專利名稱:高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵,特別是指一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的 方法。
背景技術(shù):
光合細菌作為一種營養(yǎng)豐富的光能自養(yǎng)菌,本身含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物 質(zhì),具有進行光合作用、發(fā)酵以及固氮、產(chǎn)氫等功能,近幾十年來受到廣泛的關(guān)注,在人類生 活的多方面都具有重要作用,在廢水處理、單細胞菌體蛋白生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、農(nóng)牧業(yè)、生產(chǎn)食 用色素等方面的應(yīng)用有著不可替代的生物學(xué)作用,特別是近年來作為生物制品的綠色、環(huán) 保作用更加受到各界人士的重視。隨著現(xiàn)代工業(yè)、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,傳統(tǒng)的光合 細菌生產(chǎn)的方法已不能滿足各行業(yè)的需求,大規(guī)模、高密度發(fā)酵生產(chǎn)已成為光合菌生產(chǎn)的 方向,選擇合適的菌株以及適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件是大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)步驟。
目前傳統(tǒng)的光合細菌生產(chǎn)一般有室內(nèi)和室外培養(yǎng)兩種方法。室內(nèi)培養(yǎng)適用比較少量的 生產(chǎn),用透明的玻璃瓶(桶)或塑料瓶(桶)作容器,白熾燈作光源,在30°C培養(yǎng),周期為7-10 天;室外培養(yǎng)適用規(guī)模較大的生產(chǎn),用透明的大桶作容器或在地上挖出池子,以日光為光源 和能源,受季節(jié)影響很大,一般在發(fā)酵溫度在高于25V,且低于35-38°C的季節(jié)才能生產(chǎn), 生產(chǎn)周期受氣溫的影響在5-15天不等,產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性也不能有效保障。并且傳統(tǒng)方法 生產(chǎn)光合細菌受季節(jié)等因素的影響不易進行規(guī)模化工業(yè)大生產(chǎn)。沼澤紅假單胞菌seudomonas /^h1Siri1S)是研究和應(yīng)用較為廣泛的一種 光合細菌,屬于外硫紅螺菌科紅假單胞菌屬,最佳生長方式是利用各種有機化合物作碳源 和電子供體進行光照厭氧培養(yǎng)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法,用兩 步法發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌,與傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法相比較具有生產(chǎn)周期短和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 的優(yōu)勢,更易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是
高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法,包括如下工藝步驟
A、將沼澤紅假單胞菌ASl.2349接種到種子培養(yǎng)基中,采用光照培養(yǎng)法進行擴大培養(yǎng) 制成種子液,按照體積比為種子培養(yǎng)基種子罐=200-300 1000的比例裝料,將種子培養(yǎng)基 滅菌后,按照體積比為原始菌種種子培養(yǎng)基=3-5 100的接種量將原始菌種接入種子罐, 培養(yǎng)條件為溫度,光照強度3000-4000LX,靜止培養(yǎng)4_6天,發(fā)酵液呈淡紅色,用顯 微鏡觀察計數(shù),菌體細胞卵形,生長正常,無雜菌污染,含菌量35-40億/毫升以上,終止培 養(yǎng);
B、將步驟A中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,采用暗培養(yǎng)法進行發(fā)酵制成沼澤紅假 單胞菌發(fā)酵液,按照體積比為發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵罐=60-70 100的比例裝料,將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后冷卻,按照體積比為種子液發(fā)酵培養(yǎng)基=8-10 100的接種量將步驟A中制成的種 子液接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵條件為溫度^_32°C,通風(fēng)量按照發(fā)酵液通風(fēng)量=1 0. 3-0. 5vvm,培養(yǎng)周期M-36小時,顯微鏡觀察菌體細胞生長正常,無雜菌,終止發(fā)酵;
其中步驟A、B中種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基pH=7. 0-7. 5,且由如下百分含量的原料組成 葡萄糖 0. 18%-0. 2% 硫酸銨 0. 18%-0. 22% 酵母膏 0. 12%-0. 18% 乙酸鈉0. 16%-0. 2% 氯化鈉0. 08%-0. 1% 余量為水。本發(fā)明中的具體的工藝步驟和工藝條件是
