專利名稱：人工胸腺、人工中樞免疫耐受缺損模型及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及一種人工胸腺、人工中樞免疫耐受缺損模型及其制備方法與應(yīng) 用，屬于細(xì)胞和器官工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中樞免疫耐受的維持對(duì)于機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、正常淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生、抵御外來(lái)異 物的侵襲等具有極其重要的意義。目前，對(duì)于中樞免疫耐受恒常性維持的分子機(jī)制的研究 才剛剛起步(Science. 2008,321 :843-847 ；Immunity. 2008,29 :423-437)；而對(duì)于中樞免疫 耐受維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定如維持母-胎免疫耐受、避免自身免疫疾病發(fā)生的機(jī)理、中樞免 疫耐受是否影響移植物的存活、中樞免疫耐受在癌癥、糖尿病等疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的 確切作用等仍然知之甚少。因此，建立一個(gè)合適的中樞免疫耐受缺損模型來(lái)揭示中樞免疫 耐受對(duì)這些生命活動(dòng)的影響已勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種人工胸腺的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供通過(guò)所述制備方法得到的人工胸腺和利用該人工胸 腺得到的人工中樞免疫耐受缺損模型。本發(fā)明的再一目的在于提供所述人工中樞免疫耐受缺損模型的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種人工胸腺的制備方法，包括以下步 驟(1)將除去淋巴細(xì)胞的小鼠胎兒胸腺置于含有胰蛋白酶和DNase I的PBS溶液 中，37°C下培養(yǎng)至整個(gè)胸腺分散為單個(gè)的細(xì)胞；接著加入相當(dāng)于前述溶液3倍體積的不含 2'-脫氧鳥(niǎo)苷的RlO培養(yǎng)基以終止反應(yīng)，過(guò)濾，離心，取沉淀，得到胸腺細(xì)胞；(2)將含有抑制小鼠TRAF6基因表達(dá)的shRNA的慢病毒質(zhì)粒、pCMV-VSV-G-RSV-Rev 以及pCAG-HIVgp質(zhì)粒按照質(zhì)量比5 2 2的比例導(dǎo)入到人胚腎細(xì)胞中，培養(yǎng)，去除 細(xì)胞，過(guò)濾，濃縮，得到含有抑制小鼠TRAF6基因表達(dá)的shRNA的病毒液；(3)將步驟(1)制備的胸腺細(xì)胞懸浮于步驟( 制備的病毒液中，病毒的用量為 300iu/個(gè)細(xì)胞，再添加polybrene、青霉素和鏈霉素；然后將胸腺細(xì)胞/病毒混懸液移至培 養(yǎng)板中，25°C以800 IOOOrpm的速度離心2小時(shí)，再加入與胸腺細(xì)胞/病毒混懸液等體積 的不含2 ’ -脫氧鳥(niǎo)苷的RlO培養(yǎng)基，培養(yǎng)30min ；收集胸腺細(xì)胞/病毒混懸液，接著離心， 除去上清液，利用殘留的液體將胸腺細(xì)胞均勻地懸浮，將混懸的胸腺細(xì)胞重新置于核孔濾 膜上，然后將載有這些胸腺細(xì)胞的核孔濾膜置于不含2'-脫氧鳥(niǎo)苷的RlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 24小時(shí)后，這些胸腺細(xì)胞重新聚集形成含有抑制小鼠TRAF6基因表達(dá)的慢病毒shRNA質(zhì)粒 的人工胸腺；所述除去淋巴細(xì)胞的小鼠胎兒胸腺優(yōu)選通過(guò)以下步驟得到將小鼠胎兒的胸腺置于核孔濾膜上，然后將載有胸腺的核孔濾膜放于RlO培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，除去胸腺中的淋巴 細(xì)胞；所述的小鼠優(yōu)選為BALB/C小鼠；所述的RlO培養(yǎng)基的成分如下在RPMI1640培養(yǎng)基中添加胎牛血清、L-谷氨酰 胺、青霉素、鏈霉素、巰基乙醇和2'-脫氧鳥(niǎo)苷，其中胎牛血清的使用濃度為體積百分 比10%，L-谷氨酰胺的使用濃度為2mM，青霉素的使用濃度為100U/ml，鏈霉素的使用濃度 為100mg/ml，β -巰基乙醇的使用濃度為50mM，2'-脫氧鳥(niǎo)苷的使用濃度為1. 