專利名稱：一種利用微生物發(fā)酵法從紅豆杉中提取紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微生物發(fā)酵法從紅豆杉中提取紫杉醇的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇是從紅豆杉中分離得到的一種天然抗癌藥物，它具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作 用。由于紫杉醇的作用機(jī)理獨(dú)特、療效顯著，因此已用于肺癌、卵巢癌、乳腺癌等的臨床治 療。對(duì)于紫杉醇的高效提取成為藥品行業(yè)研究的重點(diǎn)。紫杉醇資源稀缺，價(jià)格昂貴，因此， 采取有效方法提高其收率是降低紫杉醇成本的關(guān)鍵因素。目前提取紅豆杉紫杉醇的技術(shù)主 要有酸降解、堿降解等化學(xué)法。這類方法的缺點(diǎn)是往往導(dǎo)致有效成分變性，產(chǎn)品中的有害殘 留較高且難以去除。物理法方法如超聲波、碾壓、微波、氣流粉碎等物理作用，缺點(diǎn)是有效物 質(zhì)很難提取充分。由于紅豆杉細(xì)胞組織中具有一層堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，采用常規(guī)方法難以使其 細(xì)胞充分破壁，且大量使用有機(jī)溶劑，普遍存在提取周期長(zhǎng)、收率低、產(chǎn)品含有機(jī)物污染等 缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單方便、回收率高、成本低廉的從人工種植南方紅 豆杉中提取紫杉醇的方法，主要是通過生物酶解法提取工藝，該方法對(duì)紫杉醇提取充分。這 種利用微生物發(fā)酵法提取紫杉醇，有利于破壞植物細(xì)胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時(shí) 間縮短，提取工藝簡(jiǎn)化，且提高了提取效率、降低了提取成本也不會(huì)產(chǎn)生類似化學(xué)方法所帶 來的有機(jī)物污染。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案2、一種利用微生物發(fā)酵法從紅豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于利用微生物 發(fā)酵法從紅豆杉里提取紫杉醇，具體包括以下步驟(1)將紅豆杉枝葉破碎呈粉末狀；(》LB培養(yǎng)基的配制按配方比例分別稱取下列物質(zhì)粉末狀的紅豆杉枝葉 28-31g、蛋白胨0. 5-1. 5g、酵母膏1. 5-2. 5g、瓊脂粉13-16g、NaC118_12g，放入燒杯中，加入 IOOOml蒸餾水并加熱溶解，用NaOH溶液或HCl溶液調(diào)整溶液pH至7. 0-7. 5 ；然后高溫滅 菌、擱置斜面，在溫度為下，培養(yǎng)M-48小時(shí)后，轉(zhuǎn)入3-4°C冰箱里保存?zhèn)溆茫?3)將酵母菌接種到斜面培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化處理；(4)種子培養(yǎng)基在IOOOml蒸餾水中，加入酵母膏1. 5-2. 5g、 MgS04 · 7Η200· 15-0. 25g、檸檬酸 0· 40-0. 44g、ΚΗ2Ρ042· 5-3. 5g, NH4Cl 1. 5-2. 5g、 CaCl2O. 08-0. 12g、粉末狀的紅豆杉枝葉^_32kg進(jìn)行混合作為種子培養(yǎng)基；⑶發(fā)酵培養(yǎng)基在IOOOml蒸餾水中，加入酵母膏0. 5_1.5g、 Mg804 · 7Η200· 15-0. 25g、檸檬酸 0· 40-0. 44g、KH2PO4O. 5-1. 5g、NH4Cl 5. 3-5. 5g、 CaCl2O. 08-0. 12g、粉末狀的紅豆杉枝葉38_42g、MnCl2O. 01-0. 