專(zhuān)利名稱(chēng)：一種分離的核苷酸分子及在布尼亞病毒檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸分子及在布尼亞病毒檢測(cè)中的應(yīng)用，以及布尼亞病毒的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
布尼亞病毒科(Bunyaviridae)具有300多個(gè)病毒成員，分為5個(gè)屬，包括布尼亞 (Orthobunyavirus)(Hantavirus) >(Nairovirus) > S^f^f
毒屬(Wilebovirus)和番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)。布尼亞科病毒粒子通常為具有包膜的球形，直徑約80 120nm，表面具有長(zhǎng)5 IOnm的糖蛋白突起，這些突起被包埋在厚度約為5nm的雙層脂質(zhì)膜中。該科病毒的所有成員為三節(jié)段基因組，分別是大(Large, L)、中(Medium, Μ)、小(Small, S)3種反義或雙義線(xiàn)形ssRNA，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，包括兩種外膜糖蛋白(&i/Gc)、一種核蛋白(N)和一種超大的 RNA多聚酶(L)。每個(gè)基因組RNA片段的末端核苷酸堿基配對(duì)，形成非共價(jià)閉環(huán)RNA。盡管布尼亞科病毒5個(gè)成員屬之間在結(jié)構(gòu)上有很多相似的地方，但它們之間仍存在很多差異該科4個(gè)屬主要感染脊椎動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物，通常對(duì)脊椎動(dòng)物寄主是溶細(xì)胞性的，而對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物僅引起不顯著的細(xì)胞病理變化。自然感染見(jiàn)于許多脊椎動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物(蚊、蜱、白蛉等)，可感染小鼠，并能在一些哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和蚊細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)；對(duì)人可引起類(lèi)似流感或登革熱的疾病、出血熱(立夫特谷熱和克里米亞一剛果出血熱等)及腦炎 (加利福尼亞腦炎)等。有蚊媒、蜱媒、白蛉媒3種傳播類(lèi)型。有些病毒在其節(jié)肢動(dòng)物媒介中，可經(jīng)卵、交配或胚胎期傳播。番茄斑萎病毒屬是布尼亞科病毒中唯一能感染植物的一個(gè)屬，它通過(guò)薊馬的繁殖傳播，其寄主范圍很廣，可感染80個(gè)科，1000多種植物.引起植物廣泛褪綠、壞死、矮化和耳突等癥狀。2009年5月至2010年9月，湖北、河南等地醫(yī)院陸續(xù)收治多例疑似人粒細(xì)胞無(wú)形體病(Human granulocytic anaplasmosis, HGA)的感染性病例，病人的臨床表現(xiàn)主要為急性發(fā)熱，伴有不同程度的乏力、頭痛、肌肉酸痛、惡心、嘔吐、腹瀉等，部分病例可出現(xiàn)牙齦出血、消化道出血及彌漫性血管內(nèi)出血。實(shí)驗(yàn)室檢查主要是白細(xì)胞減少、血小板減少及不同程度的肝臟腎臟等多器官功能損害，部分重癥患者救治無(wú)效死亡。這類(lèi)病例均以疑似人粒細(xì)胞無(wú)形體病作為臨床診斷，但實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人粒細(xì)胞無(wú)形體均為陰性，同時(shí)對(duì)漢坦病毒等能引起類(lèi)似臨床癥狀的已知病原檢測(cè)亦均為陰性。發(fā)明人利用Vero E6細(xì)胞從采自病人的血液樣本中成功地分離出了一種新的病毒。對(duì)分離的病毒進(jìn)行透射電子顯微鏡觀(guān)察顯示病毒顆粒呈球形，直徑約lOOnm，外有脂質(zhì)包膜，表面有棘突?；蚪M包含三個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段(L、M*Q。其中，L片段全長(zhǎng)為 6368個(gè)核苷酸，包含單一讀碼框架編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(長(zhǎng)度為2084個(gè)氨基酸)。 病毒基因組末端序列高度保守，通過(guò)對(duì)該分離病毒基因組序列的分析，發(fā)現(xiàn)其符合布尼亞病毒科的基因組特征。根據(jù)基因組序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)也表明新病毒屬于布尼亞病毒科，與該科中的白蛉病毒屬最接近。
由于上述感染疫情在我國(guó)許多地方陸續(xù)出現(xiàn)，并且對(duì)人們的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。但目前臨床醫(yī)生、各級(jí)疾病預(yù)防控制中心人員及相關(guān)微生物領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)該病毒還缺乏一個(gè)基本的了解，對(duì)于由該病毒感染引起的疾病缺乏診斷和檢測(cè)方法，以及與其它微生物感染鑒別診斷的信息，這對(duì)于該病毒感染的預(yù)防與控制是極為不利的。為此，本發(fā)明在發(fā)現(xiàn)該病毒的基礎(chǔ)上，旨在尋求一種對(duì)該新發(fā)現(xiàn)病毒的快速、特異、敏感的核酸檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