35mM ；所述的PBS 溶液的組成為=KCl 0. 2g，KH2PO4 0. 2g，NaCl 8g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g， pH 值 7. 2，定容至 IOOOml ；步驟(1)中所述胰蛋白酶的使用濃度優(yōu)選為質(zhì)量體積比0. 25% ；步驟(1)中所述的PBS溶液還含有EDTA，EDTA的使用濃度為質(zhì)量體積比0. 02% ；步驟(1)中所述DNase I的使用濃度優(yōu)選為質(zhì)量體積比；步驟(1)中所述的過(guò)濾優(yōu)選通過(guò)孔徑為30 μ m的尼龍膜進(jìn)行；步驟(1)中所述的離心優(yōu)選為室溫下1500rpm離心5min ；步驟O)中所述含有抑制小鼠TRAF6基因表達(dá)的shRNA的慢病毒質(zhì)粒優(yōu)選為 CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA 重組質(zhì)粒；步驟O)中所述的過(guò)濾優(yōu)選為通過(guò)孔徑為0. 45 μ m的PVDF濾器過(guò)濾；步驟⑵中所述的離心的條件優(yōu)選為20°C，35000rpm離心35min ；步驟(3)中所述的polybrene的使用濃度優(yōu)選為5 μ g/ml ；步驟(3)中所述的青霉素的使用濃度優(yōu)選為100U/ml ；步驟(3)中所述的鏈霉素的使用濃度優(yōu)選為100mg/ml ；上述細(xì)胞的培養(yǎng)優(yōu)選于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行；一種人工胸腺，通過(guò)上述方法得到；所述人工胸腺應(yīng)用于制備中樞免疫耐受缺損模型，包括以下步驟將所述人工胸 腺移植到6周齡的無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜下，飼養(yǎng)6 8周，該小鼠即為人工中樞免疫 耐受缺損模型；一種人工中樞免疫耐受缺損模型，通過(guò)上述制備方法得到；所述的人工中樞免疫耐受缺損模型可用于中樞免疫耐受維持的分子機(jī)制研究，也 可用于探討中樞免疫耐受維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)理研究，還可用于探索中樞免疫耐受在 癌癥、糖尿病等疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用等。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果當(dāng)前，關(guān)于中樞免疫耐受的研究 主要利用調(diào)控中樞免疫耐受的基因缺損小鼠來(lái)進(jìn)行，這些基因缺損小鼠全球僅少數(shù)實(shí)驗(yàn)室 擁有，尚不能廣泛用于中樞免疫耐受的研究中。同時(shí)，也缺乏其他的模型可供利用。本發(fā) 明利用慢病毒將控制中樞免疫耐受的基因特異性shRNA質(zhì)粒導(dǎo)入胸腺細(xì)胞，利用表達(dá)的 shRNA抑制目的基因的功能，從而誘導(dǎo)中樞免疫耐受缺損。這種模型具有與控制中樞免疫 耐受的基因缺損小鼠相似的特點(diǎn)，可以用于各種中樞免疫耐受相關(guān)研究中。同時(shí)，本發(fā)明也 展示了一種嶄新的制備中樞免疫耐受缺損的方法，它避免了傳統(tǒng)的基因缺損小鼠制備過(guò)程 中的各種復(fù)雜環(huán)節(jié)，非常簡(jiǎn)便、實(shí)用。這種方法不僅可用于人工中樞免疫耐受缺損模型的制 備，而且能用于中樞免疫耐受維持的分子機(jī)制研究中，為中樞免疫耐受分子機(jī)制的研究提供了一種新途徑、新方法。


