專利名稱：熒光素酶的慢病毒載體表達系統(tǒng)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光素酶的慢病毒載體表達系統(tǒng)及其用途。
背景技術(shù)：
隨著腫瘤分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，腫瘤起始和進展的相關(guān)機理研究獲得了長足的進步。越來越多的癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)，使人們對許多種腫瘤發(fā)生發(fā)展初期的生物學(xué)事件有了相對清晰的了解。然而，腫瘤發(fā)展的晚期事件——周圍器官侵襲和遠端組織轉(zhuǎn)移， 則仍屬于一個亟待探索的領(lǐng)域，而它們恰恰是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。數(shù)據(jù)顯示，腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的病人死亡占了腫瘤所致死亡事件的90%。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的生物學(xué)行為，包含了侵犯血管、隨血液運輸、遠端種植等許多相關(guān)的連續(xù)步驟，因此簡單的體外實驗無法模擬，必須借助于有效的動物模型才有可能對其進行較好的研究。目前建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型的方法主要分兩類一是利用轉(zhuǎn)基因或者化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的方法先建立動物腫瘤模型，然后觀察其是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，第二種則是把人類腫瘤細胞或者腫瘤組織原位接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，再觀察其轉(zhuǎn)移的情況。實際上，這兩種方法都是先建立體內(nèi)腫瘤模型，然后讓腫瘤進展，在動物衰竭前處死取樣分析，以獲得腫瘤轉(zhuǎn)移的信息。該方法有兩個明顯的缺陷其一是只能檢測動物在實驗觀察終點時的狀態(tài)， 無法在腫瘤進展過程實時監(jiān)測轉(zhuǎn)移的發(fā)生位置，如前所述，轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)的復(fù)雜過程，只能觀察一時間點的模型顯然無法向本發(fā)明人展示轉(zhuǎn)移過程的全貌，而若能實時獲得腫瘤轉(zhuǎn)移的量化數(shù)據(jù)則能為本發(fā)明人對轉(zhuǎn)移的研究提供一個更好的平臺；其二是對轉(zhuǎn)移灶的鑒定一般只能通過免疫組化進行，要求必須對所有的可能轉(zhuǎn)移器官進行大范圍的切片，過程較為繁瑣，如果切片不完全則有可能遺漏潛在的微小轉(zhuǎn)移灶，使用更為敏感和高效的檢測手段是改進的必由之路。熒光素酶(Luciferase，Luc)是一種生物體內(nèi)催化底物熒光素(Iuciferin)發(fā)生氧化反應(yīng)而發(fā)光的酶。目前，Luc基因不僅被廣泛地應(yīng)用于報告基因檢測體系，通過采用活體成像技術(shù)，還可以準(zhǔn)確地用于檢測經(jīng)熒光素酶修飾的細胞體內(nèi)定位及增殖情況，為惡性腫瘤的體內(nèi)增殖及轉(zhuǎn)移的研究提供了有效的檢測手段。已有研究表明帶有Luc基因的腫瘤細胞在動物體內(nèi)成瘤之后，借助于靈敏的活體成像系統(tǒng)，通過檢測Luc發(fā)光強度，可間接反映出細胞的數(shù)量、腫瘤的大小和腫瘤轉(zhuǎn)移位置?；铙w成像技術(shù)已經(jīng)成為近年來動物模型研究最重要的進展。利用這一系統(tǒng)可以觀測活體模型動物體內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及對藥物的反應(yīng)，是研究腫瘤發(fā)展及抗腫瘤藥物篩選和評價的新興手段。目前所建立的活體成像模型，多使用轉(zhuǎn)染了表達熒光素酶的質(zhì)粒，或者感染了表達熒光素酶的病毒的細胞系，而鮮有使用臨床腫瘤組織的報道。