專利名稱：一種植物甾醇經微生物轉化為add的方法及所用培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制藥領域，具體而言，本發(fā)明涉及到一種植物留醇經微生物轉化為ADD 的方法及所用培養(yǎng)基。
背景技術：
雄甾二烯二酮(簡稱ADD)是一種合成甾體激素類藥物的重要中間體，通過它可合成包括地塞米松、潑尼松龍、倍他米松等10余種臨床上廣泛使用的激素藥物。ADD的化學結構式如下面式I所示。
式I
合成雄留二烯二酮目前有兩種方法一是用薯蕷皂甙為起始原料，經過11步化學合成反應得到。二是由植物留醇經過微生物轉化直接得到ADD。其中微生物轉化具有反應條件溫和，節(jié)能環(huán)保等方面優(yōu)勢，決定其是否具有經濟性包括反應底物濃度、轉化率和轉化特異性，轉化特異性是指在轉化過程中ADD和副產物AD(雄留-4-烯-3，17-二酮)的比值，其比值越高，說明其轉化特異性愈好。美國專利USP4345(^9描述了采用分枝桿菌變種 (Mycobacterium phlei)轉化得到AD和ADD ；美國專利USP7259005描述了采用另一種分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)轉化植物留醇得到AD和ADD，但其轉化效率和特異性均不高，轉化率最高僅有64%，轉化后發(fā)酵液中AD和ADD的最高濃度僅有2177mg/L。從經濟角度計算，上述技術指標顯示其無工業(yè)價值。
如何提高由植物留醇經過微生物轉化直接得到ADD的經濟性成為其能否完全替代化學合成法的關鍵。發(fā)明內容
為了解決上述現有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種在植物留醇經微生物轉化為ADD的方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供一種植物留醇經微生物轉化為ADD的方法。
具體而言，本發(fā)明提供
(1) 一種在植物甾醇經微生物轉化為ADD的方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含有溶解或分散在水中的下列物質
葡萄糖0.l-100g/L,
黃豆粉10-100g/L，
磷酸二氫鉀0.5-10g/L,
碳酸鈣0.l-10g/L，
硫酸亞鐵0·001-0. 01g/L,
氯化錳0.0001-0. 001g/L，以及
植物甾醇10-100g/L；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.0-8.0 ；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物甾醇助溶劑或分散劑。
(2)根據(1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含有溶解或分散在水中的下列物質
葡萄糖25g/L，
黃豆粉40g/L，
磷酸二氫鉀2g/L，
碳酸鈣lg/L，
硫酸亞鐵0.0051g/L,
氯化錳0.0005g/L,以及
植物甾醇50g/L；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7. 2 ；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物甾醇助溶劑或分散劑。
(3)根據⑴或⑵所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述植物甾醇助溶劑或分散劑為聚乙二醇、葵花油、或乙二醇。
(4) 一種植物留醇經微生物轉化為ADD的方法，該方法包括，在發(fā)酵培養(yǎng)分枝桿菌 (Mycobacterium)時使用根據(1)至(3)中任一項所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
(5)根據中所述的方法，在該方法中，在種子罐種齡達到30-50小時的時候進行接種，接種量為5-10% (ν/ν)；然后，在的溫度下進行發(fā)酵，并將溶氧控制為 35-80%。
(6)根據(5)中所述的方法，在該方法中，在所述種子罐種齡達到42小時的時候進行接種，接種量為5% (ν/ν)；然后，在30°C的溫度下進行發(fā)酵，并將溶氧控制為35-45%。
本發(fā)明致力于提高植物留醇通過生物轉化合成雄留二烯二酮轉化效率的方法。經過本發(fā)明人研究發(fā)現，提高轉化效率的關鍵環(huán)節(jié)涉及到發(fā)酵工藝的設計。本發(fā)明人發(fā)現對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵過程包括PH、攪拌轉速、通氣、補料、溫度等工藝參數進行優(yōu)化設計，可顯著提高轉化效率。優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，發(fā)酵底物濃度可達到50g/L，轉化率可達到70%，發(fā)酵結束后，發(fā)酵液中ADD與AD的重量比為98 2，顯著高于公開報道的技術指標。