圖1是FACS分析培養(yǎng)48小時(shí)的人工胸腺中GFP的表達(dá)情況圖，其中A為對(duì)照組； B為實(shí)驗(yàn)組。圖2是免疫染色檢測(cè)培養(yǎng)48小時(shí)的人工胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞照片圖，其中A為對(duì) 照組；B為實(shí)驗(yàn)組。圖3是人工胸腺培養(yǎng)M小時(shí)后，手術(shù)移植到6周齡的無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜 下，飼養(yǎng)8周后的胸腺圖(箭頭所示)，其中A為對(duì)照組；B為實(shí)驗(yàn)組。圖4是人工胸腺移植到無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜下生長(zhǎng)8周后，冷凍切片，熒光 顯微鏡檢測(cè)熒光表達(dá)圖，其中A為對(duì)照組；B為實(shí)驗(yàn)組。圖5是人工胸腺移植到無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜下生長(zhǎng)8周后，冷凍切片， UEA-I (箭頭所示)檢測(cè)成熟的胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞圖，其中A為對(duì)照組；B為實(shí)驗(yàn)組。圖6是移植人工胸腺后飼養(yǎng)8周的小鼠脾臟圖，其中A為對(duì)照組；B為實(shí)驗(yàn)組。圖7是移植人工胸腺后飼養(yǎng)8周的小鼠脾臟中的⑶4、⑶8T淋巴細(xì)胞的比率圖，其 中A為對(duì)照組；B為實(shí)驗(yàn)組。圖8是移植人工胸腺后飼養(yǎng)8周的小鼠脾臟中CD4T細(xì)胞中活化的淋巴細(xì)胞的比 率圖，其中A為對(duì)照組；B為實(shí)驗(yàn)組。圖9是無(wú)胸腺的雌性小鼠移植人工胸腺后飼養(yǎng)8周，HE染色的小鼠肺切片圖，其 中箭頭所示部位為出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的部位，A為對(duì)照組，B為實(shí)驗(yàn)組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1(1)乙醚麻醉后頸椎脫臼處死妊娠14天的BALB/C小鼠(購(gòu)自日本SLC公 司)，取出胎兒，從胎兒中分離胸腺，將胸腺置于核孔濾膜(Nucleopore filter，購(gòu)自 Whatmann公司)上，然后將載有胸腺的核孔濾膜放于RlO培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成成分如 下:RPMI1640(購(gòu)自 Invitrogen 公司)，體積百分比 10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS,購(gòu)自Equitech-Bio公司)，2mM L-glutamine (購(gòu)自日本和光公司)，100U/ml青霉素和 100mg/ml鏈霉素(購(gòu)自Sigma公司)，50mM的β -巰基乙醇(購(gòu)自日本和光公司)，1. 35mM 2'-deoxyguanosine (2-DG, 2‘-脫氧鳥(niǎo)苷，購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司)，于含 5% CO2 的潮 濕培養(yǎng)箱中，37°C下培養(yǎng)培養(yǎng)5天，除去胸腺中的淋巴細(xì)胞。(2)將除去淋巴細(xì)胞的胸腺置于最終濃度為質(zhì)量體積比0.25% Trypsin(購(gòu)自 Sigma公司)、質(zhì)量體積比0. 02% EDTA(購(gòu)自Sigma公司)，質(zhì)量體積比DNaseI(購(gòu)自 TAKARA 公司)的 PBS 溶液(KCl 0. 2g, KH2PO4O. 2g,NaCl 8g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，pH 值 7. 2， 定容至1000ml，下同)中，37°C培養(yǎng)30分鐘，其間每間隔10分鐘使用移液器分散胸腺細(xì)胞 1次，將整個(gè)胸腺分散為單個(gè)的細(xì)胞；加入前述溶液3倍體積量的不含2-DG的RlO培養(yǎng)基終 止反應(yīng)，通過(guò)孔徑為30 μ m的尼龍膜(購(gòu)自日本Exigen公司)過(guò)濾后，離心沉淀(1500rpm，室溫，5分鐘)，除去上清液，PBS溶液洗滌1次，離心沉淀(1500rpm，室溫，5分鐘)除去上 清液，備用。一個(gè)完全除去淋巴細(xì)胞的胸腺可以獲得2 IOxlO4個(gè)胸腺細(xì)胞。