本發(fā)明人的發(fā)明則是利用熒光素酶標(biāo)記人的肝癌組織，建立了可進行持續(xù)傳代，用于活體成像，可以實時監(jiān)測腫瘤在體內(nèi)的生長及轉(zhuǎn)移情況的小鼠原位移植肝癌轉(zhuǎn)移模型。由于本發(fā)明人使用的是肝癌的臨床樣本，所建立的模型更能體現(xiàn)腫瘤的生理特性，是對現(xiàn)有腫瘤轉(zhuǎn)移模型的優(yōu)化和改進。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一方面提供一種熒光素酶慢病毒表達載體，該表達載體以rei2載體為骨架構(gòu)建，含有CMV啟動子及熒光素酶基因。在一具體實施方式
中，所述熒光素酶基因的序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明第二方面提供一種熒光素酶慢病毒載體表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)含有本發(fā)明的熒光素酶慢病毒表達載體和包裝質(zhì)粒。在一具體實施例中，所述包裝質(zhì)粒選自pRSVREV、pMDLg/pRRE和pHCMVG。本發(fā)明第三方面提供一種分離的癌細胞，該細胞被本發(fā)明的熒光素酶慢病毒表達載體感染并穩(wěn)定表達熒光素酶。本發(fā)明第四方面提供一種細胞培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物含有本發(fā)明所述的癌細胞。在一具體實施例中，培養(yǎng)物中80%以上的細胞為表達熒光素酶的陽性細胞。本發(fā)明第四方面提供一種分離的癌組織，所述癌組織含有本發(fā)明所述的癌細胞。本發(fā)明第五方面提供一種標(biāo)記腫瘤組織的方法，所述方法包括將本發(fā)明所述的分離的癌細胞注射到由其來源與所述分離的癌細胞的來源相同的腫瘤組織皮下移植生長形成的瘤塊中，并允許注射入的表達熒光素酶的癌細胞生長增殖成為被熒光素酶成功標(biāo)記的腫瘤組織。本發(fā)明第五方面提供一種構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移模型的方法，所述方法包括將本發(fā)明的腫瘤組織移植到該動物模型的同源組織中，從而構(gòu)建得到原位移植的腫瘤轉(zhuǎn)移模型。本發(fā)明還提供所述分離的癌細胞或細胞培養(yǎng)物在標(biāo)記組織腫瘤中的應(yīng)用；或所述分離的癌細胞、細胞培養(yǎng)物或分離的癌組織在標(biāo)記腫瘤組織或構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移模型中的應(yīng)用。


圖IA顯示感染表達熒光素酶的慢病毒后的AGS細胞明場照片。圖IB顯示由于表達熒光素酶的慢病毒載體上帶有GFP報告基因，因此可以使用GFP進行分選得到80%以上表達熒光素酶的陽性細胞。圖中所示為A圖細胞的綠色熒光照片。圖IC顯示加入熒光素酶底物后進行生物發(fā)光測定，感染了慢病毒的AGS細胞有很強的熒光素酶活性(縱坐標(biāo)顯示出Luc值)。圖2顯示標(biāo)記有熒光素酶的PVTT-I原位移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。圖3A顯示熒光素酶標(biāo)記的人肝癌原位移植的裸鼠模型中，裸鼠所荷的肝原位移植瘤的HE染色，體現(xiàn)了典型的肝癌組織特征。圖:3B和3C檢測移植瘤是否有門靜脈癌栓形成，如圖所示為典型的門靜脈癌栓。圖4A顯示熒光素酶標(biāo)記的原位移植肝癌轉(zhuǎn)移模型建立示意圖。圖4B顯示熒光素酶標(biāo)記的腫瘤進行傳代(肝原位移植)。
