專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器制備人DNA聚合酶δ的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，特指應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器制備 人DNA聚合酶δ多亞基蛋白復(fù)合物的方法，通過(guò)這種方法，可以大量、廉價(jià)、高效地制備用 于進(jìn)行體外研究DNA復(fù)制和損傷修復(fù)的DNA聚合酶。
背景技術(shù)：
“忠實(shí)”的DNA復(fù)制在真核細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，在細(xì)胞周期的某個(gè) 階段發(fā)生調(diào)節(jié)紊亂，例如，在決定何時(shí)開(kāi)始DNA的復(fù)制、或能否在S-期順利完成DNA的復(fù)制 等，是人類(lèi)多種疾病、特別是癌癥疾病的重要起因。因此，準(zhǔn)確的DNA復(fù)制和損傷修復(fù)在真 核生物維持其染色體穩(wěn)定、防止遺傳變異和癌癥疾病發(fā)生等方面起著極其重要的作用。
而真核生物DNA聚合酶Pol δ (Polymerase δ, Pol δ )是染色體DNA復(fù)制 過(guò)程中最主要的復(fù)制酶，同時(shí)還參與多種形式的DNA損傷修復(fù)，在維持細(xì)胞周期的正常調(diào) 節(jié)以保證基因組結(jié)構(gòu)的完整性和遺傳穩(wěn)定性方面具有特殊的重要意義。刪除了酵母5 carerisiae中Pol δ催化大亞基/^ZJ基因，將導(dǎo)致細(xì)胞不能成活，即使在活性位點(diǎn)發(fā)生突 變，對(duì)細(xì)胞而言也是致命的(Boulet, A. et a 1, EMBO J, 1989，8: 1849 - 1854)0 Pol δ 是一種具有高度保真特性的DNA聚合酶，這種高保真特性還通過(guò)自身的3’ -5’核酸外切酶 活性得以加強(qiáng)，鼠基因在核酸外切酶活性位點(diǎn)D400的點(diǎn)突變將導(dǎo)致校對(duì)功能的喪失， 使得一半的老鼠在 2個(gè)月后患癌(Goldsby, R. E. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2002， 99: 15560 - 15565)，在人的直腸癌、結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞中均檢出Pol δ催化亞基中存在 點(diǎn)突變或單個(gè)核苷酸刪除突變(Flohr，Τ. et al, Int J Cancer, 1999，80: 919 - 929)。 由于Pol δ所具有的特殊生物學(xué)功能，目前越來(lái)越引起人們更加廣泛地關(guān)注和重視。
真核生物Pol δ是由四個(gè)亞基ρ125、ρ50、ρ68和ρ12構(gòu)成的異源四聚體，它作為 第一個(gè)具有3’ -5’核酸外切酶活性的真核DNA聚合酶，于上個(gè)世紀(jì)70年代在So A. G..博 士實(shí)驗(yàn)室被首次發(fā)現(xiàn)(Byrnes, J. J. , et al, Biochemistry, 1976，15:沘17_2823)。早 期從動(dòng)物組織中分離純化聚合酶Pol δ極度困難，至少需要8個(gè)分離柱，耗時(shí)數(shù)個(gè)月，從 1公斤小牛胰腺中僅能獲得約33微克的蛋白(Lee，Μ. Y., et al, Biochemistry, 1984， 23: 1906-1913)，且極易失活，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模的酶學(xué)功能和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，天然Pol δ 分離純化的困難是真核聚合酶研究領(lǐng)域落后于其它系統(tǒng)DNA聚合酶研究的主要原因之一。 雖然在2002年應(yīng)用AcMNPV昆蟲(chóng)桿狀病毒一 Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)制備各亞基病毒 共感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得了不同亞基裝配組合的Pol δ蛋白復(fù)合物(Xie，B., et al, Biochemistry, 2002, 41: 13133-13142; Podust, V. N. , et al. , J Biol Chem, 2002, 277: 3894-3901)，但由于其表達(dá)量低，無(wú)法獲得大量高純度的酶，且酶制備過(guò)程中涉及昆 蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)所需昂貴的培養(yǎng)基和胎牛血清，使得酶制備成本高，嚴(yán)重制約了 DNA聚合酶Pol δ領(lǐng)域的深入研究。