(3)采用鈣-磷質(zhì)粒導(dǎo)入法(步驟見(jiàn) http://www. brc. riken. jp/lab/cfm)，將 CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重組質(zhì)粒(已在申請(qǐng)?zhí)枮?01010019508.8的國(guó)家發(fā)明專利公 開(kāi))、pCMV-VSV-G-RSV-Rev以及pCAG-HIVgp質(zhì)粒(均購(gòu)自日本理化學(xué)研究所，http:// www. brc. riken. jp/lab/cfm)按照質(zhì)量比5 2 2的比例導(dǎo)入到70 80 %融合的 人胚腎細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)中，為實(shí)驗(yàn)組；以CS-RfA-EG(購(gòu)自日本理化學(xué)研究所)、 pCMV-VSV-G-RSV-Rev以及pCAG-HIVgp按照質(zhì)量比5 2 2的比例導(dǎo)入到人胚腎細(xì) 胞，為對(duì)照組；搜集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，1500rpm,室溫下離心5分鐘后，上清液通過(guò)孔徑為 0. 45 μ m 的 PVDF 濾器(購(gòu)自 Millipore 公司)過(guò)濾，即得到 CS-RfA-EG-TRAF6_shRNA 重組 質(zhì)粒(用于實(shí)驗(yàn)組)或者含有CS-RfA-EG質(zhì)粒(用于對(duì)照組)的病毒液。利用超高速離心機(jī)(購(gòu)自Beckman公司)對(duì)上述病毒液分別離心(TLA100. 3轉(zhuǎn)子， 35000rpm, 20°C，35分鐘)，除去上清液，將病毒沉淀重懸于體積百分比0. 1 %原培養(yǎng)液體積 的PBS溶液或者RPMI1640培養(yǎng)基中中，得到濃縮的病毒液。利用人胚腎細(xì)胞測(cè)定這 些濃縮后的病毒液的感染滴度(具體方法詳見(jiàn)http://www. brc. riken. jp/lab/cfm ；這種 濃縮后的病毒液的感染滴度約為1 hl09iu/ml)。濃縮后的病毒液可保存于_70°C下。(4)將步驟⑵獲得的5 IOxIO5個(gè)胸腺細(xì)胞混懸于步驟(3)制得的濃縮后的病 毒液中，病毒的用量為300iu/個(gè)細(xì)胞，再添加5μ g/ml的polybrene (購(gòu)自Sigma公司)， 100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素，然后將胸腺細(xì)胞/病毒混懸液移至NUNC培養(yǎng) 板中，將培養(yǎng)板于25°C、IOOOrpm離心2小時(shí)后，加入與胸腺細(xì)胞/病毒混懸液等量的不含 2-DG的RlO培養(yǎng)基，于5% (X)2的潮濕培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)培養(yǎng)30分鐘。收集胸腺細(xì)胞/ 病毒混懸液，1500rpm，室溫下離心5分鐘，除去上清液，利用殘留的液體將胸腺細(xì)胞均勻地 懸浮，最終體積大約為0. 5 μ 1 (注體積最大不能超過(guò)1 μ 1)，將混懸的胸腺細(xì)胞重新置于 核孔濾膜(購(gòu)自Whatmarm公司)上，然后將載有這些胸腺細(xì)胞的核孔濾膜置于不含2-DG 的RlO培養(yǎng)基上于5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)M小時(shí)后，這些胸腺細(xì)胞重新聚集形 成含有CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重組質(zhì)粒的人工胸腺，為實(shí)驗(yàn)組；利用同樣方法獲得含有 CS-RfA-EG質(zhì)粒的人工胸腺，為對(duì)照組。(5)人工胸腺細(xì)胞中慢病毒shRNA質(zhì)粒導(dǎo)入率的檢測(cè)將上述實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的人工胸腺于5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)培養(yǎng)48 小時(shí)后，將人工胸腺置于 0. 25 % Trypsin/EDTA/PBS (含 0. 25 % Trypsin, 0. 02 % EDTA 的 PBS 溶液(PH7. 