具體實施例方式本發(fā)明第一方面提供一種熒光素酶慢病毒表達載體，該載體以rei2載體為骨架構(gòu)建，含有CMV啟動子及熒光素酶基因?？刹捎帽绢I(lǐng)域周知的各種熒光素酶基因來構(gòu)建本發(fā)明的熒光素酶慢病毒表達載體。在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的使用SEQ ID NO :1所示的熒光素酶基因構(gòu)建該慢病毒表達載體。用于構(gòu)建本發(fā)明的CMV啟動子可以是，例如pCSCG載體中所包含的CMV啟動子。用于構(gòu)建本發(fā)明慢病毒表達載體的骨架載體rei2也是本領(lǐng)域周知的，例如，可參見Qin XF et al,Inhibiting HIV-Iinfection in human T cells bylentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5, ProcNatl Acad Sci USA. ,2003, 100(1) :183-8。慢病毒表達載體的構(gòu)建可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法進行。例如，可按照本申請“質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染”所述的方法進行構(gòu)建。在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的熒光素酶慢病毒表達載體還含有報告基因。在一個具體實施例中，該報告基因是GFP報告基因。當(dāng)構(gòu)建得到本發(fā)明的熒光素酶慢病毒表達載體后，可將其與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞中。包裝質(zhì)粒可選自 pRSVREV，pMDLg/pRRE(DullT et al, Athird-generation lentivirus vector with a conditional packaging system, J Virol,1998,72(11) 8463-71)禾口 pHCMVG(Yee JK et al, Generation ofhigh-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range, Methods Cell Biol. , 1994;43PtA :99-112)。包裝細胞可采用細胞?？刹捎贸Ｒ?guī)的轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染，例如可采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法實施轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染之前，可對所述熒光素酶慢病毒表達載體和包裝質(zhì)粒進行高純度無內(nèi)毒素抽提。因此，本發(fā)明也包括一種熒光素酶慢病毒載體表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)含有本發(fā)明的熒光素酶慢病毒表達載體和包裝質(zhì)粒。經(jīng)轉(zhuǎn)染后，可收集慢病毒顆粒，用于感染癌細胞。癌細胞可來自各種癌癥。在本申請中，尤其優(yōu)選來自肝癌的細胞。更具體地，本申請優(yōu)選來自肝癌患者門靜脈癌栓的細胞。感染可采用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)實施。例如，可按照本發(fā)明“慢病毒感染靶細胞”部分所述的方法進行。因此，本發(fā)明也包括一種分離的癌細胞，該細胞被本發(fā)明的熒光素酶慢病毒表達載體感染并穩(wěn)定表達熒光素酶。本發(fā)明還包括一種細胞培養(yǎng)物，含有本發(fā)明的細胞。在某些實施方式中，培養(yǎng)物中80%以上、優(yōu)選90%以上的細胞為表達熒光素酶的陽性細胞。培養(yǎng)物中除細胞外，還可含有細胞培養(yǎng)基。在一個具體實施方式
中，使用普通高糖DMEM培養(yǎng)
基培養(yǎng)。在獲得本發(fā)明分離的癌細胞后，可用其標(biāo)記腫瘤組織。腫瘤組織可包括任意來源的腫瘤組織。但在優(yōu)選的實施例中，腫瘤組織優(yōu)選來自肝癌患者的肝組織。在一具體實施例中，本發(fā)明人將獲得的肝癌臨床組織樣本一部分進行皮下移植； 另一部分進行原代細胞培養(yǎng)，用本發(fā)明的表達熒光素酶的慢病毒進行感染，得到本發(fā)明的分離的癌細胞。然后使用本發(fā)明的分離的癌細胞注射到前述同一組織來源的、皮下移植后已長成的皮下瘤塊中(見“皮下移植瘤模型的構(gòu)建”)，3周后，取出皮下腫瘤，剪成小塊并用 IVIS Imaging System鑒定表達熒光素酶的陽性瘤塊。由此可獲得被熒光素酶標(biāo)記的腫瘤組織。因此，本申請也包括一種分離的癌組織，這種癌組織含有本發(fā)明的細胞。在一具體實施例中，所述分離的癌組織按照標(biāo)記腫瘤組織的方法獲得。在一個具體實施方式