癌癥疾病目前正在成為新世紀(jì)人類(lèi)的第一殺手，從癌癥發(fā)病的源頭上研究由Pol δ功能改變而導(dǎo)致遺傳基因組不穩(wěn)定所致腫瘤發(fā)生的機(jī)制，為我們?cè)O(shè)計(jì)新的腫瘤診斷、治療手段提供理論依據(jù)，其當(dāng)務(wù)之急是尋找出一種經(jīng)濟(jì)，高效的真核DNA聚合酶Pol δ的制 備方法，以滿(mǎn)足其結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)功能的研究之用。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)自八十年代建立、特 別是家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成為世界上最具商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值的真核表達(dá)系統(tǒng)以來(lái)，已經(jīng)成功 地表達(dá)了眾多的外源基因。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于1.表達(dá)效率高，每條蠶產(chǎn)量可達(dá)毫克級(jí)以 上。2.表達(dá)的外源蛋白翻譯后的修飾好于其它表達(dá)系統(tǒng)，其產(chǎn)物的生物化學(xué)特性和生物活 性可與天然產(chǎn)物相似。3.家蠶飼養(yǎng)簡(jiǎn)單方便，成本低。本發(fā)明提出一種利用家蠶作為生物 反應(yīng)器大量、低成本、高效率地制備人DNA聚合酶Pol δ的方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，首次提出一種應(yīng)用家蠶生物 反應(yīng)器高效、廉價(jià)、大規(guī)模制備人DNA聚合酶Pol δ的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是將完整的人類(lèi)DNA聚合酶Pol δ的4個(gè)亞基ρ125、 ρ68、ρ50和ρ12的cDNA分別克隆到含多角體基因啟動(dòng)子的供體質(zhì)粒pFastBac上，分別獲 得重組供體質(zhì)粒 pFastBac-pl25、pFastBac-p68、pFastBac_p50 禾口 pFastBac_pl2，在經(jīng)過(guò)改 造的大腸桿菌DHlOBac/BmNPV中和家蠶BmNPV-Bacmid于Tn7轉(zhuǎn)座子上發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過(guò)藍(lán) 白斑篩選出帶有正確亞基的克隆，隨后在家蠶BmN細(xì)胞中分別制備該4種亞基不同裝配組 合的重組病毒。用獲得的重組病毒感染宿主昆蟲(chóng)家蠶，收集含表達(dá)并包裝了人DNA聚合酶 δ多亞基蛋白復(fù)合物的家蠶幼蟲(chóng)的體液或整體勻漿，在裂解緩沖液存在下經(jīng)超聲波裂解， 4°C下進(jìn)行高速離心，收集的上清應(yīng)用免疫親和層析和離子交換層析的方法進(jìn)行分離純化， 最終獲得到純化后的產(chǎn)物。
本技術(shù)方案所述的DNA聚合酶Pol δ的4個(gè)亞基分別為ρ125、ρ68、ρ50和ρ12， 相應(yīng)的cDNA分別源自人類(lèi)DNA聚合酶基因POLD1、P0LD3、P0LD2和P0LD4 ；所述的桿狀病 毒是家蠶桿狀病毒BmNPV ；所述的宿主昆蟲(chóng)為家蠶(Bombyx mori),品種為306 ；所述的宿 主昆蟲(chóng)感染時(shí)間是五齡期幼蟲(chóng)；所述的感染方法是經(jīng)昆蟲(chóng)表皮注射接種感染；所述的桿狀 病毒供體質(zhì)粒是pFastBac，所制備的各單亞基重組家蠶桿狀病毒是rBmNPV-pi^st-pl25、 rBmNPV-pFast-p68、rBmNPV-pFast-p50 和 rBmNPV-pFast_pl2 ；所制備的四個(gè)亞基不同 組合的重組家蠶桿狀病毒是 rBmNPV-pFast-pl25/p50、rBmNPV-pFast-p 125/p50/p 12, rBmNPV-pFast-pl25/p68/p50 和 rBmNPV-pFast-p125/p68/p50/p12。
本技術(shù)方案所述的分離純化具體操作是收集的經(jīng)超聲波裂解、高速離心后含表 達(dá)并包裝了人DNA聚合酶δ多亞基蛋白復(fù)合物的上清，經(jīng)過(guò)免疫親和層析柱和離子交換層 析柱分離純化出高純度的目的產(chǎn)物。所說(shuō)的免疫親和層析柱推薦使用耦聯(lián)了抗催化大亞基 Ρ125抗體的免疫親和層析柱。離子交換層析柱是指FPLC Mono Q0
上述方法中所說(shuō)的免疫親和層析柱，是將抗P125的多克隆抗體與CarboLink Coupling Gel耦聯(lián)而制得。其中，抗pl25的多克隆抗體是通過(guò)下述方法制得利用 Bac-to-Bac系統(tǒng)，制備含6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的DNA聚合酶δ催化大亞基ρ125作為抗原，在成 年新西蘭兔中制備抗Ρ125的抗血清，純化抗血清獲得高純度的多克隆抗體。