基于以上目的，本發(fā)明人對(duì)新分離的病毒進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定，并對(duì)該病毒基因組進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了該病毒的一個(gè)L片段，其長(zhǎng)度為6368bp，與M和S片段相比，具有更高的保守性，可以有效地用于這種新型布尼亞病毒感染的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)L片段進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，獲得并分離了以該病毒L片段為模板的cDNA片段，基于該cDNA片段，本發(fā)明提供了 一種分離的核苷酸分子，其序列選自1)核苷酸序歹|J SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 24 中的任何一種；2)與核苷酸序列SEQ ID NO :1-SEQ ID NO J4中的任何一種至少95%同源性的核苷酸序列；3)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核苷酸序列SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 24中任何一種雜交的核苷酸序列；4)或者與1)-3)任何一種核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。上文所述的“互補(bǔ)”，是指核苷酸中兩條單鏈的堿基間主要通過(guò)氫鍵形成的一種特定的聯(lián)系，即堿基的配對(duì)關(guān)系。主要互補(bǔ)方式有腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)配對(duì)、鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶(G-C)配對(duì)。上文所述的嚴(yán)謹(jǐn)條件是指雜交反應(yīng)體系中避開(kāi)非同源性或部分同源性的核酸順序形成雜交體所需要條件的嚴(yán)格程度。一般是反應(yīng)溫度高、離子強(qiáng)度低會(huì)增加反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性(有利于單鏈形成時(shí)嚴(yán)謹(jǐn)性高)，它適合于堿基配對(duì)好、堿基順序完全同源的核酸雜交反應(yīng)，若反應(yīng)溫度低、離子強(qiáng)度高稱(chēng)雜交反應(yīng)的低嚴(yán)謹(jǐn)性，它適用于堿基配對(duì)差、堿基順序不完全同源的核酸反應(yīng)。本發(fā)明所述嚴(yán)謹(jǐn)條件為，在0. 5M磷酸鈉，7%SDS，65°C的條件下進(jìn)行雜交，再用0. 2XSSC，1% SDS，在65°C洗一次或多次。本發(fā)明還提供了含有上述核苷酸分子的序列的核苷酸分子。對(duì)于含有上述核苷酸序列的核苷酸分子，可以包括在L片段的cDNA片段中對(duì)上述核苷酸序列在5’端和/或3’ 端進(jìn)行延長(zhǎng)獲得的序列，也可以包括對(duì)上述核苷酸序列的5’端和/或3’端添加其它序列。 例如限制性酶切位點(diǎn)而獲得的序列。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述核苷酸分子序列為SEQ ID NO 25所示，即衍生于 L片段的cDNA。上文所述的SEQ ID NO :3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24，是作為 PCR 下游引
物序列顯示的，其與SEQ ID NO :25所示出的核苷酸序列為反向互補(bǔ)關(guān)系，即一條核苷酸序列的5’端與另一條核苷酸序列的3’端按照上述堿基配對(duì)原則互補(bǔ)。本發(fā)明還提供了所述的核苷酸分子作為多聚酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction, PCR)引物的應(yīng)用。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述PCR的上下游引物組合分別選自1)SEQ ID NO :1 禾口 3 ；2) SEQ ID NO 2 禾口 4 ；3) SEQ ID NO :5 和 7 ；4) SEQ ID NO 6 禾口 8 ；5) SEQ ID NO 9 禾口 11 ；6) SEQ ID NO 10 和 12 ；7) SEQ ID NO 13 和 15 ；8) SEQ ID NO 14 和 16 ；9) SEQ ID NO 17 和 19 ；10) SEQ ID NO 18 和 20 ；11) SEQ ID NO :21 和 23 ；12) SEQ ID NO 22 和 24。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述PCR為巢式RT-PCR，所述反應(yīng)所需的引物組合分別選自1)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO 1 和 3，第二輪巢式 PCR 引物 SEQID NO :2 和 4 ；2)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO 5 和 7，第二輪巢式 PCR 引物 SEQID NO :6 和 8 ；3)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO :9 和 11，第二輪巢式 PCR 引物 SEQ ID NO: 10 禾口 12 ；4)第一輪 PT-PCR 引物 SEQ ID NO 13 和 15，第二輪巢式 PCR 引物 SEQ ID NO 14 禾口 16 ；5)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO 17 禾口 19，第二輪巢式 PCR 引物 SEQ ID NO 18 禾口 20 ；6)第一輪 RT-PCR 引物 SEQ ID NO :21 禾口 23，第二輪巢式 PCR 引物 SEQ ID NO 22 和24。