中，所述分離的癌組織能穩(wěn)定表達熒光素酶。在一個具體實施方式
中，所述分離的癌組織是由本發(fā)明的分離的癌細胞長成。在另一具體實施例中，本發(fā)明的分離的癌組織可種植到實驗動物的同源組織上，并能穩(wěn)定傳代?！巴唇M織”在本文中指同種類型及相對應(yīng)解剖位置的組織。 例如，如果本發(fā)明的癌組織為肝癌組織，則可將其種植到動物的肝臟上。在進一步的實施例中，可將本發(fā)明的分離的癌組織種植于裸鼠同源組織上，繼續(xù)培養(yǎng)并適時傳代(見“原位移植腫瘤模型的構(gòu)建”)。按照此法所得到的被rei2-Luc2成功標(biāo)記的可傳代的瘤塊陽性率則可達到90%以上。因此，本發(fā)明也提供一種構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移模型的方法，該方法包括將本發(fā)明的成功標(biāo)記的腫瘤組織(癌組織)原位移植到動物的器官上。所述模型為非人哺乳動物模型。在其它優(yōu)選實施方式中，所述模型為小鼠模型。所述動物中被移植的器官優(yōu)選是與所述腫瘤組織為同種組織，例如都為肝臟。在優(yōu)選實施例中，所述小鼠模型為裸小鼠，即免疫缺陷型小鼠，對所植入的腫瘤組織基本不產(chǎn)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明因此也包括所述分離的癌細胞、細胞培養(yǎng)物、或分離的癌組織在構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移模型中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明也涉及所述分離的癌細胞、細胞培養(yǎng)物、或分離的癌組織在構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移模型中的用途，其中，所述腫瘤轉(zhuǎn)移模型按本發(fā)明所述的構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移模型的方法構(gòu)建。本發(fā)明也涉及所述分離的癌細胞或細胞培養(yǎng)物在標(biāo)記腫瘤組織中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明也涉及所述分離的癌細胞或細胞培養(yǎng)物在標(biāo)記腫瘤組織中的用途，其中，所述腫瘤組織按本發(fā)明所述的標(biāo)記腫瘤組織的方法標(biāo)記。以下將以具體實施例的方式對本發(fā)明進行描述。應(yīng)理解，這些實施例僅僅是闡述性的。除非另有說明，實施例中所使用到的方法、試劑、用量等均為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)。此夕卜，應(yīng)理解，本發(fā)明所用術(shù)語“含有”、“包含”等也包括了“由……組成”、“由……構(gòu)成”的含義。“分離的”在本文中指與其母體分開的、獨立存在的細胞或組織。例如，分離的細胞指與其原本所存在的組織分開的細胞；分離的組織指與其原本存在的組織或動物體分開的組
幺口
/Ν ο一.材料與方法實驗動物BALB/c-nu/nu雄性裸鼠由上海中科院斯萊克實驗動物中心提供，雄性裸鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)在 SPF(Specific Pathogen Free Condition)級條件，恒溫 25_27°C，恒濕 45-50 %，置于層流超凈架內(nèi)，每個飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng)5只裸小鼠。動物實驗的操作嚴格遵守上海生命科學(xué)研究院的實驗動物管理和使用指南，并得到了動物管理和使用委員會的批準(zhǔn)。 在實驗中主要使用4 8周齡的裸鼠，并根據(jù)具體實驗要求進行選擇。肝癌組織樣本所有正常肝組織、原發(fā)性及門靜脈轉(zhuǎn)移的肝癌樣本來自東方肝膽外科醫(yī)院，所有的標(biāo)本均保存于液氮中。本發(fā)明人的工作得到了中國科學(xué)院營養(yǎng)科學(xué)研究所的鑒審批準(zhǔn)。細胞系A(chǔ)GS細胞購自ATCC。PVTT-I為本實驗室和東方肝膽外科醫(yī)院程樹群教授合作建立的一株來源于肝癌患者門靜脈癌栓的細胞系。