本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為表達(dá)量高。插入4種亞基的重組供體質(zhì)粒在經(jīng)過(guò)改造的大腸桿菌DHlOBac/BmNPV中和 家蠶BmNPV-Bacmid于Tn7轉(zhuǎn)座子上發(fā)生轉(zhuǎn)座，經(jīng)藍(lán)白斑篩選出帶有正確亞基的克隆，通過(guò)在家蠶細(xì)胞BmN中篩選優(yōu)化獲得的重組家蠶桿狀病毒感染五齡起蠶第二天的家蠶幼蟲(chóng)，感 染5天后可獲得高表達(dá)并裝配完整的人DNA聚合酶Pol δ的四亞基蛋白復(fù)合物，經(jīng)分離純 化后，每條蠶可制備高達(dá)10微克以上的蛋白復(fù)合物。
生物活性高。家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種真核表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)的外源蛋白翻 譯后的修飾好于其它表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明利用家蠶生物反應(yīng)器所獲得的人DNA聚合酶Pol δ 的四亞基蛋白復(fù)合物，經(jīng)分離純化后，比活性可達(dá) 20，000 Units/mg，接近或高于A(yíng)cMNPVBac-to-Bac ^ ^ 20, 830 Units/mg (Xie, B. , et al, Biochemistry, 2002，41: 13133-13142)和 15，000 Units/mg (Podust, V. N. , et al. , J Biol Chem, 2002, 277: 3894-3901)。
成本低。家蠶是目前唯一可以大規(guī)模商業(yè)化無(wú)菌飼養(yǎng)的昆蟲(chóng)物種，由于避免了 AcMNPV桿狀病毒一 Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)中昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)所需昂貴的培養(yǎng)基和胎牛血清， 使得用家蠶作為生物反應(yīng)器大量制備人DNA聚合酶Pol δ多亞基蛋白復(fù)合物成本低。
本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。


圖1.不同亞基的各種組合在BmN細(xì)胞中表達(dá)和裝配的Wfestern檢測(cè)結(jié)果。1 四 個(gè)亞基所裝配的Pl25/p68/p50/pl2全酶復(fù)合物；2，3 由ρ125/ρ50/ρ12和ρ125/ρ68/ρ50裝 配成的三亞基蛋白復(fù)合物；4 :ρ125/ρ50裝配成的核心酶二亞基蛋白復(fù)合物；5 催化大亞基 ρ125的單亞基表達(dá)。
圖2.四亞基組合重組病毒在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)和裝配的Western檢測(cè)結(jié)果。1，2，3 每100頭蠶平均血樣混合物中表達(dá)并裝配的四亞基pl25/p68/p50/pl2組合的蛋白復(fù)合物。
圖3.分離純化后人DNA聚合酶Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物的SDS-PAGE電泳結(jié)果。 1，2:經(jīng)過(guò)免疫親和層析柱純化后，合并的蛋白峰餾分再經(jīng)過(guò)離子交換層析柱純化和濃縮， 所收集的第14和第15餾分。
圖4. Poly(dA)/oligo(dT)為引物/模板的分析結(jié)果。圖中兩條斜線(xiàn)分別代表反 應(yīng)中加和不加PCNA。
圖5. Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物的斯托克斯半徑測(cè)定。橫坐標(biāo)為經(jīng)測(cè)定計(jì)算的一 log[Kav]，縱坐標(biāo)為斯托克斯半徑Α。圖中a，b，c, d, e分別代表標(biāo)準(zhǔn)蛋白Bovine serum albumin(67 000，35. 5 A),Aldolase (158 000，48. 1 A),Catalase (232 000，52. 2 A), Ferritin (445 000， 61 A), Thyroglobulin (667 000， 85 A)。
圖6是制備的重組桿狀病毒rAc-p!^ast-His-pl25的^festern檢測(cè)結(jié)果。右邊的 數(shù)字代表標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker; 1，2 兩個(gè)平行的病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
圖7利用鎳柱純化的His_pl25蛋白洗脫圖。M 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ；E1-E4 收集的 蛋白餾分。
圖8經(jīng)過(guò)Immobilized Protein A柱純化后的抗體在SDS-PAGE膠上的分析結(jié)果。 M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ；3，6，9，12，15，18，21，24，27，30 為洗脫后所收集的抗體餾分編號(hào)。
具體實(shí)施方式