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)新型布尼亞病毒的巢式RT-PCR試劑盒，所述試劑盒包括1)作為RT-PCR和巢式PCR引物的權(quán)利要求1或2所述的核苷酸分子；2)常規(guī)的RT-PCR和PCR緩沖液；3)反轉(zhuǎn)錄酶和Taq DNA聚合酶。本發(fā)明還提供了含有前述核苷酸分子的核苷酸診斷探針?lè)肿?。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述探針?lè)肿拥暮塑账嵝蛄腥鏢EQ ID N0J6所示。在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述探針?lè)肿拥暮塑账嵝蛄腥鏢EQ IDNO 27所示。根據(jù)本發(fā)明提供的核苷酸設(shè)計(jì)出引物，再進(jìn)行巢式RT-PCR檢測(cè)，可以快速、特異、 敏感地檢測(cè)這種新型布尼亞病毒。本發(fā)明根據(jù)獲得的新布尼亞病毒基因組L片段序列， 利用 NCBI 提供的引物設(shè)計(jì)程序 Primer-BLAST (http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/tools/ primer-blast)，設(shè)計(jì)特異性引物，并將獲得的特異性引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析， 以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優(yōu)化后的引物序列。本發(fā)明中對(duì)臨床樣品的檢測(cè)采用巢式RT-PCR，與普通RT-PCR相比，巢式RT-PCR有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)1、 克服了單次擴(kuò)增“平臺(tái)期效應(yīng)”的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了 PCR的敏感性， 有利于樣品檢測(cè)靈敏度的提高；2、由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大進(jìn)行的可能性，保證了反應(yīng)的特異性；3、內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二階段反應(yīng)能否進(jìn)行，也是對(duì)第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，因此可以保證整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性。4、檢測(cè)快速，一般在幾小時(shí)之內(nèi)就可以獲得檢測(cè)結(jié)果，明顯快于其它的病毒學(xué)檢測(cè)方法。需要注意的是進(jìn)行巢式RT-PCR時(shí)避免樣品的污染。


圖1臨床樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果1 ；圖2臨床樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果2 ；圖3臨床樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果3 ；圖4臨床樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果4 ；圖5臨床樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后的核酸雜交檢測(cè)結(jié)果1 ；圖6臨床樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后的核酸雜交檢測(cè)結(jié)果2。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改和替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1巢式RT-PCR檢測(cè)方法(一 )本發(fā)明中涉及的巢式RT-PCR引物及引物序列。1、第一套巢式RR-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 1 :GTGGAGAATGGGCTGTCTCTT ；SEQ ID NO 2 :GGCCTGTACGACCAAATCTAC ；SEQ ID NO 3 CCACATTGCCTAGCGAGACAT ；SEQ ID NO 4 :AGCCTGAGTCGGTCTTGATGT。SEQ ID NO :1-4 分另Ij 位于 SEQ ID NO 25 的第 50-70、80_100、1128-1148、 1050-1070個(gè)核苷酸位置上。第一輪RT-PCR采用引物SEQ ID NO 1和3，產(chǎn)物的預(yù)期大小為1099bp ；第二輪巢式PCR采用引物SEQ ID NO :2和4，產(chǎn)物的預(yù)期大小為991bp。2、第二套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 5 :GGGCAAAGTGCCTTCTAGATG ；SEQ ID NO 6 :CATTGCCATCTCTGATGATCC ；SEQ ID NO 7 CTTAGACTTGTCCTCCAGACT ；SEQ IDNO 8 :CAGCTTCTCTCTCCAGAAAGC。SEQ ID NO :5_8 分別位于 SEQ ID NO 25 的第 1110-1130、1183-1203、1970-1990、 1877-1897個(gè)核苷酸位置上。
