專利名稱：與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的snp標記及其應用的制作方法
技術領域：
本法民涉及動物遺傳育種領域，具體涉及與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記及其應用。
背景技術：
我國是世界第一養(yǎng)豬大國和豬肉消費大國，養(yǎng)豬業(yè)在我國畜牧業(yè)中占有舉足輕重 的地位，養(yǎng)豬業(yè)占畜牧業(yè)主值的35%左右，是畜牧業(yè)收入的主要來源。繁殖性狀作為一個重要的經(jīng)濟性狀，直接影響著養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益。傳統(tǒng)數(shù)量遺 傳學在指導家畜育種中起到了重要的作用，但是繁殖性狀遺傳力低、性狀表現(xiàn)晚、而且是限 性遺傳，通過常規(guī)選擇難以有所進展。若要進一步提高豬的繁殖性能，必須對其遺傳機理有 更為深入的了解。因而，應用分子標記的現(xiàn)代育種技術對于提高豬的繁殖性能是先進有效 的辦法。現(xiàn)代分子生物技術特別是分子標記輔助選擇技術的出現(xiàn)，為顯著改良該類性狀提 供了一條新的途徑。豬基因組研究進展為豬繁殖性狀的遺傳基礎提供可能。候選基因法和 QTL (Quantitative trait locus, QTL)定位被廣泛運用于豬繁殖性能的研究上。GDF2 (growth differentiation factor 2)基因也叫湖P-義是一組屬于轉化生 長因子(transforming growth factor β，TGF-β )超家族的多肽蛋白，在脊椎動物和無脊 椎動物的骨骼發(fā)育及器官形成中具有重要作用，并且調節(jié)多種類型細胞的生長和分化。BMP 對未分化的間充質細胞具有較強的定向分化為成骨細胞的能力，并能高效誘導骨和軟骨組 織的發(fā)生。在哺乳類、兩棲類和昆蟲類的胚胎發(fā)生、個體形成、非對稱器官的發(fā)育過程、造血 及免疫和炎癥反應中都具有一定的作用。BMI^s及其受體不僅能誘導成骨，而且在胚胎發(fā)育、 生殖、神經(jīng)、造血組織等的形成和分化中都起重要作用。BMP廣泛作用于卵巢生殖細胞，包括 各級卵母細胞、顆粒細胞、卵泡及黃體。近來研究證明BMP對卵泡發(fā)育調節(jié)是通過旁分泌進 行的。BMPs在某些哺乳動物卵巢卵泡發(fā)生過程起重要作用，具有調控顆粒細胞增殖和細胞 分化的作用，也對卵母細胞發(fā)育有作用。近幾年來，隨著基因工程技術的廣泛應用，BMP在 胚胎發(fā)育及生殖方面的研究日益受到關注。6 基因目前的研究非常少。迄今為止，尚未 將豬GDF2基因做為豬繁殖性狀的分子標記。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術的不足，提供一種與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記。本發(fā)明另一目的在于提供用于檢測上述SNP標記的引物。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述SNP標記的應用。本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)
與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記，在基因(ENSSSCG00000010375)的1號外顯子 70Ibp處有一個G/C堿基突變并導致了氨基酸的改變(Ala-114-Pro )，在GDF2基因的2號 外顯子4578bp處有一個T/C的堿基突變?yōu)橥x突變。
通過RFLP-PCR研究上述SNP標記的多態(tài)性，具體步驟如下 (1)從被檢測豬群豬耳樣本中提取豬基因組DNA ；
(2)根據(jù)據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫收錄的仰沒基因(ENSSSCG00000010375)序列，根據(jù)序列設 計引物擴增出待測SNP所在的核苷酸片段，利用RFLP-PCR的方法進行基因分型。RFLP-PCR 分型的原理是通過PCR擴增一段DNA片段，然后再選擇適當?shù)南拗菩詢惹忻福疨CR產(chǎn) 物，經(jīng)電泳可得到有特異性的電泳譜帶，從而達到鑒定不同基因型的目的。(3)據(jù)分型所到的結果，利用SAS軟件進行關聯(lián)分析。上述PCR擴增中，所用到的引物序列如SEQ ID NO:廣4所示。本發(fā)明與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記可用于篩選豬繁殖性狀分子標記。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明通過獲得與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記，可以用于篩選豬繁殖性狀分子標記， 在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中具有潛在的應用前景。


