專利名稱：枯草芽孢桿菌lfb112、其產(chǎn)生的細(xì)菌素及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用技術(shù)，具體涉及一種枯草芽孢桿菌新菌株、其所產(chǎn)生的細(xì) 菌素及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從19 年英國的Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素以來，抗生素為人類的疾病控制和動物保 健作出了巨大的貢獻(xiàn)，然而近年來因抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥問題越用越引起人們的關(guān)注和 憂慮。在養(yǎng)殖業(yè)上，隨著抗生素在飼料中的大規(guī)模使用，其副作用日益突出，如引起動物腸 道菌群失調(diào)，臨床上出現(xiàn)越來越多的耐藥菌株甚至超級病菌“MRSA” (耐甲氧西林金黃色葡 萄球菌)，以及畜產(chǎn)品的藥物殘留等。這些問題的出現(xiàn)不僅影響了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而且 殘留抗生素通過食物鏈的傳遞也加大了人類控制耐藥病原菌的難度。為應(yīng)對日益嚴(yán)重的耐 藥菌株及藥物殘留等問題，人們迫切需要研究開發(fā)一類安全高效的生物獸藥及生物飼料添 加劑以減少對抗生素的過分依賴。細(xì)菌素是由細(xì)菌通過核糖體途徑合成的肽類抗生素(或蛋白質(zhì))，能夠抑制與產(chǎn) 生菌相近細(xì)菌的生長。研究表明，細(xì)菌素能夠殺死(或抑制)某些致病菌及腐敗菌的生長， 而且具有PH適應(yīng)范圍廣、熱穩(wěn)定性好等特點，因而在動植物疾病防治及食品防腐等方面的 應(yīng)用潛力很大。與傳統(tǒng)抗生素相比，細(xì)菌素對病原菌作用專一性強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性且無毒 副作用無殘留，因而被認(rèn)為是抗生素的理想替代品而廣受關(guān)注?？莶菅挎邨U菌是自然界廣泛存在的一類兼性厭氧菌。長期以來該菌一直作為蛋白 質(zhì)水解酶、淀粉酶、生物活性劑、抗生素等生產(chǎn)用菌，由于具有安全無致病性的特點，被美國 食品與藥品管理局(FDA)認(rèn)定為“公認(rèn)安全”(GRAS)的菌株而推薦使用于食品和飼料中。 枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生70多種抗菌物質(zhì)，是芽孢桿菌屬中的最主要抗菌蛋白產(chǎn)生菌。近年 來，國內(nèi)外有關(guān)枯草芽孢桿菌細(xì)菌素的應(yīng)用研究很多，但主要集中于植物保護(hù)和食品防腐 劑領(lǐng)域，在醫(yī)藥獸藥及飼料添加劑方面研究應(yīng)用的報道不多。目前細(xì)菌素的應(yīng)用研究存在 以下不足1.發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌素抑菌譜不廣，僅能抑制部分革蘭氏陽性致病菌，對大腸桿菌、沙 門氏菌、綠膿桿菌等主要的革蘭氏陰性病原菌及真菌沒有抑制力，因而在實際應(yīng)用上具有 很大的局限性；2.沒有解決細(xì)菌素對臨床耐藥菌的抑制問題?？股氐哪退幮允钱?dāng)前臨床 治療面臨的最大問題，據(jù)報道美國每年死于超級耐藥菌“MRSA” (耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌)的病人多達(dá)1. 8萬，因而尋找能夠抑制耐藥菌的細(xì)菌素具有現(xiàn)實意義；3.有關(guān)的研究 僅僅停留在實驗室水平，并沒有給出具體的生產(chǎn)試驗或臨床使用的數(shù)據(jù)，因而在實際應(yīng)用 上缺乏可信的證據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種枯草芽孢桿菌株新菌株。本發(fā)明的第二個目的在于提供上述菌株在生產(chǎn)細(xì)菌素中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種由上述菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素。
