專利名稱：一種t載體介導的測定5′端側翼未知序列的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，是一種涉及限制性內切酶(Restriction Endonuclease)酶切、pUCm-T 載體連接和巢式 PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)擴 增等技術，基于部分已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列確定其5'端側翼未知DNA序 列的方法。
背景技術：
GenBank的核酸序列信息日益豐富，但報道的許多新基因僅獲取了部分DNA序列。 當我們不了解某個基因完整的DNA序列時，就無法深入研究該基因的結構和功能，因此需 要從基因的部分已知DNA序列來確定其完整的序列，由于現行的方法極其有限，從而使這 項工作變得繁重和棘手。隨機測序法是通過大量的隨機測定DNA序列，并借助計算機進行 排序的方法來獲取所需要的DNA序列。該方法存在很大的偶然性，通常會耗費很大的人力 和物力。3'-和 5' -RACE(3‘ and 5' Rapid Amplification of cDNA Ends)法是在已 知部分mRNA序列的情況下，獲取目的基因完整的mRNA序列。RACE法只能獲取基因的可轉 錄部分，而不能確定基因的上下游調控元件序列。另外，RACE法步驟較繁瑣，mRNA又極其不 穩(wěn)定，反轉錄還特別容易受到豐度低和高級結構的影響，因此效果也不是很理想。而利用同 位素或生物素標記探針對基因組文庫進行雜交篩選的方法，則更是費時費力，是研究者在 不得已的情況下的最后選擇。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、應用范圍廣、成本低廉、高效準確、pUCm-T載 體介導的PCR擴增方法，能夠基于已知DNA序列確定其5'端側翼未知DNA序列。本發(fā)明的技術方案①選用限制性內切酶雙酶切基因組DNA ；②純化的酶切產物 用Taq酶或Ex Taq酶進行補齊和3 ‘端加A (Adenine)反應，與pUCm_T載體連接；③利用 引物設計軟件選定T載體上的一段特異性序列作為5'端引物、兩條靠近未知序列端的已 知DNA序列上的互補序列作為3'端引物；④以pUCm-T載體連接物為模板，用設計的引物 進行二輪的PCR(巢式PCR)擴增，并對其擴增片段進行克隆和測序。具體步驟如下(I)PCR引物的設計根據已知DNA序列設計兩條3'端特異性引物，命名為 Primer-Rl和Primer_R2 (18_22bp) ；Primer-R2的3'端距待測序列要保留30bp以上長度， 比ft~imer-Rl接近待測的未知序列(圖1和圖4)；針對本發(fā)明引入的pUCm-T載體，在其T/ A克隆位點的上游選定一條5'端特異性引物Olbp，Tm值60°C )，命名為T-PrimerF (圖 2和圖5)。(2)限制性內切酶的選擇分析已知DNA序列上的限制性內切酶位點，選用從 I^imer-Rl到待測的未知序列之間沒有酶切位點的兩種限制性內切酶。本發(fā)明可供選擇常 用的產生 5'粘性末端的內切酶有 EcoR I ,Hind IILBgl IKSal I ,BamH I、Nco I、Xba I 和Xho I等；產生平齊末端的有EcoR V、SnaB I和ka I等；產生3'粘性末端的有tot I、Pst I、Sac I 禾口 Kpn I 等。(3)PCR模板的構建運用步驟(2)選擇的兩種內切酶對基因組DNA進行雙酶切， 純化的酶切產物用Taq酶或Ex Taq酶進行補齊和3'端加A反應，與pUCm-T載體連接，即 可作為PCR模板。此步驟若選用的兩種內切酶都是5'粘性或平齊末端，只需選用普通Taq 酶；否則需要選用帶有3' -5'外切酶活性的Ex Taq酶。(4)巢式PCR擴增以步驟(3)的T載體連接物為模板，用T-PrimerF和I^rimer-Rl 為引物進行第一輪PCR擴增；再以首輪PCR擴增產物為模板，用T-PrimerF和ft~imer-R2為 引物進行第二輪PCR擴增。將兩輪PCR(巢式PCR)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根 據巢式PCR原理可以快速驗證其擴增的產物是否為目的片段。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明使用特異性引物進行巢式PCR擴增，可以確定出已知DNA序列5'端側翼的 未知序列。