專(zhuān)利名稱(chēng)：松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種松口蘑培養(yǎng)物基 因組的制備方法。
背景技術(shù)：
松口蘑(Tricholoma matsutake)又名松茸，是一種與植物共生的真菌，其子實(shí)體 是具有食藥用價(jià)值的昂貴蘑菇，目前國(guó)際上尚不能人工栽培。我國(guó)東北長(zhǎng)白山區(qū)、西南橫斷 山區(qū)野生的松口蘑主要供出口，每年為國(guó)家賺回近百億美元。為了保護(hù)利用這一珍稀的自 然資源，迫切需要解讀松口蘑的基因組，發(fā)展松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法。由于松口蘑子實(shí)體珍稀昂貴，研究材料針對(duì)松口蘑的純培養(yǎng)菌絲體，而松口蘑培 養(yǎng)物屬于難培養(yǎng)微生物，其生長(zhǎng)速度異常緩慢，在優(yōu)選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個(gè)月，其菌落直徑不 到1cm，菌體生物量太少，常規(guī)絲狀菌制備基因組的方法不適用松口蘑。制備基因組的技術(shù)操作單元主要是細(xì)胞裂解、萃取、過(guò)濾、沉淀，其中生物化學(xué)的 萃取、過(guò)濾、沉淀技術(shù)已經(jīng)成熟，但細(xì)胞裂解因應(yīng)用微生物種類(lèi)不同必須采用適宜的獨(dú)特技 術(shù)，國(guó)內(nèi)外迄今發(fā)表的研究文獻(xiàn)都是圍繞該技術(shù)進(jìn)行發(fā)明創(chuàng)造。檢索國(guó)內(nèi)外迄今發(fā)表的研 究文獻(xiàn)，細(xì)胞裂解技術(shù)包括1、機(jī)械法，主要是各種液氮研磨、室溫研磨、玻璃珠研磨等手段，缺點(diǎn)是操作繁瑣， 操作中生物量有損失，得率低，不安全，基因組降解，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。2、化學(xué)法，采用氯化芐、各類(lèi)溶菌酶消化，缺點(diǎn)是特異性差，成本高，適用范圍狹窄。3、物理法，報(bào)道了應(yīng)用超聲波、微波、電鉆、煮沸等方法，缺點(diǎn)是操作繁瑣，不安全， 基因組降解，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，生物活性喪失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，該方法得率高，制 備的松口蘑培養(yǎng)物基因組的質(zhì)量完整、純度高。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方 法，其特征在于它包括如下步驟1)從松口蘑子實(shí)體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物；2)保護(hù)緩沖液的配制:50mmol/L Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl緩沖液的pH為 8.0) ；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA的中文名乙二胺四乙酸鈉，EDTA的pH為8. 0)； 1. 4mol/LNaCl 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB的中文名十六烷基三甲基溴化銨)；3)取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物浸沒(méi)于保護(hù)緩沖液中，震蕩、液氮冷凍、水浴，重復(fù)上 述震蕩、液氮冷凍、水浴過(guò)程1 3次；得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液；4)按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液與氯仿/異戊醇的體積比為1 1，選取松 口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液、氯仿/異戊醇；其中氯仿/異戊醇由氯仿和異戊醇組成，氯仿與異戊醇的體積比為M 1 ；用氯仿/異戊醇萃取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液中的松口蘑培養(yǎng)物基因組， 離心，收集上清液；5)以與上清液等體積的異丙醇對(duì)上清液進(jìn)行沉淀，離心，得到沉淀物；沉淀物用 乙醇洗后風(fēng)干，溶于TE緩沖液，置-20°C下保存，得到松口蘑培養(yǎng)物基因組。步驟3)所述的松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物與保護(hù)緩沖液的配比為IOmg 500 μ L0步驟幻所述的震蕩、液氮冷凍、水浴為震蕩10s，液氮冷凍10s，70°C水浴30s。步驟4)所述的萃取時(shí)間為30s，離心為13000g離心lmin。步驟5)所述的離心為4000g離心lmin。步驟幻所述的TE緩沖液的用量為按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物與TE緩沖液的配比 為 IOmg 50 μ L0 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明先保護(hù)緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)保護(hù)，避免基因組降解；然后采用低溫快速 凍結(jié)與常溫快速融化交替1 3次，引起微量培養(yǎng)物細(xì)胞完美裂解，所得松口蘑培養(yǎng)物基因 組的質(zhì)量完整，生物活性保持。