2))中，37°C下培養(yǎng)30分鐘，將人工胸腺分散為單個(gè)細(xì)胞。流式細(xì)胞儀(FACS)檢 測(cè)質(zhì)粒的導(dǎo)入率(質(zhì)粒導(dǎo)入后，細(xì)胞表達(dá)GFP)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的質(zhì)粒的導(dǎo)入率 均為75%以上(如圖1所示)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色(方法見(jiàn)The tumor necrosis factor family receptors RANK and CD40cooperatively establish the thymic medullary microenvironment and self-tolerance。 Immunity, 2008, 29 :423-437)也檢 則至Ij 表達(dá) keratin 5 (胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞marker之一，抗體購(gòu)自Covance公司)的細(xì)胞也同時(shí)表達(dá) GFP(如圖2所示)，keratin 5陽(yáng)性為紅色，表達(dá)GFP為綠色。(6)人工胸腺的移植和人工中樞免疫耐受缺損模型的制備將步驟中培養(yǎng)M小時(shí)后的導(dǎo)入CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重組質(zhì)粒的人工胸腺，手術(shù)移植到6周齡的無(wú)胸腺的雌性BALB/C小鼠腎臟莢膜下，飼養(yǎng)6 8周，這些小鼠即 為人工中樞免疫耐受缺損模型，為實(shí)驗(yàn)組。同樣，將步驟(4)中的導(dǎo)入CS-RfA-EG質(zhì)粒的人 工胸腺培養(yǎng)M小時(shí)后，手術(shù)移植到6周齡的無(wú)胸腺的雌性BALB/C小鼠腎臟莢膜下，飼養(yǎng) 6 8周，這些小鼠作為對(duì)照組。(7)人工中樞免疫耐受缺損模型的鑒定人工胸腺移植后6 8周，乙醚麻醉后頸椎脫臼處死BALB/C小鼠。檢測(cè)以下項(xiàng) 目①人工胸腺在無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜下的生長(zhǎng)發(fā)育情況。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照 組的人工胸腺都能在無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜下生長(zhǎng)發(fā)育長(zhǎng)大(如圖3所示)。實(shí) 驗(yàn)組和對(duì)照組的人工胸腺在無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜下生長(zhǎng)6 8周后，這些胸腺的 冷凍切片在熒光顯微鏡下檢測(cè)能觀察到熒光(GFP)表達(dá)(如圖4所示)，表明實(shí)驗(yàn)組含 CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重組質(zhì)粒以及對(duì)照組含慢病毒CS-RfA-EG質(zhì)粒的人工胸腺在無(wú)胸 腺雌性小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)仍然能發(fā)揮其功能。②利用UEA-I抗體(購(gòu)自VECTOR Laboratories公司)染色檢測(cè)小鼠體內(nèi)的人 工胸腺冷凍切片(染色方法見(jiàn) Jhe tumor necrosis factor family receptors RANK and CD40cooperatively establish the thymic medullary microenvironment and self-tolerance。Immunity, 2008, 29 :423-437)，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)移植后實(shí)驗(yàn)組人工胸腺與對(duì)照組 人工胸腺相比，UEA-I陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(注UEA-1為胸腺髓質(zhì)成熟上皮細(xì)胞marker)(如 圖5所示)，表明導(dǎo)入CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA重組質(zhì)粒的人工胸腺在無(wú)胸腺的雌性小鼠腎 臟莢膜下生長(zhǎng)后，人工胸腺髓質(zhì)成熟上皮細(xì)胞明顯減少。