它與現行的方法相比，具有如下的優(yōu)點1、操作簡便。與隨機測序法相比，避免了對基因組進行大規(guī)模的測序，也無需進行 繁瑣的計算和排序工作，從而節(jié)省了大量的人力、時間和財力。2、應用范圍廣。在已知部分DNA序列的基礎上，pUCm-T載體介導的PCR擴增可應 用于各種不同基因的5'端側翼未知序列的測定。3、操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足夠操作，而且可供選擇的限 制性內切酶較多。4、引物特異性強。本發(fā)明通過利用T載體介導的PCR方法，把隨機引物的擴增轉 變成特異性引物的擴增，大幅度提高了 PCR擴增的特異性和效率。5、結果驗證簡捷。巢式PCR擴增可快速驗證其擴增的產物是否為目標DNA片段， 具有簡捷、準確和實用性強等特點。6、未知序列長度不限。由于基因組DNA的酶切位點是隨機分布的，本發(fā)明可獲取 未知序列長達幾Kb的片段，而且序列的準確性和真實性不會因長度的增加而影響。7、成本低廉。本發(fā)明的核心還是簡單的PCR擴增，所以無需昂貴的儀器和試劑盒。


圖1 5 ‘粘性末端的PCR模板構建圖宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因組DNA經產生5‘粘性末端的限制性 內切酶雙酶切后，用Taq酶補齊和3'端加A反應，與pUCm_T載體連接構建PCR模板。圖2 引物T-PrimerF、Cell2A-Rl和Cell2A_R2在5，粘性末端的PCR模板上的位
置圖3:宇佐美曲霉EOOl第12家族葡聚糖酶基因(cell2A)5'端側翼的測序結果圖4:3'粘性和平齊末端的PCR模板構建圖宇佐美曲霉(Aspergillus usamii) EOOl基因組DNA經產生3'粘性和平齊末端的限制性內切酶雙酶切后，用Ex Taq酶補齊和 3'端加A反應，與pUCm-T載體連接構建PCR模板。圖5 引物T-PrimerF、Cel5A_Rl和Cel5A_R2在3，粘性末端的PCR模板上的位置圖6:宇佐美曲霉EOOl第5家族葡聚糖酶基因(cel5A)5'端側翼的測序結果
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 cell2A啟動子序列的測定。(I)DNA酶切產物的制備選用Hind III和Xba I對宇佐美曲霉基因組DNA進行雙 酶切。構建如下雙酶切體系10XM Buffer 2 μ 1, Hind III 1μ l,Xba I Ιμ ，基因組DNA 10μ 1，無菌水6μ 1 ；將上述體系在37°C水浴中反應4h。純化回收雙酶切產物并溶于20 μ 1 無菌水中。(2)酶切產物的補齊和3'端加A反應雙酶切產物20μ1，10XPCR Buffer 2. 5 μ l，dNTP 0. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，無菌水 1. 75 μ 1 ；72°C反應 IOmin0 目的產物命名為 cell2AP。(3)cell2AP 與 pUCm-T 的連接50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1μ 1，pUCm-Tl μ 1，Τ4 DNALigase 1μ 1，cell2AP 6 μ 1 ； 16°C連接過夜。目的產物命名為 pUCm-T-cell2AP。(4)cell2A 啟動子第一輪 PCR 擴增10XPCR Buffer 5 μ 1，dNTP 3μ 1， pUCm-T-cel 12ΑΡ 5 μ 1，T-PrimerF 1 μ 1，Cel 12A-R1 1 μ 1，無菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ； 94°C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的產物命名為 cell2AP-0uto(5)cell2A 啟動子第二輪 PCR 擴增10XPCR Buffer 5 μ 1，dNTP 3μ 1， cell2AP-0ut 1 μ 1, T-PrimerF 1 μ 1，Cell2A_R2 1 μ 1，無菌水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ； 94°C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的產物命名為 cell2AP-In。