2、低溫快速凍結(jié)，不需手工操作，安全；抑制降解酶，保持生物活性；3、常溫快速融化，常規(guī)設(shè)備，成本低廉，方便安全；4、用料微量，步驟少，耗時(shí)短，效率高；5、對(duì)松口蘑微量培養(yǎng)菌體，沒(méi)有操作損失，得率高，可收獲足量高分子質(zhì)量的基因 組，IOmg培養(yǎng)物可制備濃度在30-50 μ g/mL的產(chǎn)品，滿(mǎn)足100次以上的PCR實(shí)驗(yàn)用量；6、純度高。主要用途廣泛適用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與遺傳操作，可以解讀松茸基因組信 息、制備分子條碼，進(jìn)行染色體解組等分子育種，馴化栽培松茸，開(kāi)發(fā)生物技術(shù)藥物。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。實(shí)施例1 松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，它包括如下步驟1)、從松口蘑子實(shí)體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物；經(jīng) DNA親菌鑒定確認(rèn)無(wú)誤后進(jìn)入下面的操作步驟。2)、保護(hù)緩沖液的配制:50mmol/L Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl緩沖液的pH為 8.0) ；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA的中文名乙二胺四乙酸鈉，EDTA的pH為8. 0)； 1. 4mol/LNaCl 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB的中文名十六烷基三甲基溴化銨)。3)取IOmg松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物，用500 μ L保護(hù)緩沖液浸沒(méi)，震蕩10s，液氮冷 凍10s，70°C水浴30s ；重復(fù)上述震蕩、液氮冷凍、水浴過(guò)程3次，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物 的裂解液。4)、按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液與氯仿/異戊醇的體積比為1 1，選取松 口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液、氯仿/異戊醇；其中氯仿/異戊醇由氯仿和異戊醇組成，氯仿與異戊醇的體積比為M 1 ；萃取30s ； 13000g離心Imin ；收集上清液。5)以與上清液等體積的異丙醇對(duì)上清液進(jìn)行沉淀，4000g離心lmin，得到沉淀物； 沉淀物用70wt%乙醇洗后風(fēng)干，溶于50 μ 1 TE緩沖液(10mmol/l Tris-HCl，pH8. 0 ； lmmol/ 1 EDTA)，置-20°C下保存，即為松口蘑培養(yǎng)物基因組制品(產(chǎn)品)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)10mg松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物可制備濃度在30-50 μ g/mL的產(chǎn)品(說(shuō)明 得率高)，經(jīng)電泳檢測(cè)基因組質(zhì)量完整，分子量高，滿(mǎn)足100次以上的PCR實(shí)驗(yàn)用量；用分光 光度計(jì)測(cè)定0D26(i/28(i在1. 8-2. 0之間，表明雜質(zhì)少，純度高，廣泛適用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 與遺傳操作。實(shí)施例2 松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，它包括如下步驟1)從松口蘑子實(shí)體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物(采用現(xiàn)有方法)，得到松口蘑的菌 絲體培養(yǎng)物(為現(xiàn)有的)；2)保護(hù)緩沖液的配制50mmol/L(25°C時(shí))Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl緩沖液 的pH為8. 0) ；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA的中文名乙二胺四乙酸鈉，EDTA的pH為 8.0) ； 1.4mol/L NaCl十六烷基三甲基溴化銨(CTAB的中文名十六烷基三甲基溴化 銨)；3)取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物浸沒(méi)于保護(hù)緩沖液中，震蕩、液氮冷凍、水浴，重復(fù)上 述震蕩、液氮冷凍、水浴過(guò)程1次；得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液；4)按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液與氯仿/異戊醇的體積比為1 1，選取松 口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液、氯仿/異戊醇；其中氯仿/異戊醇由氯仿和異戊醇組成，氯 仿與異戊醇的體積比為M 1 ；用氯仿/異戊醇萃取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液中的松口蘑培養(yǎng)物基因組， 離心，收集上清液；5)以與上清液等體積的異丙醇對(duì)上清液進(jìn)行沉淀，離心，得到沉淀物；沉淀物用 乙醇洗后風(fēng)干，溶于 TE 緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, ρΗ8· 0 ；lmmol/L EDTA)，置 _20°C下保 存，得到松口蘑培養(yǎng)物基因組制品。