實(shí)驗(yàn)材料限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶、RNA酶、IPTG、X-Gal, SDS、TEMED、丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺為 Promega公司產(chǎn)品；PCR試劑盒、大腸桿菌培養(yǎng)基LB、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100、胎牛血清、 CELLFECTIN Reagent等化學(xué)試劑購(gòu)自GIBCO BRL公司；人類(lèi)DNA聚合酶Pol δ的4個(gè)亞基 ρ125、ρ68、ρ50和pl2 cDNA 由美國(guó)范德堡大學(xué)(VanderbiIt University)Ellen H. Fanning 教授惠贈(zèng)(Genbank ID :NM_002691. 2,NM_006591. 1,NM_001127218. 1 ；NM_021173. 3，);桿狀 病毒供體質(zhì)粒PFastBac 和 pFastBacHTc 購(gòu)自 GIBCO BRL 公司；CarboLink Coupling Gel、 Immobilized Protein A柱、帶組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒均購(gòu)自Pierce公司；多克隆抗 體制備所需動(dòng)物和材料由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；大腸桿菌DH5 α (可從Takara公司 購(gòu)買(mǎi))；經(jīng)改造的大腸桿菌DHlOBac/BmNPV、家蠶細(xì)胞BmN和家蠶品種306 (Liang, G.，et al, Current Microbiology, 61(3) 190-196，D0I: 10. 1007/s00284-010-9595_4)由江 蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院保存；DHlOBac和昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf_9由江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院保存， 也可從BD bioscience 公司購(gòu)買(mǎi)。人類(lèi)PCNA (由 New York Medical College 的Marieetta Lee教授惠贈(zèng))、分別抗4種亞基的抗體α-ρ125、α-ρ68、α-p50 (購(gòu)自Abnova公司)和 α -ρ12、耦聯(lián)了抗大亞基ρ125兔源免疫親和層析柱按實(shí)施例制備。
說(shuō)明以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)操作方法均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (Sambrook等編著，科學(xué)出版社，1992年版)、試劑盒說(shuō)明書(shū)、及產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
實(shí)施例一多克隆抗體的制備1. 抗原的制備(1).重組供體質(zhì)粒pFastBaCHTC-pl25的制備化學(xué)合成用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的兩條引 物分別為F: 5’ -AGCTACGGATCCGGATGGATGGCAAGCGGCGGCC-3’ ( SEQ ID NO 9), R: 5’ -AGCTACGAATTCTCACCAGGCCTCAGGTCCAGGG-3’ (SEQ ID NO 10),在引物序列N —端引入漢3 HI酶切位點(diǎn)，在C-端引入feoRI酶切位點(diǎn)，均用下劃線(xiàn)表 示。以人類(lèi)DNA聚合酶Pol δ的催化大亞基ρ125的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出的 DNA片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切割下含目的片段的凝膠，用QIAGEN Gel Extraction 試劑盒回收擴(kuò)增出的DNA片段(Genbank ID :NM_002691. 2);用漢警HI和&0RI對(duì)擴(kuò)增出的 DNA片段進(jìn)行雙酶切，同時(shí)，對(duì)含6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的供體質(zhì)粒pFastBacHTc也進(jìn)行漢a HI和 ^oRI的雙酶切反應(yīng)，酶切反應(yīng)產(chǎn)物分別用試劑盒再純化一次，將酶切后純化的PCR產(chǎn)物和 供體質(zhì)粒pFastBacHTc用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)，14°C下過(guò)夜；將連接產(chǎn)物于大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)混合物涂于含100 Pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基 平板上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜；挑選LB平板上的單個(gè)菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒 DNA ；對(duì)質(zhì)粒DNA用BanMl和進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選出已插入正確基因片段的重組供 體質(zhì)粒。