步驟A中種子培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121°C、時間20-30分鐘。步驟B中發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121_125°C、時間25_35分鐘,滅菌冷卻至 35°C以下后向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液。步驟B中終產(chǎn)物——沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)測 定活菌含量。本發(fā)明中發(fā)酵的檢測結(jié)果如下
河北省微生物研究所檢測中心按照《中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-光合細菌菌劑》(NY 527-2002)記載的方法,對利用本發(fā)明的方法制備的沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液進行測試,菌體 濃度可以達到70億/毫升以上,最高可以達到77. 6億/毫升(目前光合細菌產(chǎn)品沒有國家 標(biāo)準(zhǔn),國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求僅是不低于5億/毫升)。本發(fā)明所具備的實質(zhì)性特點和顯著的技術(shù)進步在于
1、生產(chǎn)周期短,發(fā)酵液中的菌體濃度高。采用上述培養(yǎng)基配方和生產(chǎn)工藝發(fā)酵生產(chǎn)沼 澤紅假單胞菌,發(fā)酵生產(chǎn)周期短,僅為M 36小時;菌體濃度可以達到70億/毫升以上。2、生產(chǎn)成本低,工藝容易控制。用兩步法發(fā)酵生產(chǎn)光合細菌原料的總固形物含量 不超過1%,且全部為市售化工原料,生產(chǎn)成本低廉,用通用式發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)工藝易控制, 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,可以達到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述,但不作為對本發(fā)明的限定,本發(fā)明的保 護范圍以權(quán)利要求書所記載的內(nèi)容為準(zhǔn),任何依據(jù)本發(fā)明說明書所作出的等效技術(shù)手段替 換,均不脫離本發(fā)明的保護范圍。實施例1
高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法,包括如下工藝步驟
A、將沼澤紅假單胞菌ASl.2349接種到種子培養(yǎng)基中,采用光照培養(yǎng)法進行擴大培養(yǎng) 制成種子液,按照體積比為種子培養(yǎng)基種子罐=200 1000的比例將原始菌種接入IOOOml 三角瓶中,將種子培養(yǎng)基滅菌后,按照體積比為原始菌種種子培養(yǎng)基=3 100的接種量將 菌種接入三角瓶中,培養(yǎng)條件為溫度,光照強度3000-4000LX,靜止培養(yǎng)4_6天,發(fā)酵液 呈淡紅色,用顯微鏡觀察計數(shù),菌體細胞卵形,生長正常,無雜菌污染,含菌量35-40億/毫 升以上,終止培養(yǎng);
B、將步驟A中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,采用暗培養(yǎng)法進行發(fā)酵制成沼澤紅假單 胞菌發(fā)酵液,按照體積比為發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵罐=60 100的比例裝料,將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后 冷卻,按照體積比為種子液發(fā)酵培養(yǎng)基=8 100的接種量將步驟A中制成的種子液接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵條件為溫度,通風(fēng)量按照發(fā)酵液通風(fēng)量=1 :0. 3vvm,培養(yǎng)周 期M-36小時,顯微鏡觀察菌體細胞生長正常,無雜菌,終止發(fā)酵;
其中步驟A、B中種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基pH=7.0,且由如下百分含量的原料組成 葡萄糖0. 18 硫酸銨0. 18% 酵母膏0. 12% 乙酸鈉0.16% 氯化鈉0.08% 余量為水。發(fā)酵罐采用通用式發(fā)酵罐。步驟A中種子培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121°C、時間20-30分鐘。步驟B中發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121_125°C、時間25_35分鐘,滅菌冷卻至 35°C以下后向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液。步驟B中終產(chǎn)物——沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)測 定活菌含量。實施例2
高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法,包括如下工藝步驟
A、將沼澤紅假單胞菌ASl.2349接種到種子培養(yǎng)基中,采用光照培養(yǎng)法進行擴大培養(yǎng) 制成種子液,按照體積比為種子培養(yǎng)基種子罐=300 1000的比例裝料,將種子培養(yǎng)基滅菌 后,按照體積比為原始菌種種子培養(yǎng)基=5 100的接種量將原始菌種接入種子罐,培養(yǎng)條 件為溫度32°C,光照強度3000-4000LX,靜止培養(yǎng)4_6天,發(fā)酵液呈淡紅色,用顯微鏡觀察計 數(shù),菌體細胞卵形,生長正常,無雜菌污染,含菌量35-40億/毫升以上,終止培養(yǎng);