肝癌患者信息上海東方肝膽外科醫(yī)院患者劉X (住院號115851)，男，60歲， 術(shù)前征得患者本人同意，簽署了知情同意書。本發(fā)明人將術(shù)中切除的取自患者門靜脈癌栓組織的樣本，種植于裸鼠肝臟及皮下(腋窩、腹股溝)，如此連續(xù)傳代(方法見“原位移植模型的構(gòu)建”)。從該細胞的第5代移植瘤取材，進行原代細胞培養(yǎng)及“細胞島”克隆擴大培養(yǎng)，成功培養(yǎng)出一株來源于人門靜脈癌栓的細胞系PVTT-I (亦名為CSQT-2，見T Wang 等，British Journalof Cancer(2010) 102,1618-1626 ；Weixing GUO 等，Journal of ProteorneResearch 2010,9,4170-4175)。細胞在最初幾代時生長速度不穩(wěn)定，5-7代后，生長趨于穩(wěn)定，約4天傳一代，20代后，生長明顯加速，每2天即可傳代一次，至今已在體外穩(wěn)定傳至100代左右，時間約為1年。20代前使用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，20代后則使用普通高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。試劑和儀器用于活體成像的儀器IVIS Imaging System，以及底物D-Luciferin均購自 Xenogen Biotechnology(Xenogen, Alameda, CA, USA)。質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染本發(fā)明人將!Iomega公司的改良熒光素酶Luc2基因克隆入改造過的，以CMV啟動子替換掉U6啟動子的rei2慢病毒表達載體中，用于構(gòu)建慢病毒表達系統(tǒng)。克隆的具體方法為，先將Luc2基因(SEQ ID NO 1)克隆入pCSCG載體(Miyoshi H et al, Development of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol. 1998 ；72 8150-8157)中，所用引物為LuciCSCGF :5，-CATGCTAGCGCCACCATGGAAGATGCCAAAAAC-3，(SEQ IDNO 2).LuciCSCGR :5，-AACCTCGAGTTACACGGCGATCTTGCC-3，(SEQ ID NO :3)。然后，用BamHI和BioI切下帶有CMV啟動子及Luc2基因的片段，連入 pBS_hU6_l 載體(Qin XF et al, Inhibiting HIV-Iinfection in human T cellsby lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA againstCCR5, Proc Natl Acad Sci USA.，2003，100 (1) :183-8)中，最后，用 XbaI 和 XhoI 切下 CMV 啟動子及 Luc2 基因片段，連入陽12(出處同上)載體中，從而得到了以CMV啟動子替換掉TO啟動子的 FG12-Luc2慢病毒表達載體。慢病毒載體包裝及滴度測定慢病毒包裝細胞為細胞，將rei2_Luc2慢病毒表達質(zhì)粒及輔助包裝載體質(zhì)粒 (pRSVREV，pMDLg/pRRE和pHCMVG)進行高純度無內(nèi)毒素抽提，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染他后更換為完全培養(yǎng)基，于24h及4 各收集一次富含慢病毒顆粒的細胞上清液，合并后先使用0. 45 μ m的濾膜過濾，再進行冷凍高速離心QOOOOrpm，140min)，然后用不含血清的培養(yǎng)基溶解病毒，將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，于-80°C保存。取其中1支進行病毒生物學(xué)滴度測定，方法為孔稀釋法。