(6)cell2AP-In的克隆和測序將cell2AP_h按照割膠回收試劑盒說明書上的操 作步驟進行割膠回收，將純化的產物克隆到PUCm-T載體上進行測序，結果如圖3所示。實施例2宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 cel5A啟動子序列的測定。(I)DNA雙酶切產物的制備選用EcoR V和I3St I對宇佐美曲霉基因組DNA進行 雙酶切。構建如下酶切體系10 X H Buffer 2 μ 1, EcoR V 1μ 1, Pst I 1 μ 1，基因組DNA 10 μ 1，無菌水6 μ 1 ；將該體系在37°C水浴中反應4h。純化回收雙酶切產物并溶于20μ 1無 菌水中。(2)酶切產物的補齊和3'端加A反應雙酶切產物20μ1，IOXEx Taq Buffer 2. 5 μ l，dNTP0. 5μ l，Ex Taq 酶 0· 25 μ 1，無菌水 1. 75 μ 1 ；72°C反應 IOmin0 目的產物命名 為 cel5AP。(3)cel5AP 與 pUCm-T 的連接50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1μ 1，pUCm-ΤΙμ 1，T4 DNALigase 1μ 1, cel5AP 6 μ 1 ;16°C連接過夜。目的產物命名為 pUCm-T-cel5AP。(4)cel5A 啟動子第一輪 PCR 擴增10 X PCRBuffer 5 μ 1，dNTP 3μ 1, pUCm-T-cel5ΑΡ 5 μ 1，T-PrimerF 1 μ 1，Cel5A_Rl 1 μ 1，無菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5 μ 1 ；940C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的產物命名為 cel5AP-0uto(5)cel5A 啟動子第二輪 PCR 擴增10 X PCR Buffer 5 μ l，dNTP 3 μ l，cel5AP_0ut 1 μ 1, T-PrimerF 1 μ 1, Cel5A-R2 1 μ 1，無菌水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ;94°C 4min，30 個 循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的產物命名為 cel5AP_In。(6) cel5AP-In的克隆及測序將Cel5AP_h按照割膠回收試劑盒說明書的操作步 驟進行割膠回收，將純化的產物克隆到PUCm-T載體上進行測序，結果如圖6所示。
權利要求
1.一種pUCm-T載體介導的PCR擴增已知DNA序列5'端側翼未知序列的方法，其特征 在于選用限制性內切酶酶切基因組DNA ；純化的酶切產物用Taq酶或Ex Taq酶補齊和3' 端加A，與pUCm-T連接；利用引物設計軟件選定T載體T/A克隆位點上游的一段序列作為 5'端引物、兩條靠近未知序列端的已知DNA序列上的互補序列作為3'端引物；以pUCm-T 連接物為模板，用設計的引物進行巢式PCR擴增以獲取已知DNA序列5'端側翼的未知序 列；(1)PCR引物的設計基于已知DNA序列設計兩條3'端特異性引物，命名為I^rimer-Rl 和ft~imer-R2 (18_22bp) ；Primer-R2的3 ‘端距待測序列要保留30bp以上長度，它比 Primer-Rl接近待測的未知序列；針對本發(fā)明引入的pUCm-T載體，在其T/A克隆位點的上 游選定一條5'端特異性引物，命名為T-PrimerF (2lbp, Tm值60°C )；(2)限制性內切酶的選擇根據對已知DNA序列上限制性內切酶位點的分析，選用從 Primer-Rl到待測的未知序列之間沒有酶切位點的兩種內切酶；本發(fā)明可供選擇的常用的 產生5'粘性末端的限制性內切酶有EcoR I、Hind III、Bgl II, Sal I、BamH I、Nco I、 Xba I和Bio I等；產生平齊末端的有EcoR V、SnaB I和ka I等；產生3'粘性末端的有 Bmt I ,Pst I、Sac I 禾口 Kpn I 