鯢群中是否存在虹彩病毒，并應用 于未帶毒大鯢選擇與引種，減少病毒在大鯢群中傳播，對大鯢養(yǎng)殖和保護具有重要意義。
病毒DNA的提取方法和PCR技術是目前廣泛應用于科學研究和實際檢測的成熟手 段。針對大鯢蛻皮中虹彩病毒基因組的簡單而有效地提取方法，并以此DNA為模板PCR檢 測大鯢虹彩病毒帶毒情況還沒有報道。發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術不足 提供一種利用蛻皮檢測大鯢群虹彩病毒帶毒情況的試劑盒和方法。
本發(fā)明采用以下技術方案
1.非損傷活體大鯢樣品獲取方法
通過隨機獲得大鯢群中新鮮蛻皮，而不傷害大鯢群的任何一個個體，克服了從大 鯢的內臟組織才能獲取樣品的問題。只需將得到的蛻皮樣本凍存于-20°C即可較長時期保 存或直接用于檢測，這種方法我們在研究中首次使用，效果很好(見附圖及說明)。這種獲 取樣品的方法可以對引種大鯢群帶毒情況檢測，避免將帶有病毒的大鯢引入養(yǎng)殖場；同時 利用這種無傷害獲取的樣品跟蹤監(jiān)測大鯢群在養(yǎng)殖過程中虹彩病毒的感染情況，以便及時采取相應措施，減少損失。
2.提取樣本中的虹彩病毒DNA檢測試劑盒和檢測方法
根據(jù)大鯢蛻皮的特點我們優(yōu)化了從蛻皮中提取病毒基因組DNA的方法。通過設計 相應的試劑盒，并利用試劑盒進行標準步驟的檢測，更加有利于在實際生產中應用。
試劑盒包括DNA提取試劑組合和PCR擴增試劑組合；提取樣本中的病毒DNA試劑 組合
A液，蛻皮樣本裂解液，1管，主要含有PBS ；1% triton-100 ；
B 液，1 管，200ug/ml 蛋白酶 K ；
C液，1管，模板抽提液，1管，含有酚/氯仿/異戊醇，比例為25 24 1 ；
D 液，1 管，3mol/l 乙酸鈉；
E液，1管，含有無水乙醇；
F液，1管，含有75%的乙醇；
G管，1管，含有滅菌超純水；
PCR擴增PCR擴增試劑組合
H液，1管，含有PCR擴增反應液，包括去離子水，dNTP底物，含Mg2+的2X緩沖液； Taq酶；引物(可根據(jù)引物對數(shù)量增加管數(shù)并根據(jù)引物不同標記)；
I液，1管，陽性對照樣品；
J液，1管，陰性對照品；
K 液，1 管，DNA marker II
上述試劑包裝帶有泡沫板的盒內。各小管放置在泡沫板的小孔中。100個無菌 1. 5ml的離心管和50個PCR管分別放置在兩個塑料袋中，每個試劑盒可以一次檢測至少10 個樣品。
3用本發(fā)明上述試劑盒檢測大鯢蛻皮中虹彩病毒。按以下具體步驟進行
1)養(yǎng)殖在同一池中的大鯢群，隨機用眼科鑷子和剪刀取蛻皮3-5片，盡量去除水 分，保存在2μ 1的離心管中，同時用取樣剪刀剪10-20次，混勻，標記好后，保存在-20°C備 用。一定要注意每一個養(yǎng)殖池取樣器械不能交叉使用。
2)蛻皮樣本0. Ig新的1.5ml離心管中，加入A液500 μ 1，反復凍溶3次，加入B 液20μ 1，55°C水浴1. Oh后，4000rpm離心lOmin，去蛻皮碎片；
3)取上清500 μ 1于新的1. 5ml離心管中，加入等體積(500 μ 1) C液抽提，混合均 勻，室溫放置5min, 12000rpm離心5min ；
4)取上清于新的1. 5ml離心管中，加1/10體積D液，3倍體積E液，置_20°C 30min 沉淀DNA，13，OOOrpm離心lOmin，小心倒掉上清液；
5)向上述離心管中加入500μ 1 F液，13，OOOrpm離心5min小心棄上清，重復一 遍；
6)于室溫晾干后加入30 μ 1 G液溶解；即為待測模板DNA溶液。
7)取樣品數(shù)量+2個PCR管，標記號碼(根據(jù)測定的樣品進行標記)，分別加入 19 μ 1的H液，并分別取第6步的液體(待測模板DNA溶液)、I液和J液1 μ 1加入到對應 標記號的PCR管中，混均后，5000rpm離心30sec，置于PCR儀上。
按以下條件進行擴增
95°C變性 5min — 95°C，30sec ；
58°C,30sec ；
72°C，30sec(30 個循環(huán))—72°C，IOmin — 4°C保存。
8)反應結束后，向各PCR中加入4 μ 1的溴酚藍混均，配制1 %的瓊脂糖凝膠，分 別向加樣孔中加入15μ 1的混合液，向另一孔中加入8μ 1的DNA marker II，120V電泳 20mino