012g混合制得發(fā)酵培養(yǎng)基；(6)種子制備取步驟C3)活化后的酵母菌適量接入到步驟(4)培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)液的溫度為30 40°C，轉(zhuǎn)速80 llOrpm，培養(yǎng)M 48小時(shí)，轉(zhuǎn) 入二代培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH為7. 5 9. 0，30 40°C培養(yǎng)5 12小時(shí)，制備二級(jí)種子，備用；(7)發(fā)酵培養(yǎng)將發(fā)酵液裝入發(fā)酵罐內(nèi)，裝載量為50-85%，將步驟(6)制備的二級(jí) 種子接入其中，接種量為10 20%，再將粉末狀的紅豆杉枝葉裝入其中，溫度30 40°C， 攪拌速率80 1 IOrpm條件下進(jìn)行發(fā)酵，控制發(fā)酵液的pH值為6 8，發(fā)酵4_7天；(8)將發(fā)酵好的發(fā)酵液通過離心分離，收集上層液體；(9)將收集的液體進(jìn)行低溫濃縮，噴霧干燥，得到高含量的紫杉醇干品。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用微生物發(fā)酵法提取紫杉醇，有利于破壞植物細(xì)胞壁，有利于紫杉醇的 浸出，使提取時(shí)間縮短，提取工藝簡(jiǎn)化，且提高了提取效率、降低了提取成本也不會(huì)產(chǎn)生類 似化學(xué)方法所帶來的有機(jī)物污染。
具體實(shí)施例方式3、一種利用微生物發(fā)酵法從紅豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于利用微生物發(fā)酵法從紅豆杉里提取紫杉醇，具體包括以下步驟(1)將紅豆杉枝葉破碎呈粉末狀；(》LB培養(yǎng)基的配制按配方比例分別稱取下列物質(zhì)粉末狀的紅豆杉枝葉 28-31g、蛋白胨0. 5-1. 5g、酵母膏1. 5-2. 5g、瓊脂粉13-16g、NaC118_12g，放入燒杯中，加入 IOOOml蒸餾水并加熱溶解，用NaOH溶液或HCl溶液調(diào)整溶液pH至7. 0-7. 5 ；然后高溫滅 菌、擱置斜面，在溫度為下，培養(yǎng)M-48小時(shí)后，轉(zhuǎn)入3-4°C冰箱里保存?zhèn)溆茫?3)將酵母菌接種到斜面培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化處理；(4)種子培養(yǎng)基在IOOOml蒸餾水中，加入酵母膏1. 5_2. 5g、 MgS04 · 7Η200· 15-0. 25g、檸檬酸 0· 40-0. 44g、ΚΗ2Ρ042· 5-3. 5g, NH4Cl 1. 5-2. 5g、 CaCl2O. 08-0. 12g、粉末狀的紅豆杉枝葉^_32kg進(jìn)行混合作為種子培養(yǎng)基；⑶發(fā)酵培養(yǎng)基在IOOOml蒸餾水中，加入酵母膏0. 5_1. 5g、 MgSO4 · 7Η200· 15-0. 25g、檸檬酸 0. 40-0· 44g、KH2PO4O. 5-1. 5g、NH4C15. 3-5. 5g、 CaCl2O. 08-0. 12g、粉末狀的紅豆杉枝葉38_42g、MnCl2O. 01-0. 012g混合制得發(fā)酵培養(yǎng)基；(6)種子制備取步驟( 活化后的酵母菌適量接入到步驟(4)培養(yǎng)的種子培養(yǎng) 基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)液的溫度為30 40°C，轉(zhuǎn)速80 llOrpm，培養(yǎng)M 48小時(shí)，轉(zhuǎn) 入二代培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH為7. 5 9. 0，30 40°C培養(yǎng)5 12小時(shí)，制備二級(jí)種子，備用；(7)發(fā)酵培養(yǎng)將發(fā)酵液裝入發(fā)酵罐內(nèi)，裝載量為50-85%，將步驟(6)制備的二級(jí) 種子接入其中，接種量為10 20%，再將粉末狀的紅豆杉枝葉裝入其中，溫度30 40°C， 攪拌速率80 1 IOrpm條件下進(jìn)行發(fā)酵，控制發(fā)酵液的pH值為6 8，發(fā)酵4_7天；(8)將發(fā)酵好的發(fā)酵液通過離心分離，收集上層液體；(9)將收集的液體進(jìn)行低溫濃縮，噴霧干燥，得到高含量的紫杉醇干品。