經(jīng)序列檢測(cè)，成功獲得含正確序列的重組供體質(zhì)粒pFastBaCHTC-pl25。
(2).重組桿狀病毒的制備將獲得的重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DHlOBac，在Helper作用下通過(guò)Tn7轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座，經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到重組穿梭載體；提 取重組的 Bacmid DNA，用特異性引物 Μ13 (Forward: M13-47, Reverse: RV-M)進(jìn)行 PCR 反 應(yīng)驗(yàn)證；用CELLFECTIN Reagent介導(dǎo)重組的Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf_9細(xì)胞，經(jīng)兩輪病毒的擴(kuò) 增，收集上清，獲得重組桿狀病毒rAc-p!^St-HiS-pl25。裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE電 泳，將膠分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用鼠源抗His的單克隆抗體(購(gòu)自于A(yíng)bcam 公司)進(jìn)行免疫反應(yīng)，帶6XHis標(biāo)簽的His-pl25的Western檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。
(3).蛋白的純化用重組病毒rAc-p!^St-HiS-pl25感染1 L懸浮培養(yǎng)的Sf-9昆 蟲(chóng)細(xì)胞，MOI = 2，感染細(xì)胞密度為2X IO6 cells/ml，72小時(shí)后收集感染的細(xì)胞，在4 下 以3000 rpm速度離心10分鐘，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用鎳柱純化帶組氨酸標(biāo)簽的pl25，洗脫 的蛋白如圖7所示。
合并洗脫下的各蛋白餾分，再經(jīng)過(guò)一次SDS-PAGE膠純化，將膠上的His_pl25用 手術(shù)刀小心割下，切碎，置于離心管中，用抽提液將膠上的蛋白洗脫，高速離心，合并經(jīng)多次 抽提的含 His-pl25 的上清，用 Centricon 30 filters (30 000 MW cutoff, Millipore) 進(jìn)行濃縮，濃縮后的His-pl25經(jīng)蛋白濃度測(cè)定后，用作免疫反應(yīng)的兔抗原。
2. 抗血清的制備(1).預(yù)放血將成年新西蘭兔放在特制兔盒中，按壓兔子耳根部直至血管突出，用19 號(hào)針頭對(duì)兔子耳動(dòng)脈進(jìn)行預(yù)放血1-5 ml，獲得免疫前的血清。4° C放置過(guò)夜使血液凝固， 將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4° C下10，000 g離心10分鐘，收集的上清液在4° C下保 存。
(2).免疫反應(yīng)固定兩只成年新西蘭兔，將Iml抗原溶液(200 Pg兔抗原溶入Iml 磷酸緩沖溶液中)與Iml加入分枝桿菌的福氏完全佐劑混和，劇烈震蕩使之充分乳化，用 3ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，在兔子的4個(gè)不同部位皮下各注射1/4抗原溶液 (兩處在后背，兩處在大腿處)；注射結(jié)束后，將針在注射處放置幾秒鐘后再輕輕拔出，并用 70%乙醇在注射處消毒，用相同方法給另一只家兔注射抗原。第2星期，通過(guò)注射混合200 Pg抗原的完全弗氏佐劑進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫；在第4、第6星期，分別再注射混合100 Pg抗原 的不完全弗氏佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。最后一次注射抗原后的第7天按照步驟(1)收集血液， 將收集的血液與注射前收集的血液用Western Blotting鑒定比較，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有大量的抗體 產(chǎn)生。