第一輪RR-PCR采用引物SEQ ID NO 5和7，產(chǎn)物的預(yù)期大小為881bp ；第二輪巢式PCR采用引物SEQ ID NO :6和8，產(chǎn)物的預(yù)期大小為7Mbp。3、第三套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 9 :CTCAGCCTTTCAGCCTAATCC ；SEQ ID NO 10 :GAACATTCCATGCCATCTCAG ；SEQ ID NO: 11 :CCATGAGACATCCCTATTACC ；SEQ ID NO 12 :GTGAGCTAAAAACCTTAGGTC。SEQ ID NO :9-12 分別位于 SEQ ID NO :25 的第 2160-2180、2208-2228、3188_3208、 3101-3121個(gè)核苷酸位置上。第一輪RT-PCR采用引物SEQ ID NO 9和11，產(chǎn)物的預(yù)期大小為1049bp ；第二輪巢式PCR采用引物SEQ ID N0:10和12，產(chǎn)物的預(yù)期大小為914bp。4、第四套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 13 :GGTAATAGGGATGTCTCATGG ；SEQ ID NO 14 :GGAATGATGCAGGGCATACTG ；SEQ ID NO 15 CAGTCTTCAGGAAGGCCCATC ；SEQ ID NO 16 :ACAGAGTGGCTGAGAGTTCCT。SEQ ID NO :13-16 分另丨」位于 SEQ ID NO 25 的第 3188-3208、3245_3洸5、 4078-4098,4009-4029個(gè)核苷酸位置上。第一輪RT-PCR采用引物SEQ ID NO: 13和15，產(chǎn)物的預(yù)期大小為91 Ibp ；第二輪巢式PCR采用引物SEQ ID NO :14和16，產(chǎn)物的預(yù)期大小為7^bp。5、第五套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 17 :GGAACTCTCAGCCACTCTGTT ；SEQ ID NO 18 TGAACAGGATGGGCCTTCCTG ；SEQ ID NO 19 :GCCTCTATGATCATCTCCAGC ；SEQ ID NO 20 :GTGTATGGGCCATTCAAGACC。SEQ ID NO :17-20 分別位于 SEQ ID NO 25 的第 4010-4130、4071_4091、 4954-4974,4921-4941個(gè)核苷酸位置上。第一輪RT-PCR采用引物SEQ ID NO 17和19，產(chǎn)物的預(yù)期大小為93^p ；第二輪巢式PCR采用引物SEQ ID NO 18和20，產(chǎn)物的預(yù)期大小為904bp。6、第六套巢式RT-PCR引物及引物序列SEQ ID NO 21 :GATGATCATAGAGGCCTTCTC ；SEQ ID NO 22 :ACTCTAGGAGGCTTCAGCAAG ；SEQ ID NO 23 CCAGTCACCCACAGACACATT ；SEQ ID NO 24 :TCAGCAGACCACAAGATAGGT。SEQ ID NO :21-24 分別位于 SEQ ID NO 25 的第 4960_4980、5111_5131、 6298-6231,5971-5991個(gè)核苷酸位置上。第一輪RT-PCR采用引物SEQ ID NO 21和23，產(chǎn)物的預(yù)期大小為1359bp ；第二輪巢式PCR采用引物SEQ ID NO :22和M，產(chǎn)物的預(yù)期大小為881bp。(二)本發(fā)明中巢式RT-PCR使用和涉及的主要試劑。
1、反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript CTase及Buffer (PrimeScript One StepRT-PCR Kit Ver. 2)，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。該試劑盒為一步法RT-PCR (One step RT-PCR) 試劑盒，即試劑盒含有將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的反轉(zhuǎn)錄酶及進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)的Taq DNA聚合酶，可以在一個(gè)反應(yīng)體系中先后完成反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。2、DNA聚合酶La Taq DNA polymerase及Buffer，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。3、dNTPS，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。4、無(wú) DNA 酶和 RNA 酶超純水(UltraRire DNase/RNase-FreeDistilled Water)， 購(gòu)自美國(guó)hvitrogen公司。5、樣品 RNA提取試劑盒 ^lIAamp MinElute Virus Spin Kit)，購(gòu)自德國(guó) Qiagen 公司。6、PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)，購(gòu)自德國(guó) Qiagen 公司。7、？0 產(chǎn)物克隆試劑盒(卩— 201 Vector)，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。8.DL2000DNA Marker，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品。(三)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用和涉及的主要儀器。