專利名稱：大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)方法和相關(guān)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病相關(guān)基因突變檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及大腸直腸癌相關(guān)基因突變檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種大腸直腸癌相關(guān)基因κ-ras基因突變檢測(cè)方法和相關(guān)試劑盒。
背景技術(shù)：
目前癌癥治療除了化學(xué)治療、手術(shù)切除、放射療法等方式外，還有針對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行攻擊的標(biāo)靶治療(Target therapy)。標(biāo)靶治療是利用癌細(xì)胞中獨(dú)特的結(jié)構(gòu)或分子，以專一性的藥物攻擊這些特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)而殺死癌細(xì)胞。最重要的是，標(biāo)靶藥物較不會(huì)攻擊正常細(xì)胞， 對(duì)正常細(xì)胞傷害較小，可減少許多副作用(如白血球、血小板降低、貧血、嘔吐、掉頭發(fā)等現(xiàn)象)，也可抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與抗藥性的惡性轉(zhuǎn)化能力。標(biāo)靶治療也是近年來癌癥治療的新趨勢(shì)，也是醫(yī)學(xué)界最熱門的研究重點(diǎn)，許多以此為目標(biāo)的臨床試驗(yàn)研究正持續(xù)進(jìn)行中。根據(jù)研究顯示大腸直腸癌的發(fā)生與其中癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體表現(xiàn)有關(guān)，目前使用在大腸直腸癌的標(biāo)靶藥物有可與腫瘤細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)結(jié)合，進(jìn)而抑制EGFR作用的IgGl單株抗體的Cetuximab ( Erbitux )及IgG2 kappa單株抗體的 Panitumumab( Vectibix )。其原理是它可以專一性地與EGFR結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性的抑制表皮生長(zhǎng)因子的功能，使得癌細(xì)胞無法進(jìn)行復(fù)制、繁殖與血管再生，誘發(fā)癌細(xì)胞走向死亡。EGFR，全名為Epidermal Growth Factor Rec印tor，中文名稱為表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，是存在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)，可傳遞細(xì)胞外生長(zhǎng)、增殖以及抗亡的致癌訊號(hào)至細(xì)胞內(nèi)，有可能會(huì)促成癌癥的快速生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與抗藥性，患者的病況因而惡化。K-ras是EGFR下游的調(diào)控因子，為ras致癌基因家族成員之一，當(dāng)K-ras基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)引起一系列的蛋白質(zhì)磷酸化，造成更多細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，促使癌細(xì)胞過量的成長(zhǎng)分裂。大部份的K-Ras 基因的突變發(fā)生在第12、13和61號(hào)密碼子。由于每個(gè)病患間基因型態(tài)的差異對(duì)同樣的標(biāo)靶藥物會(huì)產(chǎn)生不同的反應(yīng)，而影響治療效果。用藥前的基因檢測(cè)，可幫助醫(yī)師與病患了解是否適合使用標(biāo)靶治療，量身訂作個(gè)人化治療，挑選適當(dāng)藥物，更有助于增加標(biāo)靶治療的專一療效而達(dá)到更佳的治療效果。大腸癌的標(biāo)靶藥物Cetuximab/Panitumumab是針對(duì)EGFR進(jìn)行抑制，將其阻斷，停止后續(xù)一連串的癌細(xì)胞進(jìn)展，個(gè)人基因型態(tài)的差異會(huì)影響標(biāo)靶藥物抑制EGFR機(jī)制的作用結(jié)果。大腸直腸癌與標(biāo)靶藥物之臨床研究已有許多期刊報(bào)告可尋，相關(guān)新聞亦可利用搜尋網(wǎng)站鍵入“大腸癌標(biāo)靶治療”關(guān)鍵詞搜尋。Lievre等人于2008年在J Clin Oncol期刊發(fā)表有關(guān)大腸直腸癌第一線化療失敗后，投與Cetuximab的研究指出K-raS突變型對(duì) Cetuximab具有抗藥性，而且療效反應(yīng)較差。再一次確認(rèn)了 Cetuximab在K_ras野生型才具有療效。結(jié)論簡(jiǎn)報(bào)于下表
權(quán)利要求
1.一種大腸直腸癌相關(guān)基因κ-ras基因突變檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟a.提取腫瘤組織的基因組DNA;b.根據(jù)K-ras基因的包含第12號(hào)和/或第13號(hào)密碼子的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物對(duì)，并設(shè)計(jì)一條與所述第12號(hào)和/或第13號(hào)密碼子的突變序列匹配的TaqMan MGB熒光探針，對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR ；c.根據(jù)所述熒光定量PCR中收集的熒光信號(hào)而形成的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，分析所述基因組 DNA中是否發(fā)生突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)方法，其特征在于， 所述PCR引物對(duì)是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列、SEQ IDNO 7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)方法，其特征在于， 所述PCR引物對(duì)是SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列，所述iTaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列或SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列。
4.一種大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括引物容器和熒光探針容器，所述引物容器內(nèi)具有根據(jù)K-ras基因的包含第12號(hào)和/或第13號(hào)密碼子的核苷酸序列設(shè)計(jì)的PCR引物對(duì)干燥粉末或溶液，所述熒光探針容器內(nèi)具有與所述第12 號(hào)和/或第13號(hào)密碼子的突變序列匹配的TaqMan MGB熒光探針干燥粉末或溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR引物對(duì)是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，所述iTaqMan MGB 熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列、SEQ IDNO :7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)方法，其特征在于， 所述PCR引物對(duì)是SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列，所述iTaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列或SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列。
7.一種大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括熒光探針容器和兩個(gè)引物容器，兩個(gè)所述引物容器內(nèi)分別具有根據(jù)K-ras基因的包含第12號(hào)和/或第13號(hào)密碼子的核苷酸序列設(shè)計(jì)的PCR引物對(duì)干燥粉末或溶液之一，所述熒光探針容器內(nèi)具有與所述第12號(hào)和/或第13號(hào)密碼子的突變序列匹配的TaqMan MGB熒光探針干燥粉末或溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR引物對(duì)是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB 熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列、SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列、SEQ IDNO :7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)方法，其特征在于， 所述PCR引物對(duì)是SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列，所述iTaqMan MGB熒光探針具有的核苷酸序列是SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列或SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)方法，包括步驟a.提取腫瘤組織的基因組DNA；b.根據(jù)K-ras基因的包含第12號(hào)和/或第13號(hào)密碼子的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物對(duì)，并設(shè)計(jì)一條與所述第12號(hào)和/或第13號(hào)密碼子的突變序列匹配的TaqMan MGB熒光探針，對(duì)基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR；c.根據(jù)熒光定量PCR中收集的熒光信號(hào)而形成的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，分析基因組DNA中是否發(fā)生突變。還提供了大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的大腸直腸癌相關(guān)基因K-ras基因突變檢測(cè)方法設(shè)計(jì)巧妙，操作簡(jiǎn)單，可以篩檢出可能對(duì)標(biāo)靶藥物有效的病人族群，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為醫(yī)師用藥的參考依據(jù)，可指引醫(yī)師與病人是否適合使用標(biāo)靶治療，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102465180SQ20101055095
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者白小萍, 趙翊均, 陸群 申請(qǐng)人:上?；瞪锛夹g(shù)有限公司, 上?？灯谏锟萍脊煞萦邢薰?br>