本發(fā)明的第四個目的在于提供上述細(xì)菌素的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌，是枯草芽孢桿菌LFB112，該菌株已于2009年3月 30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCj-a 北京市 朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)，保藏號為 CGMCC No. 2996。本發(fā)明菌株LFB112在常溫和常規(guī)培養(yǎng)基上生長良好，在營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng) 基上菌落呈乳白色，表面粗糙，有粘性，為革蘭氏陽性菌。根據(jù)API 50CHB生化試劑盒 (bioMerieux, France)結(jié)合API Plus軟件(V3. 0)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(鑒定度為 96. 7% )，使用 ABI3730XL 自動序列儀(Applied Biosystems, USA)測定該菌株的 16SrDNA 序列測定，并與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，同源性最高的 菌株為Bacillus subtilis菌株(DQ523502)，同源性為99. 2%，因此進(jìn)一步確定該菌株為 枯草芽孢桿菌。該菌株具有較高的抑菌活性，對多株動物致病菌及食源致病菌具有抑菌作 用。 可采用常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌LFBl 12，優(yōu)選采用改良BPY (牛肉膏蛋白 胨酵母粉)培養(yǎng)基蛋白胨2%、葡萄糖1%、酵母膏1%、牛肉膏1%、食鹽0.3%、磷酸氫二 鉀0.25%，蒸餾水1000ml，pH值7.2，所述百分含量均為(W/V)；培養(yǎng)條件為37°C，120轉(zhuǎn)/ 分鐘搖床培養(yǎng)M小時。LFBl 12發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液中含有細(xì)菌素，具有良好的抑菌作用。進(jìn)而，本發(fā)明還提供一種制備細(xì)菌素的方法，其包括如下步驟1)制備發(fā)酵液發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌LFB112，得到發(fā)酵液；2)分離細(xì)菌素粗品將發(fā)酵液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后取上清液，在上清 液中慢慢加入硫酸銨固體粉末進(jìn)行鹽析，邊加邊攪拌，直至飽和度達(dá)80 %，然后在4°C下靜 置12小時，再在12000轉(zhuǎn)/分鐘4°C下離心30分鐘，棄去上清液得到細(xì)菌素沉淀粗品。3)往沉淀中加入一定體積的20mM磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6. 8)以溶解沉淀，然后 將沉淀溶液轉(zhuǎn)移至IKDa透析膜(Sigma)，4°C下對蒸餾水透析M小時。透析液用預(yù)平衡Q Sepharose FF的陰離子交換層析柱進(jìn)行純化，平衡液為pH7. 5 20mM的tris_HCl緩沖液， 洗脫液為含IMNaCl的tris-HCl緩沖液，流速3ml/min，收集活性峰，活性峰含有3種蛋白 (見圖3-b)，再進(jìn)行kphadex G-100凝膠過濾層析柱進(jìn)行純化，平衡液為pH7. 0 IOmM的硫 酸鈉緩沖液，洗脫液為150mM的NaCl溶液，固定流速0. 5ml/min,收集活性峰合并為細(xì)菌素 純品液。結(jié)果顯示細(xì)菌素洗脫曲線中存在一個活性峰，活性蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，分子量 大約為5500Da。