PCR 儀為 Sensoquest Labcycler,德國(guó) Sensoquest 產(chǎn)品；離心機(jī)為 Eppendorf 5415D，德國(guó) Eppendorf 產(chǎn)品；電泳設(shè)備為北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為Bio-fcid Gel Doc XR，美國(guó)Bio-fcid產(chǎn)品。(四)本發(fā)明中的主要實(shí)驗(yàn)步驟。1、第一輪 RT-PCROne 乂印RT-PCR反應(yīng)體系如下PrimeScript IStep Enzyme Mix1 μ 12X IStep Buffer12. 5μ 1Template RNA3μ 1上游引物(10μ Μ)1μ 1下游引物(10μ Μ)Ιμ RNase Free dH206. 5 μ 1總反應(yīng)體積25 μ 1One 乂印 RT-PCR 反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種分離的核苷酸分子，其序列選自1)核苷酸序列SEQID NO I-SEQ ID NO 24中的任何一種；2)與核苷酸序列SEQID NO=I-SEQ ID NO : 中的任何一種至少95%同源性的核苷酸序列；3)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核苷酸序列SEQID NO=I-SEQ ID NO : 中任何一種雜交的核苷酸序列；4)或者與1)- 任何一種核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述分子的序列的核苷酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸分子，其特征在于，所述分子的序列為SEQID N0:25 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核苷酸分子作為PCR引物的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR的上下游引物組合分別選自1)SEQID NO :1 禾口 3 ；2)SEQID NO :2 禾口 4 ；3)SEQID NO :5 禾口 7 ；4)SEQID NO :6 禾口 8 ；5)SEQID NO 9 和 11 ；6)SEQID NO 10 和 12 ；7)SEQID NO 13 和 15 ；8)SEQID NO 14 和 16 ；9)SEQID NO 17 和 19 ；10)SEQID NO 18 和 20 ；11)SEQID NO 21 和 23 ；12)SEQID NO 22 和 24。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述PCR為巢式RT-PCR，所述反應(yīng)所需的引物組合分別選自1)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO 1和3，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO :2和4；2)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :5和7，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO :6和8 ；3)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :9和11，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO: 10和12 ；4)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :13和15，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO 14 禾口 16 ；5)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :17和19，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO 18 禾口 20 ；6)第一輪RT-PCR引物為SEQID NO :21和23，第二輪巢式PCR引物為SEQ ID NO 22 和24。
7.一種檢測(cè)布尼亞病毒的巢式RT-PCR試劑盒，所述試劑盒包括1)作為RT-PCR和巢式PCR引物的權(quán)利要求1或2所述的核苷酸分子；2)常規(guī)的RT-PCR和PCR緩沖液；3)反轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA聚合酶。
8.一種含有權(quán)利要求2所述核苷酸分子的核苷酸診斷探針?lè)肿印?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針?lè)肿?，其特征在于，所述探針?lè)肿拥暮塑账嵝蛄腥鏢EQ ID NO 26 所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針?lè)肿?，其特征在于，所述探針?lè)肿拥暮塑账嵝蛄腥鏢EQ ID NO 27 所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸分子及所述核苷酸分子在布尼亞病毒檢測(cè)中的應(yīng)用，以及一種布尼亞病毒的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明所提供的核苷酸序列及檢測(cè)方法、試劑盒可以快速、特異、敏感地檢測(cè)布尼亞病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102477426SQ201010559958
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者葉長(zhǎng)蕓, 孫強(qiáng)正, 張永振, 徐建國(guó), 李娟 , 熊衍文, 羅雪蓮 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所