等；(3)PCR模板的構建運用步驟(2)選擇的兩種內切酶對基因組DNA進行酶切，純化的 酶切產物用Taq酶或Ex Taq酶進行補齊和3'端加A反應，與pUCm-T載體連接，即可作為 PCR模板；此步驟若選用的兩種內切酶都是5'粘性或平齊末端，只需選用普通Taq酶，否則 需要選用帶有3' -5'外切酶活性的Ex Taq酶；(4)巢式PCR擴增以步驟(3)的T載體連接物為模板，采用T-PrimerF和I^rimer-Rl 為引物進行第一輪PCR擴增；再以首輪PCR擴增產物為模板，采用T-PrimerF和ft~imer-R2 為引物進行第二輪PCR擴增；將兩輪PCR(巢式PCR)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根 據巢式PCR原理可以快速驗證其擴增的產物是否為目的片段。
2.根據權利要求1所述的方法，操作過程中所使用的反應體系和條件如下(1)按如下的體系和條件雙酶切宇佐美曲霉EOOl基因組DNA(以Hind III和)(ba I為代 表)10XM Buffer 2 μ 1，Hind III 1 μ 1, Xba I 1 μ 1，基因組 DNA 10 μ 1，無菌水 6 μ 1 ；將 該體系在37°C水浴中反應4h ；純化回收雙酶切產物并溶于20 μ 1無菌水中；(2)按如下的體系和條件對酶切產物進行補齊和3'端加Α(以宇佐美曲霉EOOl的 cell2A 基因為代表)酶切產物 20μ 1，IOXPCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 0. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，無菌水1. 75 μ 1 ；72°C反應IOmin ；目的產物命名為cell2AP ；(3)按如下的體系和條件連接cell2AP 與 pUCm-T :50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1 μ 1，pUCm-T 載體 1 μ 1，T4 DNA Ligase 1μ l,cell2AP 6yl;16°C 連接過 夜；目的產物命名為pUCm-T-Cell2AP ；(4)按如下的PCR體系和條件進行第一輪的PCR擴增10XPCRBuffer 5 μ 1, dNTP 3 μ 1, pUCm-T-cell2AP 5 μ 1, T-PrimerF 1 μ 1，Cell2A_Rl 1 μ 1，無菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5μ 1 ；94 °C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin;首輪 PCR 產物命名為cell2AP-0ut ；按如下的體系和條件進行第二輪的PCR擴增10XPCR Buffer 5 μ 1，dNTP 3 μ 1，cell2AP-0ut 1 μ 1，T-PrimerF 1 μ 1，Cell2A_R21 μ 1，無菌水 38. 5 μ 1， Taq 酶 0. 5μ 1 ;94°C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin ；第二輪PCR產物命名為cell2AP-In。
全文摘要
本發(fā)明是一種涉及限制性內切酶酶切、pUCm-T載體和巢式PCR擴增等技術，基于已知DNA序列確定其5′端側翼未知DNA序列的方法。該方法通過選用限制性內切酶酶切基因組DNA，純化的酶切產物用Taq酶或Ex Taq酶進行補齊和3′端加A反應，與pUCm-T載體連接；利用引物設計軟件選定T載體上T/A克隆位點上游的一段序列作為5′端引物，選定兩條靠近未知序列端的已知DNA序列上的互補序列作為3′端引物；以pUCm-T載體連接物為模板，采用設計的引物進行巢式PCR擴增，并對其擴增片段進行克隆和測序。本發(fā)明具有操作簡便、應用范圍廣、操作限制少、結果驗證簡捷、未知序列長度不限和成本低廉等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102140500SQ20101055084
公開日2011年8月3日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權日2010年11月19日
發(fā)明者唐存多, 張慧敏, 李劍芳, 譚中標, 鄔敏辰, 陳偉, 高金湖 申請人:江南大學