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)10mg松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物可制備濃度在30-50 μ g/mL的產(chǎn)品(說(shuō)明 得率高)，經(jīng)電泳檢測(cè)基因組質(zhì)量完整，分子量高，滿(mǎn)足100次以上的PCR實(shí)驗(yàn)用量；用分光 光度計(jì)測(cè)定0D26(i/28(i在1. 8-2. 0之間，表明雜質(zhì)少，純度高，廣泛適用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 與遺傳操作。
權(quán)利要求
1.松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)從松口蘑子實(shí)體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物；2)保護(hù)緩沖液的配制50mmol/LTris-HCl緩沖液；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉； 1. 4mol/LNaCl ；十六烷基三甲基溴化銨；3)取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物浸沒(méi)于保護(hù)緩沖液中，震蕩、液氮冷凍、水浴，重復(fù)上述震 蕩、液氮冷凍、水浴過(guò)程1 3次；得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液；4)按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液與氯仿/異戊醇的體積比為1 1，選取松口蘑 的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液、氯仿/異戊醇；其中氯仿/異戊醇由氯仿和異戊醇組成，氯仿與 異戊醇的體積比為M 1 ；用氯仿/異戊醇萃取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液中的松口蘑培養(yǎng)物基因組，離 心，收集上清液；5)以與上清液等體積的異丙醇對(duì)上清液進(jìn)行沉淀，離心，得到沉淀物；沉淀物用乙醇 洗后風(fēng)干，溶于TE緩沖液，置_20°C下保存，得到松口蘑培養(yǎng)物基因組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟幻所述 的松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物與保護(hù)緩沖液的配比為IOmg 500 μ L0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟幻所述 的震蕩、液氮冷凍、水浴為震蕩10s，液氮冷凍10s，70°C水浴30s。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟4)所述 的萃取時(shí)間為30s，離心為:13000g離心Imin0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟幻所述 的離心為4000g離心lmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟幻所述 的TE緩沖液的用量為按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物與TE緩沖液的配比為IOmg 50 μ L0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法。松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)從松口蘑子實(shí)體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物；2)保護(hù)緩沖液的配制50mmol/L Tris-HCL緩沖液；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉；1.4mol/L NaCl；4wt％十六烷基三甲基溴化銨；3)取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物浸沒(méi)于保護(hù)緩沖液中，震蕩、液氮冷凍、水浴，重復(fù)上述震蕩、液氮冷凍、水浴過(guò)程1～3次；4)萃取，離心，收集上清液；5)以與上清液等體積的異丙醇對(duì)上清液進(jìn)行沉淀，離心，得到沉淀物；溶于TE緩沖液，保存，得到松口蘑培養(yǎng)物基因組。該方法用料微量、步驟少、耗時(shí)短、得率高，制備的松口蘑培養(yǎng)物基因組的質(zhì)量完整、純度高。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102061298SQ201010557760
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者曾東方, 陳玢 申請(qǐng)人:武漢工程大學(xué)