③檢測(cè)移植人工胸腺7周后的小鼠發(fā)現(xiàn)，移植實(shí)驗(yàn)組人工胸腺的小鼠脾臟比移植 對(duì)照組人工胸腺的小鼠脾臟明顯增大(如圖6所示)。④移植實(shí)驗(yàn)組人工胸腺7周后的小鼠脾臟中的⑶4、⑶8T淋巴細(xì)胞的比率與移植 對(duì)照組人工胸腺的小鼠脾臟中的⑶4、⑶8T淋巴細(xì)胞的比率沒(méi)有明顯差異(如圖7所示)。 然而移植實(shí)驗(yàn)組人工胸腺的小鼠脾臟中活化的T淋巴細(xì)胞(CD44陽(yáng)性)的比率比移植對(duì)照 組人工胸腺的小鼠脾臟中活化的T淋巴細(xì)胞的比率明顯增加(如圖8所示)。⑤移植人工胸腺8周后的小鼠肺的HE染色(染色方法見(jiàn)The tumor necrosis factor family receptors RANK and CD40cooperatively establish the thymic medullary microenvironment and self-tolerance。Immunity, 2008,29 :423-437)顯不 移植實(shí)驗(yàn)組人工胸腺的小鼠肺出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖9所示)，與TRAF6缺損小鼠的癥狀 相似(見(jiàn) Dependence of Self-tolerance on TRAF6_directed Development of Thymic Stroma. Science. 2005,308 :248-251)，而相同處理的移植對(duì)照組人工胸腺的小鼠卻沒(méi)有。這一系列現(xiàn)象表明，移植實(shí)驗(yàn)組人工胸腺(即TRAF6表達(dá)被抑制的人工胸腺)的 小鼠發(fā)生了中樞免疫耐受的缺損，同時(shí)表明建立的人工中樞免疫耐受缺損模型是成功的。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種人工胸腺的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將除去淋巴細(xì)胞的小鼠胎兒胸腺置于含有胰蛋白酶和DNaseI的PBS溶液中，37°C 下培養(yǎng)至整個(gè)胸腺分散為單個(gè)的細(xì)胞；接著加入相當(dāng)于前述溶液3倍體積的不含2'-脫 氧鳥(niǎo)苷的RlO培養(yǎng)基以終止反應(yīng)，過(guò)濾，離心，取沉淀，得到胸腺細(xì)胞；(2)將含有抑制小鼠TRAF6基因表達(dá)的shRNA的慢病毒質(zhì)粒、pCMV-VSV-G-RSV-Rev以 及pCAG-HIVgp質(zhì)粒按照質(zhì)量比5 2 2的比例導(dǎo)入到人胚腎細(xì)胞中，培養(yǎng)，去除細(xì) 胞，過(guò)濾，濃縮，得到含有抑制小鼠TRAF6基因表達(dá)的shRNA的病毒液；(3)將步驟⑴制備的胸腺細(xì)胞懸浮于步驟(2)制備的病毒液中，病毒的用量為 300iu/個(gè)細(xì)胞，再添加polybrene、青霉素和鏈霉素；然后將胸腺細(xì)胞/病毒混懸液移至培 養(yǎng)板中，25°C以800 IOOOrpm的速度離心2小時(shí)，再加入與胸腺細(xì)胞/病毒混懸液等體積 的不含2’ -脫氧鳥(niǎo)苷的RlO培養(yǎng)基，培養(yǎng)30min ；收集胸腺細(xì)胞/病毒混懸液，接著離心， 除去上清液，利用殘留的液體將胸腺細(xì)胞均勻地懸浮，將混懸的胸腺細(xì)胞重新置于核孔濾 膜上，然后將載有這些胸腺細(xì)胞的核孔濾膜置于不含2'-脫氧鳥(niǎo)苷的RlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 24小時(shí)后，這些胸腺細(xì)胞重新聚集形成含有抑制小鼠TRAF6基因表達(dá)的慢病毒shRNA質(zhì)粒 的人工胸腺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述人工胸腺的制備方法，其特征在于所述除去淋巴細(xì)胞的小鼠 胎兒胸腺通過(guò)以下步驟得到將小鼠胎兒的胸腺置于核孔濾膜上，然后將載有胸腺的核孔 