9)結果判定電泳結束后，在紫外燈下觀察，對比陽性和陰性對照，樣品若在相同的 分子量處有條帶表明該對應的大鯢群感染虹彩病毒，否則未感染。
本發(fā)明首次利用大鯢的新鮮蛻皮作為檢測病料樣品，解決了必須殺死大鯢個體才 能獲取檢測樣品的不足；優(yōu)化后，設計了簡單而有效地提取大鯢蛻皮樣品中的病毒基因的 試劑盒；針對虹彩病毒2個保守基因的2對PCR引物和聚合酶鏈式反應體系和條件；設立了 陽性和陰性對照品控制檢測結果的可靠性。利用本發(fā)明的試劑盒和標準檢測方法，更加適 應于在大鯢養(yǎng)殖生產的實際中應用。


圖1為電泳照片。M =DNA Marker ； 1泳道陽性對照；2泳道陰性對照；3_12泳道 分別為十個不同樣品；Sl 引物Sl ；S2 引物S2。
具體實施方式
以下結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
實施例1
一個大鯢虹彩病毒檢測試劑盒試制
(規(guī)格按一個試劑盒檢測10個樣品)
A液，蛻皮樣本裂解液，1管12ml，主要含有PBS ；1% triton-100
B 液，1 管 400ul，200ug/ml 蛋白酶 K ；
C液，1管，模板抽提液，1管12ml，含有酚/氯仿/異戊醇，比例為25 24 1 ；
D 液，1 管 2ml,3mol/l 乙酸鈉；
E液，1管20ml，含有無水乙醇；
F液，1管40ml，含有75%的乙醇；
G管，1管1ml，含有滅菌超純水；
H液，Sl管300 μ 1，含有PCR擴增反應液(20 μ 1體系)，包括去離子水，dNTP底物， 含 Mg2+ 的 1 X 緩沖液；Taq 酶；引物 Sl (5，-CCCCTCCCATTCTTCTTCTCC-3，禾口
5，-GGCGTTGGTCAGTCTACCGTAAT-3，)。
S2管300 μ 1，含有PCR擴增反應液(20 μ 1體系)，包括去離子水，dNTP 底物，含 Mg2+ 的 IX 緩沖液；Taq 酶；弓丨物 S2(5，-GGGCTAATGTATTGAAGACGC-3，和 5，-TTGTAAACTTGGAGTGGAGGG-3，)，
I液，1管3 μ 1陽性對照樣品；內含有虹彩病毒DNA模板
J液，1管3 μ 1陰性對照品，內含有牛基因組DNA混合液
K 液，1 管 30 μ 1，DNA marker II
上述試劑包裝帶有泡沫板的硬紙盒內(長X寬X高=15X15X 15cm3)。各小管 放置在泡沫板的小孔中。100個無菌1. 5ml的離心管和30個PCR管分別放置在兩個塑料袋中。
每個試劑盒可以一次檢測至少10個樣品。
實施例2:
用本發(fā)明上述試劑盒檢測10個大鯢群虹彩病毒帶毒情況
1.按本發(fā)明的要求，獲得不同10個大鯢群蛻皮各5片，分別在2μ 1的離心管中用 取樣剪刀剪10-20次，混勻。
2.蛻皮樣本0. Ig編好號的(3-12號)新的1. 5ml離心管中，加入A液500 μ 1，反 復凍溶3次，加入B液20μ 1，55°C水浴l.Oh后，4000rpm離心lOmin，去蛻皮碎片。
3.取上清500 μ 1于新的1. 5ml離心管中(對應上步編號)，加入等體積(500 μ 1) C液抽提，混合均勻，室溫放置5min，12000rpm離心5min ；
4.取上清于新的1. 5ml離心管中(對應上步編號)，加1/10體積D液，3倍體積E 液，置-200C 30min沉淀DNA, 13，OOOrpm離心IOmin,小心倒掉上清液；
5.向上述離心管中加入500 μ 1 F液，13，OOOrpm離心5min小心棄上清，重復一 遍；
6.于室溫晾干后加入30 μ 1 G液溶解；即為待測模板DNA溶液。
7.取2+樣品數(shù)量的PCR管，標記好(根據(jù)測定的樣品進行標記)，分別加入19 μ 1 的H液，并分別取第6步的液體(待測模板DNA溶液)、I液和J液1 μ 1加入到對應標記號 的PCR管中，混均后5000rpm離心30秒，置于PCR儀上。
按以下條件進行擴增95"C 變性 5min — 95 °C，30sec ；58 "C，30sec ；72 °C， 30sec(30 個循環(huán))—72°C，10min — 4°C保存。
8.反應結束后，向各PCR中加入4μ 1的溴酚藍混均，配制的瓊脂糖凝膠，分別 向瓊脂糖凝膠加樣孔中按順序加入15 μ 1的PCR反應液，另外一孔加8 μ 1的DNAmarker II， 120V 電泳 20min。