具體實施方式
以下通過具體實施方式
的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基包含有溶解或分散在水中的下列物質葡萄糖0. I-IOOg/L，優(yōu)選為25g/L ；黃豆粉10-100g/L，優(yōu)選為40g/L ；磷酸二氫鉀0. 5-lOg/L，優(yōu)選為2g/L ； 碳酸鈣:0. l-10g/L，優(yōu)選為lg/L ；硫酸亞鐵0. 001-0. 01g/L，優(yōu)選為0. 0051g/L ；氯化錳 0. 0001-0. 001g/L，優(yōu)選為0. 0005g/L ；以及植物甾醇:10_100g/L，優(yōu)選為50g/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為5. 0-8. 0，優(yōu)選為7. 2 ；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物留醇助溶劑或分散劑，特別是聚乙二醇、葵花油、乙二醇，更特別的是葵花油。
在本文中，黃豆粉也稱為大豆粉，是把黃豆經粉碎制備而得的。在本發(fā)明中，黃豆粉優(yōu)選為通過80目篩的細粉。
在本文中，植物甾醇為主要包括β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的混合物。其中， β -谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的母核相同，其結構式分別為
在本文中，植物留醇助溶劑或分散劑是指為了增加植物留醇在發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解度或分散程度而添加的助劑，包括聚乙二醇、葵花油、乙二醇等。
本發(fā)明的植物甾醇經微生物轉化為ADD的方法包括，在發(fā)酵培養(yǎng)分枝桿菌 (Mycobacterium)時使用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基。
優(yōu)選的是，在本發(fā)明的方法中，在種子罐種齡達到30-50小時的時候進行接種，接種量為5-10% (ν/ν)；然后，在的溫度下進行發(fā)酵，并將溶氧控制為35-80%。更優(yōu)選的是，在所述種子罐種齡達到42小時的時候進行接種，接種量為5% (ν/ν)；然后，在 30°C的溫度下進行發(fā)酵，并將溶氧控制為35-45%。
在本文中，溶氧是指發(fā)酵過程的發(fā)酵液中的氧濃度與發(fā)酵初始時發(fā)酵液中的氧濃度的百分比值(即DO值)。
本發(fā)明涉及的發(fā)酵工藝技術特征描述如下
(1)本發(fā)明改進了生物轉化體系。根據現有的文獻報道，植物留醇微溶于水，必須要增加其在水中的溶解度，才能提高轉化效率。傳統(tǒng)的反應體系是用雙水相系統(tǒng)和環(huán)糊5精包埋等技術，盡管轉化率達到了 80%以上，底物植物留醇加入量僅0. 1-0.8%，發(fā)酵液中 ADD產量很少，發(fā)酵單位很低，仍無法工業(yè)化生產。現有技術中，有的采用植物油如葵花油進行分散，增加底物植物留醇加入量。事實上，后期純化很困難，因為產物ADD很容易溶解于植物油中，需要用柱層析解決。本發(fā)明開發(fā)一種生物轉化體系，不在培養(yǎng)基中添加任何植物甾醇助溶劑或分散劑，讓植物留醇懸浮于培養(yǎng)基中直接進行轉化，在保證轉化效率前提下， 又為發(fā)酵結束后產品分離純化帶來便利。
( 本發(fā)明優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基。對包括碳源、氮源、金屬離子等營養(yǎng)元素進行優(yōu)篩， 確定了以葡萄糖為碳源、以硝酸銨為氮源、添加鈣鹽、氯化鎂等作為金屬離子試劑，可促進植物甾醇轉化為ADD。
C3)本發(fā)明優(yōu)化了發(fā)酵過程中的關鍵工藝控制參數。對包括種齡、種量、發(fā)酵溫度、 PH、溶氧、泡沫控制方法等發(fā)酵關鍵控制參數優(yōu)化，提高了 ADD的轉化效率。
由本發(fā)明得到的發(fā)酵液中ADD的測定方法如下所示
測定條件
色譜柱Kromasil C18 5ym 200X4. 6mm (可購自日本島津公司)；
流動相甲醇水=80 20 (V/V)；
流速1. Oml/min ；
檢測波長242nm。