濾膜放于RlO培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，除去胸腺中的淋巴細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述人工胸腺的制備方法，其特征在于所述的小鼠為BALB/C小鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述人工胸腺的制備方法，其特征在于 步驟(1)中所述胰蛋白酶的使用濃度為質(zhì)量體積比0.25% ； 步驟(1)中所述DNase I的使用濃度為質(zhì)量體積比；步驟(1)中所述的PBS溶液還含有EDTA，EDTA的使用濃度為質(zhì)量體積比0. 02% ； 步驟(1)中所述的過(guò)濾通過(guò)孔徑為30 μ m的尼龍膜進(jìn)行； 步驟(1)中所述的離心為室溫下1500rpm離心5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述人工胸腺的制備方法，其特征在于步驟O)中所述含有抑制小鼠TRAF6基因表達(dá)的shRNA的慢病毒質(zhì)粒為 CS-RfA-EG-TRAF6-shRNA 重組質(zhì)粒；步驟O)中所述的過(guò)濾為通過(guò)孔徑為0. 45 μ m的PVDF濾器過(guò)濾； 步驟O)中所述的離心的條件為20°C，35000rpm離心35min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述人工胸腺的制備方法，其特征在于 步驟⑶中所述的polybrene的使用濃度為5μ g/ml ； 步驟(3)中所述的青霉素的使用濃度為100U/ml ；步驟(3)中所述的鏈霉素的使用濃度為100mg/ml。
7.一種人工胸腺，通過(guò)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述制備方法得到。
8.—種人工中樞免疫耐受缺損模型的制備方法，其特征在于將權(quán)利要求7所述的人 工胸腺移植到6周齡的無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜下，飼養(yǎng)6 8周，得到人工中樞免疫耐 受缺損模型。
9.一種人工中樞免疫耐受缺損模型，通過(guò)權(quán)利要求8所述的制備方法得到。
10.權(quán)利要求9所述的人工中樞免疫耐受缺損模型應(yīng)用于中樞免疫耐受維持的分子機(jī) 制研究、用于探討中樞免疫耐受維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)理研究以及探索中樞免疫耐受在 疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種人工胸腺、人工中樞免疫耐受缺損模型及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明將除去淋巴細(xì)胞的胎鼠胸腺細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，利用慢病毒將控制中樞免疫耐受的基因特異性shRNA質(zhì)粒導(dǎo)入胸腺細(xì)胞，再將這些胸腺細(xì)胞重新構(gòu)建成人工胸腺，植入6周齡的無(wú)胸腺的雌性小鼠腎臟莢膜下，飼養(yǎng)6～8周，這些小鼠為人工中樞免疫耐受缺損模型。該人工中樞免疫耐受缺損模型具有與控制中樞免疫耐受的基因缺損小鼠模型相似的特點(diǎn)，表現(xiàn)為脾臟腫大，器官炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，T淋巴細(xì)胞活性增加等。該人工中樞免疫耐受缺損模型用于中樞免疫耐受維持的分子機(jī)制研究、探討中樞免疫耐受維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)理研究及探索中樞免疫耐受在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用等。
文檔編號(hào)C12N15/86GK102061286SQ20101055398
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者井上純一郎, 秋山泰身, 秦俊文, 謝琪璇, 馬清河, 黃軍 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)