B、將步驟A中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,采用暗培養(yǎng)法進行發(fā)酵制成沼澤紅假單 胞菌發(fā)酵液,按照體積比為發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵罐=70 100的比例裝料,將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后 冷卻,按照體積比為種子液發(fā)酵培養(yǎng)基=10 100的接種量將步驟A中制成的種子液接入 冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵條件為溫度32°C,通風(fēng)量按照發(fā)酵液通風(fēng)量=1 0. 5vvm,培養(yǎng) 周期M-36小時,顯微鏡觀察菌體細胞生長正常,無雜菌,終止發(fā)酵;
其中步驟A、B中種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基pH=7. 5,且由如下百分含量的原料組成 葡萄糖0. 2% 硫酸銨0. 22% 酵母膏0. 18% 乙酸鈉0.洲 氯化鈉0.1% 余量為水。發(fā)酵罐采用通用式發(fā)酵罐。步驟A中種子培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121°C、時間20-30分鐘。步驟B中發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121_125°C、時間25_35分鐘,滅菌冷卻至 35°C以下后向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液。步驟B中終產(chǎn)物——沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)測 定活菌含量。
權(quán)利要求
1.高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法,其特征在于包括如下工藝步驟A、將沼澤紅假單胞菌ASl.2349接種到種子培養(yǎng)基中,采用光照培養(yǎng)法進行擴大培養(yǎng) 制成種子液,按照體積比為種子培養(yǎng)基種子罐=200-300 1000的比例裝料,將種子培養(yǎng)基 滅菌后,按照體積比為原始菌種種子培養(yǎng)基=3-5 100的接種量將原始菌種接入種子罐, 培養(yǎng)條件為溫度,光照強度3000-4000LX,靜止培養(yǎng)4_6天,發(fā)酵液呈淡紅色,用顯 微鏡觀察計數(shù),菌體細胞卵形,生長正常,無雜菌污染,含菌量35-40億/毫升以上,終止培 養(yǎng);B、將步驟A中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,采用暗培養(yǎng)法進行發(fā)酵制成沼澤紅假 單胞菌發(fā)酵液,按照體積比為發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵罐=60-70 100的比例裝料,將發(fā)酵培養(yǎng)基 滅菌后冷卻,按照體積比為種子液發(fā)酵培養(yǎng)基=8-10 100的接種量將步驟A中制成的種 子液接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵條件為溫度^_32°C,通風(fēng)量按照發(fā)酵液通風(fēng)量=1 0. 3-0. 5vvm,培養(yǎng)周期M-36小時,顯微鏡觀察菌體細胞生長正常,無雜菌,終止發(fā)酵;其中步驟A、B中種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基pH=7. 0-7. 5,且由如下百分含量的原料組成葡萄糖 0. 18%-0. 2% 硫酸銨 0. 18%-0. 22% 酵母膏 0. 12%-0. 18%乙酸鈉0. 16%-0. 2% 氯化鈉0. 08%-0. 1% 余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法,其特征在于所 述的步驟A中種子培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121°C、時間20-30分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法,其特征在于 步驟B中發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌條件為溫度121-125°C、時間25-35分鐘,滅菌冷卻至35°C以下 后向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵,特別是指一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液的方法。以沼澤紅假單胞菌AS1.2349作為原始菌種,依次采用光照培養(yǎng)法進行擴培,將擴培制成的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基采用暗培養(yǎng)法進行發(fā)酵制成沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的周期長、產(chǎn)品質(zhì)量不易得到控制等問題。具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12R1/38GK102061279SQ201010552678
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者唐兆宏, 李軍, 李賓, 章淑艷, 趙叢波, 陳文杰, 馬清河, 魏亞新 申請人:河北省微生物研究所