(3).收集抗血清將兔子輕輕放入固定架上，用刀片在耳部血管的上中部切出切 口，使血液自由的流出，收集大約30-40 ml/兔滴出的血液，將血液在37° C恒溫箱中放置 30分鐘，再在4° C放置過(guò)夜，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，在4° C下10，OOOg離心10分 鐘，收集上清液，獲得抗血清。
3. 抗體的純化將預(yù)先配置好的100%硫酸銨飽和溶液在磁力攪拌下緩慢滴加到抗血清中，使硫酸銨 的終濃度達(dá)到20%，在4° C下靜置過(guò)夜。于4° C下10，OOOg離心30分鐘以去除細(xì)胞碎片 和雜蛋白，再在磁力攪拌下緩慢滴加100%硫酸銨飽和溶液到收集的離心上清中，使硫酸銨 的終濃度達(dá)到50%，4° C下靜置過(guò)夜；10，OOOg離心30分鐘，棄上清，保留沉淀；將沉淀溶 于少量PBS中，溶解后的沉淀放入透析袋對(duì)含0.2 g /L疊氮鈉的PBS于4° C下透析M 小時(shí)，每隔6小時(shí)換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨，透析液經(jīng)高速離心后，收集上 清，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，然后按照Pierce產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，對(duì)經(jīng)初步純化后的抗體用Immobilized Protein A柱進(jìn)行再純化，收集洗脫的各餾分，測(cè)定蛋白濃度，Western Blotting進(jìn)行免疫 反應(yīng)鑒定。成功地獲得大約600 mg高純度的抗體α-pl25，其純化后產(chǎn)物在SDS-PAGE膠上 的分析結(jié)果如圖8所示。
實(shí)施例二 免疫親和層析柱的制備按照Pierce公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(產(chǎn)品號(hào)20391 )，將300 mg純化好的多克隆抗體7α -ρ 125和50 ml的CarboLink Coupling Gel進(jìn)行耦聯(lián)反應(yīng)，制備成多克隆抗體耦聯(lián)的 免疫親和層析柱。大約有225 mg的IgG被耦聯(lián)到膠上，耦聯(lián)效率達(dá)到75%，即平均每毫升的 膠耦聯(lián)4. 5毫克抗體。
實(shí)施例三重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建化學(xué)合成用于PCR擴(kuò)增4種亞基的引物，在引物序列N —端引入Bernm酶切位點(diǎn)，在 C-端引入feoRI酶切位點(diǎn)，均用下劃線(xiàn)表示，引物序列設(shè)計(jì)如下pl25 F:5，-AGCTACGGATCCGGATGGATGGCAAGCGGCGGCC--3，(SEQ ID NO 1)R:5，-AGCTACGAATTCTCACCAGGCCTCAGGTCCAGGG--3，(SEQ ID NO 2)p68 F:5，-AGCTACGGATCCTTATGGCGGACCAGCTTTATCT--3，(SEQ ID NO3)R:5，-AGCTACGAATTCTTATTTCCTCTGGAAGAAGCCA--3，(SEQ ID NO 4)p50 F:5，-AGCTACGGATCCACATGTTTTCTGAGCAGGCTGC--3，(SEQ ID NO 5)R:5，-AGCTACGAATTCTCAGGGGCCCAGCCCCAGGCC-3，(SEQ ID NO 6)pl2 F:5，-AGCTACGGATCCCCATGGGCCGGAAGCGGCTCAT--3，(SEQ ID NO 7)R:5，-AGCTACGAATTCTCATAGGGGATAGAGATGCC-3y(SEQ ID NO 8)應(yīng)用以上引物，以人類(lèi)DNA聚合酶Pol δ的4個(gè)亞基cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)， 擴(kuò)增出的各亞基片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切割下含目的片段的凝膠，用QIAGEN Gel Extraction試劑盒回收擴(kuò)增出的DNA片段；用Bamm ^WEcoRl對(duì)擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行雙 酶切，同時(shí)，對(duì)供體質(zhì)粒PFastBac也進(jìn)行漢a HI和的雙酶切反應(yīng)，酶切反應(yīng)產(chǎn)物分別 用試劑盒再純化一次，將酶切后純化的PCR產(chǎn)物和供體質(zhì)粒pFastBac用連接試劑盒進(jìn)行連 接反應(yīng)，14°C下過(guò)夜；將連接產(chǎn)物于大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)混合 物涂于含100 μδ/πι1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜；挑選LB平板上的 單個(gè)菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA ；對(duì)質(zhì)粒DNA用Ba·和進(jìn)行雙酶切 鑒定，篩選出已插入正確亞基的重組供體質(zhì)粒。經(jīng)序列檢測(cè)，成功獲得分別含各亞基正確序 列的重組供體質(zhì)粒 pFastBac_pl25、pFastBac_p68、pFastBac_p50 禾口 pFastBac_pl2。