慢病毒感染靶細胞將處于對數(shù)生長期的靶細胞進行胰蛋白酶消化，以合適的密度接種于3. 5cm盤中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。18 20h后，根據(jù)所測定的滴度，加入適宜量的病毒，1 后觀察細胞狀態(tài)。如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換為含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基；如果有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基。感染2 3d后通過熒光顯微鏡觀察rei2-Luc2慢病毒上報告基因GFP的表達情況，感染效率> 50 %的繼續(xù)培養(yǎng)，感染效率 < 50%的則重新進行感染實驗。當(dāng)被感染的細胞達到一定數(shù)量后，通過GFP進行分選，得到陽性率更高的細胞(分選后，陽性率一般可以達到80% 90%以上)。將分選得到的細胞進行擴增，取一部分進行Luc值的體外測定，具體方法為在M孔板中進行鋪種，1.0X105 細胞/ ？L，鋪種三個復(fù)孔。第二天，待細胞貼壁后，測定Luc值，達到400萬以上才可用于活體成像實驗。低于該值的則進行重復(fù)感染，直至達標(biāo)。熒光素酶標(biāo)記腫瘤組織本發(fā)明人將獲得的肝癌臨床組織樣本一部分進行皮下移植，另一部分進行原代細胞培養(yǎng)，使用rei2-Luc2病毒感染原代細胞(見“慢病毒感染靶細胞”)，然后將成功感染的細胞注射到同一組織來源的，已長成的皮下瘤塊中(見“皮下移植瘤模型的構(gòu)建”)，3周后， 取出皮下腫瘤，剪成小塊并用IVIS ImagingSystem鑒定表達熒光素酶的陽性瘤塊，再將其種植于裸鼠肝臟，繼續(xù)培養(yǎng)并適時傳代(見“原位移植腫瘤模型的構(gòu)建”)。按照此法所得到的被熒光素酶成功標(biāo)記的可傳代的瘤塊陽性率則可達到90%以上。體內(nèi)成瘤實驗對6周大的雄性裸鼠在身體兩側(cè)和/或背部進行皮下注射，每一處注射個肝癌細胞。每隔四到五天，使用游標(biāo)卡尺測量生成的腫瘤，其體積(cm3)使用標(biāo)準(zhǔn)公式“長 χ寬χ高χ 0.5236”進行計算。最后，麻醉并處死動物取出皮下腫瘤。皮下移植瘤模型的構(gòu)建(1)將手術(shù)切除的標(biāo)本用D-Hank’ s沖洗干凈，剔除纖維組織和血污，取鮮魚肉狀即活力強的部位剪成1 2mm3大小碎塊，備用。O) 6%的水合三氯乙醛按100uL/20g小鼠的劑量對實驗小鼠進行麻醉。(3)裸鼠腋窩和大腿腹股溝側(cè)用碘酒、酒精皮膚消毒，切開皮膚，將新鮮的肝癌組織或者癌栓組織碎塊包埋到皮下后縫合皮膚，一只裸鼠種植四個點雙側(cè)腋窩及腹股溝。(4)待裸鼠蘇醒后放回籠子。(5)術(shù)后觀察裸鼠2次/日，皮下移植瘤長至直徑為1. 0-1. 2cm左右時取出，去除壞死組織，剪切成約1. O 2. Omm3大小，種植于裸鼠的雙側(cè)腋窩及腹股溝，按照此法進行傳代，每次使用3-4只裸鼠。原位移植腫瘤模型的構(gòu)建采用完整組織塊原位移植法(SurgicalOrthotopic Implantation ofHistologically Intact Tumor Tissue, SOI)。具體步驟包括(1)脫頸處死穩(wěn)定傳代的皮下荷瘤裸鼠，用碘酒、酒精皮膚消毒，取出皮下腫瘤。(2)將皮下腫瘤立即浸入含青霉素、鏈霉素各100U/ml的培養(yǎng)基中。剔除周圍結(jié)締組織，取腫瘤生長旺盛的部分，剪成約1. 0 2. Omm3大小碎塊，備用。(3)用6%的水合三氯乙醛按100uL/20g小鼠的劑量對實驗小鼠進行麻醉后，碘酒、酒精皮膚消毒，0.5%碘伏消毒，取左上腹橫切口約1.5厘米，進入腹腔暴露肝左葉。先用8/0絲線穿過肝臟行8字縫合準(zhǔn)備，然后用手術(shù)刀于絲線之間的肝包膜上戳一小孔，生理鹽水紗布按壓片刻止血，將腫瘤組織小塊移植于肝包膜下，將8字縫合線拉緊固定，徹底止血后逐層關(guān)腹。(4)待裸鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)的籠子。