標準曲線的測定配制一系列不同濃度的ADD標準溶液(50-500 μ g/ml)，分別取各濃度標準溶液的過濾液20 μ 1注入高效液相色譜儀中，測定其吸收峰面積，然后對濃度 (Y)和吸收峰面積(X)進行一元線性回歸，得到一元線性回歸方程。
ADD含量計算方法將待測樣品制成合適濃度(50-500 μ g/ml)的甲醇溶液，用 0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，準確吸取濾液20 μ 1注入HPLC中，記錄色譜圖，將ADD峰面積代入上述的回歸方程中，計算得到樣品中ADD量。
下述實施例1中使用的分枝桿菌菌種來源于美國菌種保藏中心(ATCC)，該菌種于 1959年提交永久保藏，保藏號為NCTC1542，目前無任何限制發(fā)放給公眾。
實施例1 植物甾醇生物轉化為ADD的發(fā)酵、提取工藝
ADD來自于分枝桿菌培養(yǎng)液，其培養(yǎng)、提取和純化步驟如下
(1)種子培養(yǎng)
一級種子瓶、二級種子罐的培養(yǎng)基的配比和配制方法相同，液體培養(yǎng)基組成如表1 所示。
表1種子培養(yǎng)基組成(克/每升)
權利要求
1.一種在植物留醇經微生物轉化為ADD的方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含有溶解或分散在水中的下列物質葡萄糖0. l-100g/L, 黃豆粉10-100g/L， 磷酸二氫鉀0. 5-10g/L, 碳酸鈣0. l-10g/L, 硫酸亞鐵0. 001-0. 01g/L, 氯化錳0. 0001-0. 001g/L,以及植物甾醇:10-100g/L；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為5. 0-8. 0 ；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物甾醇助溶劑或分散劑。
2.根據權利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含有溶解或分散在水中的下列物質 葡萄糖25g/L，黃豆粉40g/L， 磷酸二氫鉀2g/L， 碳酸鈣lg/L， 硫酸業(yè)鐵0. 0051g/L, 氯化錳0. 0005g/L,以及植物甾醇50g/L ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為7. 2。
3.根據權利要求1或2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述植物留醇助溶劑或分散劑為聚乙二醇、葵花油、或乙二醇。
4.一種植物留醇經微生物轉化為ADD的方法，該方法包括，在發(fā)酵培養(yǎng)分枝桿菌 (Mycobacterium)時使用根據權利要求1至3中任一項所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
5.根據權利要求4中所述的方法，在該方法中，在種子罐種齡達到30-50小時的時候進行接種，接種量為5-10% (ν/ν)；然后，在的溫度下進行發(fā)酵，并將溶氧控制為 35-80%。
6.根據權利要求5中所述的方法，在該方法中，在所述種子罐種齡達到42小時的時候進行接種，接種量為5% (ν/ν)；然后，在30°C的溫度下進行發(fā)酵，并將溶氧控制為35-45%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物甾醇經微生物轉化為ADD的方法及所用培養(yǎng)基。其中，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基包含有溶解或分散在水中的下列物質葡萄糖0.1-100g/L，黃豆粉10-100g/L，磷酸二氫鉀0.5-10g/L，碳酸鈣0.1-10g/L，硫酸亞鐵0.001-0.01g/L，氯化錳0.0001-0.001g/L，以及植物甾醇10-100g/L；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.0-8.0；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物甾醇助溶劑或分散劑。采用本發(fā)明的方法及培養(yǎng)基，植物甾醇轉化為ADD的轉化率更高；反應底物的濃度更高，使得轉化效率也得到提高；轉化特異性更高，簡化了分離提純工藝。
文檔編號C12N1/20GK102477404SQ20101055712
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權日2010年11月24日
發(fā)明者何勇崴, 何晶, 劉省偉, 岳光, 趙德 申請人:北大國際醫(yī)院集團有限公司, 北大國際醫(yī)院集團重慶大新藥業(yè)股份有限公司, 北大方正集團有限公司