實驗表明，枯草芽孢桿菌LFBl 12產(chǎn)生的細(xì)菌素對熱、酸穩(wěn)定，在80°C下熱處理20 分鐘活力基本不變，在100°C下處理20分鐘仍保持較高活性；在pH2 9范圍內(nèi)活性穩(wěn)定， 當(dāng)PH大于9時，活力逐步降低。胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶可使該細(xì)菌素活力降解 20%左右，而脂肪酶、α-淀粉酶不能使其活力下降。該細(xì)菌素抑菌譜廣，可抑制大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生性李 斯特菌、鏈球菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌等許多動物致病菌，還可抑制臨床分離的大腸桿菌 及沙門氏菌的耐藥株，對紅酵母、芒果炭疽病菌等真菌也有抑制力，而對乳酸桿菌、雙歧桿 菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等有益菌無抑制作用。
應(yīng)用Tricine-SDS-PAGE方法，對細(xì)菌素蛋白的透析樣品進(jìn)行電泳分析，其中一部 分凝膠用于染色以測定蛋白條帶的分子量，另一部分樣品凝膠進(jìn)行抑菌活力測定。結(jié)果顯 示，透析蛋白的抑菌作用由一小分子肽引起，其分子量大約為^OODa。抑菌作用模式研究表 明，細(xì)菌素以殺菌模式作用于敏感菌，導(dǎo)致致病菌活菌數(shù)目的顯著下降。與現(xiàn)有報道的枯草芽孢桿菌細(xì)菌素相比，LFBl 12細(xì)菌素在分子量、生理生化特性 及抑菌譜特點等方面均存在很大的區(qū)別。動物毒性試驗表明，枯草芽孢桿菌LFB112細(xì)菌素安全無毒，對實驗小鼠的內(nèi)臟、 血液生化指標(biāo)無顯著影響，健康狀態(tài)良好。致病菌攻毒試驗表明，感染大腸桿菌CVCC249的肉雞口服枯草芽孢桿菌LFB112細(xì) 菌素后，臨床癥狀明顯改善，采食量及生長速度等飼養(yǎng)指標(biāo)與空白對照組無顯著差異；試驗 飼養(yǎng)試驗結(jié)果表明，日糧添加枯草芽孢桿菌LFB112活菌后，肉雞的生長速度和飼料報酬顯 著提高。因此，枯草芽孢桿菌LFB112及其細(xì)菌素具有作為生物獸藥或飼料添加劑的應(yīng)用潛 力。本發(fā)明將為新型生物獸藥及飼料添加劑產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支持，使養(yǎng)殖業(yè) 得到良性的可持續(xù)發(fā)展。


圖1顯示的是細(xì)菌素在Q Sepharose FF陰離子交換層析柱下的洗脫曲線。圖2顯示的是細(xì)菌素在kphadex G-100凝膠層析柱下的洗脫曲線。圖3顯示的是細(xì)菌素的Tricine-SDS-PAGE分析及抑菌活力的鑒定，其中，圖a中 1為Marker，2為樣品蛋白；圖b為Q Sepharose FF層析后的活性峰中蛋白，圖c為樣品蛋 白對金黃色葡萄球菌的抑菌區(qū)。圖4顯示的是枯草芽孢桿菌LFB112所產(chǎn)細(xì)菌素的第一輪反相色譜。圖5顯示的是枯草芽孢桿菌LFB112所產(chǎn)細(xì)菌素的分子篩層析(平衡液含0. 15% 乙酸銨)。圖6顯示的是細(xì)菌素A分子量測定Tricine-SDS-PAGE膠圖，其中，a 蛋白Marker， b 細(xì)菌素A，c 膠上抑菌。圖7顯示的是細(xì)菌素C分子量測定Tricine-SDS-PAGE膠圖，其中，a 蛋白Marker， b 細(xì)菌素D，c 膠上抑菌。圖8顯示的是細(xì)菌素B分子量測定質(zhì)譜圖。圖9顯示的是細(xì)菌素C分子量測定質(zhì)譜圖。