(5)觀察指標(biāo)主要包括肝臟、肺臟、腹腔的轉(zhuǎn)移瘤，肝臟病理切片觀察有無門靜脈癌栓的形成。熒光素酶標(biāo)記的小鼠原位肝癌移植模型本發(fā)明人將成功標(biāo)記熒光素酶的瘤塊(見“熒光素酶標(biāo)記腫瘤組織”)，種植于6周齡的雄性裸鼠的肝葉上，繼續(xù)培養(yǎng)并適時傳代(見“原位移植腫瘤模型的構(gòu)建”)。經(jīng)過原位肝移植手術(shù)的小鼠存活率在95%以上，傳代成功率為100%，每一次使用4-6只裸鼠進行皮下及肝包膜下原位移植傳代，目前與PVTT-I細胞同一組織來源的瘤塊已經(jīng)穩(wěn)定傳至第17 代。按照此法經(jīng)過持續(xù)傳代擴增和篩選，即得到熒光素酶標(biāo)記的小鼠原位肝癌移植模型。二.實驗結(jié)果實施例1 熒光素酶的慢病毒載體表達系統(tǒng)的構(gòu)建和一般的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法相比，慢病毒表達系統(tǒng)有轉(zhuǎn)染效率高、整合穩(wěn)定、表達持續(xù)的優(yōu)勢，因此本發(fā)明人構(gòu)建了熒光素酶的慢病毒載體表達系統(tǒng)。本發(fā)明人將本實驗室的 rei2載體中的TO啟動子換為適用于真核表達的CMV啟動子，再將改良的熒光素酶報告基因(Luc2)插入，置于CMV啟動子之后，同時保持原來的GFP報告基因模塊不變，即得到共表達GFP和熒光素酶的FG12慢病毒載體。通過與相應(yīng)的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，收取細胞培養(yǎng)上清并純化濃縮，便可得到高滴度的病毒顆粒，用于體內(nèi)外標(biāo)記實驗，所感染的細胞 (圖1)顯示出極強的熒光素酶活性。實施例2 高效的熒光素酶標(biāo)記腫瘤組織的方法的建立在慢病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建完成后，本發(fā)明人對肝癌組織進行了標(biāo)記。長期以來，腫瘤組織的活體標(biāo)記一直是一個公認的難題，可供參考的相關(guān)文獻十分有限，一些已有的報道如電轉(zhuǎn)法等所取得的效果也并不理想。經(jīng)過多次嘗試和優(yōu)化，本發(fā)明人建立起了較為高效的標(biāo)記方法(見“材料與方法”)。實驗數(shù)據(jù)表明，使用這種方法，能有效的感染腫瘤組織塊中的大部分細胞，陽性率可達90%以上。并且，成功感染的瘤塊可以在裸鼠體內(nèi)(包括皮下和肝原位)繼續(xù)生長，成為研究體內(nèi)腫瘤生長，惡化，以及遷移的良好模型(圖2)。圖2顯示了標(biāo)記有熒光素酶的PVTT-I原位移植瘤的生長情況。被rei2_Luc2慢病毒成功感染的PVTT-I細胞先被注射至裸鼠皮下先前形成的同一組織來源的瘤塊(見“材料與方法”中的“熒光素酶標(biāo)記腫瘤組織”)中。3周后，長大的皮下瘤塊被取下，剪成小塊，經(jīng)IVIS Imaging System鑒定的陽性瘤塊種植至新鮮裸鼠的肝臟。通過IVIS Imaging System，本發(fā)明人監(jiān)測了該原位移植腫瘤在裸鼠體內(nèi)生長及轉(zhuǎn)移的情況。實施例3 建立起人肝癌原位移植的裸鼠模型本發(fā)明人將肝癌的新鮮樣本，及時種植到裸鼠的肝臟上，建立起人肝癌原位移植的裸鼠模型。相比于由體外細胞系產(chǎn)生的肝癌模型，基于病人腫瘤組織的肝癌模型更接近腫瘤的體內(nèi)生理狀態(tài)。在本發(fā)明人所構(gòu)建的肝癌模型中，所用的樣本來自惡性程度較高的肝癌組織，其中一個重要特征是患者發(fā)生了肝癌細胞的肝門靜脈轉(zhuǎn)移。因此，這一肝癌模型包含了來自原發(fā)灶以及相應(yīng)門靜脈癌栓，可發(fā)生血管內(nèi)轉(zhuǎn)移的肝癌組織，顯示出極強的轉(zhuǎn)移能力，為研究肝癌的轉(zhuǎn)移提供了理想的模型(圖3)。實施例4 建立活體成像的原位移植肝癌轉(zhuǎn)移模型在得到成功標(biāo)記熒光素酶的肝癌組織后，本發(fā)明人對裸鼠進行肝原位移植，將被標(biāo)記的肝癌組織塊接種到裸鼠的肝臟內(nèi)?；跓晒馑孛傅臉?biāo)記，本發(fā)明人可以通過Xenogen公司的IVIS Imaging System實時監(jiān)測原位癌組織的生長情況，同時，還可以監(jiān)測肝癌的轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移灶的生長情況。當(dāng)瘤塊在裸鼠體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移后，將轉(zhuǎn)移灶利用熒光素酶進行定位并分離，接種于另一只裸鼠的肝臟內(nèi)，利用IVIS Imaging System進行腫瘤轉(zhuǎn)移的監(jiān)測和篩選。通過這樣連續(xù)的體內(nèi)傳代和篩選，得到一系列具有不同轉(zhuǎn)移能力的原位移植肝癌轉(zhuǎn)移模型小鼠(圖4)。 雖然上文以具體實施方式