圖1為RFLP-PCR研究與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記的多態(tài)性的流程圖； 圖2為G+701C位點(左)R實MvaI酶切電泳檢測結果(右)；
圖3為T+4578C位點(左)及其RsaI酶切電泳檢測結果(右)。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1
1、豬耳組織樣的采集和DNA的提取
樣品均來源于華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司腰古豬場大白母豬。基因組DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法
(1)取耳組織樣約50mg，剪碎，加入200μ L置于細胞裂解液，100 μ LlOXTE混合，加 2 μ L蛋白酶K，置于55°C水浴過夜；
(2)消化完全后(過夜)，加入300yL氯仿混合，上下?lián)u動混勻1(T15min (動作輕柔以 保證DNA的完整性)；
(3)將混合液離心10，000rpm, 2min,然后取上清液約200 μ L置于1. 5mL的新離心管
中
(4)在離心管中加入250μ L沉淀液，混勻，室溫放置2min后，10，000 rpm離心2min ；
(5)倒掉上清液，立即加入1.2M的NaCl 50 μ L，輕輕振蕩到DNA完全溶解，加入2. 0 μ L 的foiase A,然后置于55°C水浴鍋中5-lOmin ；
(6)加入150 μ L 冰無水乙醇(_20°C)，10，000 rpm 離心 ^iiin ；
(7)倒掉乙醇，加入300μ L75%乙醇清洗，10，000 rpm離心2min ；
(8)倒掉75%乙醇，風干至無酒精味，加入50μL10XTE，37°C水浴溶解DNA ；4°C保存?zhèn)?用，若長期保存，應存放于-20。C冰箱。2、目的片段的獲得及RFLP-PCR分型(1)擴增含SNP位點的核苷酸片段
據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫收錄的基因(ENSSSCG00000010375)序列，根據(jù)表1中的序列 設計引物擴增出待測SNP所在的核苷酸片段
(2)針對2個不同的SNP位點選擇適當?shù)膬惹忻?，進行RFLP-PCR
G+701C位點和T+4578C位點分別用MvaI和RsaI內切酶進行RFLP-PCR。如 圖 2 和圖 3 所示，G+701C 位點分為 3 種基因型GG:320/121/59, CC:238/82/121/59 以及 GC:320/238/82/121/59 ；T+4578C 位點的 3 種基因型分別為 TT:901/199, TC: 901/698/203/199 以及 CC:698/203/199。3、基因型判定及關聯(lián)分析
根據(jù)RFLP-PCR的結果判定該位點在檢測群體中的基因型。實施例2
對豬6 基因G+701C位點和T+4578C位點不同基因型與豬繁殖性狀進行關聯(lián)分析的 檢測應用。豬GDF2基因G+701C位點和T+4578C位點分析結果如表1所示。表1 SNP位點在大白豬群體中的基因型頻率及等位基因頻率
權利要求
1.與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記，其特征在于所述標記在6 基因的1號外顯子 701bp處有一個G/C突變，在GDF2基因的2號外顯子4578bp處有一個T/C突變。
2.根據(jù)權利要求1所述的與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記，其特征在于用于檢測SNP標 記的引物如SEQ ID NO:廣4所示。
3.權利要求1所述與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記在豬繁殖性狀分子標記的篩選中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關的SNP標記及其應用。本發(fā)明SNP分子標記位于GDF2的G+701C和T+4578C位點。本發(fā)明通過設計引物，獲得的2個序列分別位于豬的GDF2基因的1、2號外顯子上，其中在Ensemble數(shù)據(jù)庫收錄的GDF2基因(ENSSSCG00000010375)序列第701bp處存在有1個G701→C701的堿基突變并且導致了氨基酸的改變(Ala-114-Pro)，在4578bp處存在有1個T4578→4578C的堿基突變?yōu)橥x突變，使用RFLP-PCR的方法來研究該位點的多態(tài)性。本發(fā)明為豬分子標記輔助選擇提供了一種新標記。
文檔編號C12N15/11GK102080081SQ20101055122
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權日2010年11月19日
發(fā)明者周曉寧, 張細權, 聶慶華, 賈新正 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學