實(shí)施例四含單亞基重組家蠶桿狀病毒的制備將實(shí)施例三中所構(gòu)建的重組供體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化含BmNPV-Bacmid的大腸桿菌感受 態(tài)細(xì)胞DHlOBac，在Helper作用下通過(guò)Tn7轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座，經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到重組穿 梭載體，分別提取含各亞基基因片段的重組Bacmi d DNA，用特異性M13引物(Forward M13-47, Reverse: RV-M)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)驗(yàn)證；用 CELLFECTIN Reagent 介導(dǎo)重組的 Bacmid DNA轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，經(jīng)兩輪病毒的擴(kuò)增，獲得含各亞基的單個(gè)重組家蠶桿狀病毒 rBmNPV-pFast-pl25, rBmNPV-pFast-p68, rBmNPV-pFast-p50 禾口 rBmNPV-pFast_pl2。
同時(shí)利用AcMNPV-Bac-to-Bac系統(tǒng)(購(gòu)自hvitrogen公司)，在Sf_9細(xì)胞中制 備出重組 AcMNPV 桿狀病毒 rAc -pFast_pl25、rAc -pFast_p68、rAc -pFast_p50 禾口 rAc -pFast-pl2供其它實(shí)驗(yàn)使用。
實(shí)施例五各亞基不同組合重組家蠶桿狀病毒的制備測(cè)定實(shí)施例四中所制備的各亞基單個(gè)重組病毒的滴度，按1:1的病毒滴度比例 共感染家蠶BmN細(xì)胞，細(xì)胞感染4 一 6天后，收集細(xì)胞和感染液混合物，在4 下以 10, 000 rpm速度離心2分鐘，獲得的上清即為制備的各亞基不同組合的重組家蠶桿狀 病毒母液 rBmNPV-pFast-pl25、rBmNPV-pFast-p 125/p50 > rBmNPV-pFast-p 125/p50/p 12 >rBmNPV-pFast-pl25/p68/p50 和 rBmNPV-pFast_pl25/p68/p50/pl2，裂解離心后的轉(zhuǎn)染細(xì) 胞，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，將膠分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在各亞基相應(yīng)位置用 醫(yī)用剪刀將膜剪成條，含各亞基的膜條用相對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，經(jīng)Western檢測(cè)，其 病毒感染和各種不同亞基組合在BmN細(xì)胞中的表達(dá)和裝配情況如圖1所示。
實(shí)施例六四亞基組合重組病毒在家蠶中的表達(dá)和裝配將實(shí)施例五所制備的四亞基組合的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV-pi^st-pl25/p68/p50/ pl2接種五齡起蠶第二天的家蠶(306品種)，每條蠶接種1.0X105 PFUJP 5μ1接種母液中 含2 X IO7 PFU/ml，共接種大約300頭蠶，收集4 一 5天發(fā)病后的蠶血，從每100頭蠶血平均 混合液中取5 μ 血樣，如實(shí)施例三方法進(jìn)行Wfestern檢測(cè)，四亞基組合重組病毒在家蠶306 中的表達(dá)和裝配如圖2所示。
實(shí)施例七分離純化后的酶活性收集實(shí)施例六中表達(dá)并裝配了人DNA聚合酶δ四亞基蛋白復(fù)合物的蠶血，用專(zhuān)用裂解 緩沖液稀釋?zhuān)?jīng)超聲波裂解、高速離心后取上清，經(jīng)過(guò)免疫親和層析柱和離子交換層析柱分 離純化，獲得高純度的目的產(chǎn)物，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖3所示，蛋白純度在95%以上， 平均每條蠶可獲得約10微克純化后的Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物；以P0ly(dA)/0lig0(dT) 為引物/模板的初步分析結(jié)果如圖4所示，其比活性約為20，000 Units/mg,PCNA的刺激倍 數(shù)接近8倍。
實(shí)施例八家蠶中表達(dá)組裝的Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物的分子量取250微升實(shí)施例五中經(jīng)過(guò)FPLC MonoQ純化后的第15號(hào)餾分，在分子篩FPLC Superose 6上測(cè)定其分子量，如圖5所示，斯托克斯半徑(Stokes radius)大約為60. 5A。根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，所測(cè)定的Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物的分子量約為228 KDa, 接近由氨基酸序列計(jì)算的理論值239 KDa，四個(gè)亞基在體內(nèi)以1 :1的分子比例裝配。