的形式對本申請進行了描述，但應(yīng)理解，這些實施例僅僅是闡述性的。在不偏離本申請精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明做出各種改動。 這些改動都在本申請的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種熒光素酶慢病毒表達載體，其特征在于，該表達載體以rei2載體為骨架構(gòu)建， 含有CMV啟動子及熒光素酶基因。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光素酶慢病毒表達載體，其特征在于，所述熒光素酶基因的序列如SEQ ID NO 1所示。
3.一種熒光素酶慢病毒載體表達系統(tǒng)，其特征在于，該表達系統(tǒng)含有權(quán)利要求1或2所述的熒光素酶慢病毒表達載體和包裝質(zhì)粒。
4.一種分離的癌細胞，其特征在于，該細胞被權(quán)利要求1或2所述的熒光素酶慢病毒表達載體感染并穩(wěn)定表達熒光素酶。
5.一種細胞培養(yǎng)物，其特征在于，該培養(yǎng)物含有權(quán)利要求4所述的癌細胞。
6.如權(quán)利要求5所述的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，培養(yǎng)物中80%以上的細胞為表達熒光素酶的陽性細胞。
7.一種分離的癌組織，其特征在于，所述癌組織含有權(quán)利要求4所述的癌細胞。
8.—種標(biāo)記腫瘤組織的方法，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求4所述的分離的癌細胞注射到由其來源與所述分離的癌細胞的來源相同的腫瘤組織皮下移植生長形成的瘤塊中，并允許表達熒光素酶的癌細胞生長增殖成為被熒光素酶成功標(biāo)記的腫瘤組織。
9.一種構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移模型的方法，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求7所述的癌組織移植到該動物模型的同源組織中，從而構(gòu)建得到原位移植的腫瘤轉(zhuǎn)移模型。
10.權(quán)利要求4所述的分離的癌細胞、權(quán)利要求5所述的細胞培養(yǎng)物在標(biāo)記腫瘤組織中的應(yīng)用；或權(quán)利要求4所述的分離的癌細胞、權(quán)利要求5所述的細胞培養(yǎng)物、或權(quán)利要求 7所述的分離的癌組織在構(gòu)建原位移植的腫瘤轉(zhuǎn)移模型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光素酶的慢病毒載體表達系統(tǒng)及其用途。具體而言，本發(fā)明成功構(gòu)建了以FG12-Luc2為核心質(zhì)粒的熒光素酶慢病毒表達系統(tǒng)，并使用該系統(tǒng)建立了來自肝癌患者癌栓組織的PVTT-1細胞系。通過該慢病毒表達系統(tǒng)，成功標(biāo)記了肝癌組織，并通過皮下移植瘤，原位肝癌移植等實驗方法，建立了可進行持續(xù)傳代，用于活體成像，可以實時監(jiān)測腫瘤在體內(nèi)的生長及轉(zhuǎn)移情況的小鼠原位移植肝癌轉(zhuǎn)移模型。
文檔編號C12N15/52GK102477445SQ20101055548
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者馮宇雄, 李晶晶, 程樹群, 謝東 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院