9.電泳結束后，在紫外燈下觀察，對比陽性和陰性對照，樣品若在引物Sl :681bp 和引物S2 :568bp的分子量處有條帶，表明該對應的大鯢群感染虹彩病毒，否則未感染，結 果見附圖1，經(jīng)過對10個大鯢蛻皮樣品的檢測顯示，6，8，9號樣品對應的大鯢群沒有虹彩病 毒感染，而3，4，5，7，10，11，12號樣品對應的大鯢群已經(jīng)感染了虹彩病毒；設立陽性對照(1 泳道)和陰性對照O泳道)說明本發(fā)明的方法和檢測體系是可靠的。
應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種利用蛻皮檢測大鯢群虹彩病毒帶毒情況的試劑盒，其特征在于，包括DNA提取 試劑組合和PCR擴增試劑組合，所述DNA提取試劑組合包括A液，蛻皮樣本裂解液，1管，含有PBS triton-100 ； B液，1管，200μβ/πι1蛋白酶K;C液，1管，模板抽提液，1管，含有酚/氯仿/異戊醇，比例為25 24 1 ； D液，1管，3mol/l乙酸鈉； E液，1管，含有無水乙醇； F液，1管，含有75%的乙醇； G管，1管，含有滅菌超純水； 所述PCR擴增試劑組合包括H液，含有PCR擴增反應液，包括去離子水，dNTP底物，含Mg2+的IX緩沖液；Taq酶；引 物；管數(shù)量由引物對數(shù)量決定； I液，1管，陽性對照樣品； J液，1管，陰性對照品； K 液，1 管，DNA marker II。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟1)大鯢群蛻皮樣本采集；2)取大鯢群蛻皮樣本0.Ig于新的1. 5ml離心管中，加入所述A液500 μ 1，反復凍融3 次，加入所述B液20μ 1，55°C水浴l.Oh后，4000rpm離心lOmin，去蛻皮碎片；3)取上清500μ 1于新的1. 5ml離心管中，加入等體積所述C液抽提，混合均勻，室溫放 置 5min, 12000rpm 離心 5min ；4)取上清于新的1.5ml離心管中，加1/10體積所述D液，3倍體積所述E液，置_20°C 30min沉淀DNA，13000rpm離心lOmin，小心倒掉上清液；5)向步驟4)所述離心管中加入500μ 1所述F液，13000rpm離心5min小心棄上清，重 復一遍；6)于室溫晾干后加入30μ 1所述G液溶解；即為待測模板DNA溶液；7)取樣品數(shù)量+2個PCR管，標記號碼，分別加入19μ 1的所述H液，并分別取第6)步 的模板DNA溶液、所述I液和所述J液1 μ 1加入到對應標記號的PCR管中，混均后5000rpm 離心30秒，置于PCR儀上；按以下條件進行擴增95°C變性 5min — 95°C,30sec ； 58°C,30sec ；72°C，30sec, 30 個循環(huán)—72°C，IOmin — 4°C保存；8)反應結束后，向各PCR中加入4μ1的溴酚藍混均，配制的瓊脂糖凝膠，分別向加 樣孔中加入15 μ 1的混合液，向另一加樣孔中加8 μ 1的DNA marker II，120V電泳20min ；9)結果判定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用蛻皮檢測大鯢群虹彩病毒帶毒情況的試劑盒和檢測的方法。試劑盒包括A液，蛻皮樣本裂解液，1管，含有PBS；1％triton-100；B液，1管，200μg/ml蛋白酶K；C液，1管，模板抽提液，1管，含有酚/氯仿/異戊醇，比例為25∶24∶1；D液，1管，3mol/l乙酸鈉等；本發(fā)明利用大鯢的新鮮蛻皮作為檢測病料樣品，解決了必須殺死大鯢個體才能獲取檢測樣品的不足；根據(jù)大鯢蛻皮的特點我們優(yōu)化了從蛻皮中提取病毒基因組DNA的方法，設計了簡單而有效地提取大鯢蛻皮樣品中的虹彩病毒基因的試劑盒，以及針對虹彩病毒2個保守基因的2對PCR引物和聚合酶鏈式反應條件；設立了陽性和陰性對照品。利用本發(fā)明的試劑盒并進行標準步驟的檢測，更加可靠地掌握大鯢群虹彩病毒帶毒情況，有利于在實際生產中應用。
文檔編號C12Q1/68GK102031307SQ201010550620
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權日2010年11月19日
發(fā)明者安俊輝, 宋峰峰, 張曉明, 張馳, 楊長明, 胡沈榮, 董武子, 覃金洲, 邢福珊 申請人:漢中天成生物工程有限公司, 西北農林科技大學