本發(fā)明利用家蠶生物反應(yīng)器所制備的人類(lèi)DNA聚合酶Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物 在家蠶體內(nèi)得到高效地表達(dá)和正確裝配，制備的Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物在家蠶體內(nèi)的翻 譯后修飾好，具有很高的生物活性。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器制備人DNA聚合酶δ的方法，包括將組成人DNA聚合酶δ的 4個(gè)亞基ρ125、ρ68、ρ50和ρ12的基因分別構(gòu)建到桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBac上，分別得 至Ij重組質(zhì)粒 pFastBac_pl25、pFastBac_p68、pFastBac_p50 禾Π pFastBac_pl2，在經(jīng)過(guò)改造的 大腸桿菌DHlOBac/BmNPV中和家蠶BmNPV桿狀病毒DNA于Tn7轉(zhuǎn)座子上發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過(guò)藍(lán) 白斑篩選出帶有正確亞基的克隆，隨后在家蠶BmN細(xì)胞中制備該4種亞基不同裝配組合的 重組病毒，用獲得的重組病毒感染宿主昆蟲(chóng)家蠶，在宿主昆蟲(chóng)家蠶體內(nèi)表達(dá)并包裝成多亞 基蛋白復(fù)合物的人DNA聚合酶δ經(jīng)分離純化后獲得。
2.按照權(quán)利要求1所述應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器制備人DNA聚合酶δ的方法，其特征在 于所述的重組病毒是通過(guò)表皮注射來(lái)感染5齢幼蟲(chóng)。
3.按照權(quán)利要求1所述應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器制備人DNA聚合酶δ的方法，其特征在 于所述的分離純化是指收集含表達(dá)并包裝了人DNA聚合酶δ多亞基蛋白復(fù)合物的家蠶幼 蟲(chóng)的體液或整體勻漿，在裂解緩沖液存在下經(jīng)超聲波裂解，4 下進(jìn)行高速離心，收集的上 清經(jīng)過(guò)免疫親和層析柱和離子交換層析柱分離純化，獲得到純化后的產(chǎn)物。
4.按照權(quán)利要求3所述應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器制備人DNA聚合酶δ的方法，其特征在 于所說(shuō)的免疫親和層析柱，是將抗Ρ125的多克隆抗體與CarboLink Coupling Gel耦聯(lián) 而制得。
5.按照權(quán)利要求4所述應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器制備人DNA聚合酶δ的的方法，其特征在 于，其中，抗Ρ125的多克隆抗體是通過(guò)下述方法制得利用Bac-to-Bac系統(tǒng)，制備含6個(gè)組 氨酸標(biāo)簽的DNA聚合酶δ催化大亞基ρ125作為抗原，在成年新西蘭兔中制備抗ρ125的抗 血清，純化抗血清獲得高純度的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉用應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器制備人DNA聚合酶δ的方法。具體是將人DNA聚合酶δ的4個(gè)亞基分別構(gòu)建到供體質(zhì)粒上；在經(jīng)過(guò)改造的大腸桿菌DH10Bac/BmNPV中和家蠶BmNPV桿狀病毒DNA中Tn7轉(zhuǎn)座子上發(fā)生轉(zhuǎn)座，篩選出帶有正確亞基的克隆，隨后在家蠶BmN細(xì)胞中制備該4種亞基不同裝配組合的重組病毒；感染宿主家蠶，在家蠶體內(nèi)進(jìn)行多亞基蛋白復(fù)合物的表達(dá)和裝配；收集感染后的幼蟲(chóng)體液或整體勻漿，經(jīng)分離純化后獲得目的產(chǎn)物。通過(guò)本發(fā)明可以高效、低成本、大規(guī)模地制備高比活、正確裝配的DNA聚合酶多亞基蛋白復(fù)合物；能夠被廣泛地應(yīng)用于某些重要疾病、特別是癌癥疾病研究領(lǐng)域涉及DNA復(fù)制和損傷修復(fù)之基礎(chǔ)研究。
文檔編號(hào)C12N9/00GK102031263SQ201010556599
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者劉曉勇, 周亞竟, 姚勤, 李國(guó)輝, 李驍, 王玉玨, 陳克平, 陳慧卿, 陳焰, 麥維軍 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)