權(quán)利要求
1. 一種利用微生物發(fā)酵法從紅豆杉中提取紫杉醇的方法，其特征在于利用微生物發(fā)酵 法從紅豆杉里提取紫杉醇，具體包括以下步驟(1)將紅豆杉枝葉破碎呈粉末狀；(2)LB培養(yǎng)基的配制按配方比例分別稱取下列物質(zhì)粉末狀的紅豆杉枝葉^_31g、蛋 白胨0. 5-1. 5g、酵母膏1. 5-2. 5g、瓊脂粉13-16g、NaC118-12g，放入燒杯中，加入IOOOml蒸 餾水并加熱溶解，用NaOH溶液或HCl溶液調(diào)整溶液pH至7. 0-7. 5 ；然后高溫滅菌、擱置斜 面，在溫度為28-32°C下，培養(yǎng)M-48小時(shí)后，轉(zhuǎn)入3-4°C冰箱里保存?zhèn)溆茫?3)將酵母菌接種到斜面培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化處理；(4)種子培養(yǎng)基在IOOOml蒸餾水中，加入酵母膏1.5-2. 5g、MgS04 ·7H200. 15-0. 25g、 檸檬酸 0. 40-0. 44g、KH2P042. 5-3. 5g, NH4Cl 1. 5-2. 5g、CaCl2O. 08-0. 12g、粉末狀的紅豆杉 枝葉^-32kg進(jìn)行混合作為種子培養(yǎng)基；(5)發(fā)酵培養(yǎng)基在IOOOml蒸餾水中，加入酵母膏0.5-1. 5g、MgSO4 · 7H200. 15-0. 25g、 檸檬酸 0. 40-0. 44g、KH2PO4 0. 5-1. 5g、NH4Cl 5. 3-5. 5g、CaCl2O. 08-0. 12g、粉末狀的紅豆杉 枝葉38-42g、MnCl2 0. 01-0. 012g混合制得發(fā)酵培養(yǎng)基；(6)種子制備取步驟C3)活化后的酵母菌適量接入到步驟(4)培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基中 進(jìn)行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)液的溫度為30 40°C，轉(zhuǎn)速80 llOrpm，培養(yǎng)M 48小時(shí)，轉(zhuǎn)入二 代培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH為7. 5 9. 0，30 40°C培養(yǎng)5 12小時(shí)，制備二級(jí)種子，備用；(7)發(fā)酵培養(yǎng)將發(fā)酵液裝入發(fā)酵罐內(nèi)，裝載量為50-85%，將步驟(6)制備的二級(jí)種子 接入其中，接種量為10 20%，再將粉末狀的紅豆杉枝葉裝入其中，溫度30 40°C，攪拌 速率80 IlOrpm條件下進(jìn)行發(fā)酵，控制發(fā)酵液的pH值為6 8，發(fā)酵4_7天；(8)將發(fā)酵好的發(fā)酵液通過離心分離，收集上層液體；(9)將收集的液體進(jìn)行低溫濃縮，噴霧干燥，得到高含量的紫杉醇干品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用微生物發(fā)酵法從紅豆杉中提取紫杉醇的方法，首先將紅豆杉的枝葉粉碎成粉末狀，然后將用酵母菌發(fā)酵好的發(fā)酵液浸泡紅豆杉的枝葉粉末數(shù)天后，對(duì)浸泡液進(jìn)行濃縮，噴霧干燥即得到高含量的紫杉醇干品。本發(fā)明方法，紫杉醇的提取時(shí)間短，純度高，不污染環(huán)境。
文檔編號(hào)C12P17/02GK102071230SQ20101056005
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者李民生 申請(qǐng)人:李民生