具體實施例方式以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例中涉及到的百分號“％”，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分 比，除另有規(guī)定外，是指溶液IOOml中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在20°C時容量的比例。實施例1枯草芽孢桿菌LFBl 12的抑菌活性分析抑菌活性分析方法先在滅菌平板中倒入15mlNA(營養(yǎng)瓊脂)固體培養(yǎng)基(成分 為蛋白胨10克、牛肉膏5克、氯化鈉5克、瓊脂15克、蒸餾水1000ml，pH7. 0)制成營養(yǎng)瓊 脂平板。然后，將過夜培養(yǎng)的致病性指示菌金黃色葡萄球菌CVCC1885(中國獸醫(yī)微生物菌 株保藏中心)菌液與NA(營養(yǎng)軟瓊脂)培養(yǎng)基(含0. 75%瓊脂，w/v)混勻，使其中指示菌濃 度稀釋106CfU/ml左右，取5ml傾注于制備好的營養(yǎng)瓊脂平板中。將牛津杯輕輕放置于平板 上，將100 μ 1離心上清液加入牛津杯后4°C下靜置2小時，然后置37°C培養(yǎng)18小時觀察抑 菌圈的出現(xiàn)。按照以下方法測定細(xì)菌素的抑菌活力單位，細(xì)菌素抑菌活力的表示方法(效 價值A(chǔ)U/ml)將上述發(fā)酵上清液用pH6. 8的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行二倍連續(xù)稀釋，取樣100 μ 1 置牛津杯進(jìn)行抑菌實驗，觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為一個活力單位(IAU)，其 倒數(shù)即為原液的細(xì)菌素效價值A(chǔ)U/ml。將枯草芽孢桿菌LFB112接入改良BPY培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨20克、葡萄糖10 克、酵母膏10克、牛肉膏10克、食鹽3克、磷酸氫二鉀2. 5克，蒸餾水1000ml，pH值7. 2。在 120轉(zhuǎn)/分鐘搖床發(fā)酵M小時，取發(fā)酵液IOOOOrpm離心15分鐘，收集上清液進(jìn)行如下實 驗1、排除有機(jī)酸的干擾將上清液用4M的NaOH溶液調(diào)pH值為中性(6. 8 7. 2)， 未調(diào)PH的作為對照組，做抑菌試驗，比較PH值中和前后抑菌圈直徑的差異。2、排除上清液菌體殘留細(xì)胞的影響將離心上清液用微孔濾膜(孔徑0. 45um)的 細(xì)菌過濾器過濾除菌后進(jìn)行抑菌試驗，排除上清液中殘留菌體細(xì)胞對抑菌效果的影響。3、排除過氧化氫的干擾上清液中加入過氧化氫酶，使酶的最終濃度達(dá)到Img/ ml，攪拌后室溫下靜置1小時，再進(jìn)行抑菌實驗，比較過氧化氫酶加入前后的抑菌圈變化。4、蛋白質(zhì)的粗分離將硫酸銨粉末緩緩加入20ml離心上清液中，邊加邊攪拌，使 最終飽和度為80%，可看到有絮狀沉淀出現(xiàn)，置于4°C冰箱靜置12小時，再在12000rpm 4°C 下離心30分鐘，將沉淀復(fù)溶于aiil pH6. 8的磷酸鹽緩沖液，進(jìn)行抑菌實驗，同時以飽和硫酸 銨溶液和磷酸鹽緩沖液作為對照組。然后將剩余的復(fù)溶液裝于IKDa的透析袋中對蒸餾水 透析過夜，以除去鹽分，其中更換3次透析液后進(jìn)行抑菌實驗。上述不同處理對抑菌活力的影響結(jié)果如表1，表明發(fā)酵上清液在排除酸、過氧化 氫、殘留菌體細(xì)胞等干擾因素，并進(jìn)行了蛋白質(zhì)的初步分離后，仍然有抑菌活性，說明此抑 菌活性是由蛋白質(zhì)類物質(zhì)引起，從而判定枯草芽孢桿菌LFB112發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是細(xì)菌素。表1.不同處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)LFB112，保藏號為 CGMCCNo. 2996。
2.含有權(quán)利要求1所述菌株的飼料添加劑。
3.權(quán)利要求1所述菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為改良BPY液體培 養(yǎng)基，按重量體積比含有蛋白胨2%、葡萄糖1%、酵母膏1%、牛肉膏1%、食鹽0.3%、磷 酸氫二鉀0. 25%，蒸餾水1000ml，pH值7. 2 ；培養(yǎng)條件為37°C，120轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)M小 時。
4.由權(quán)利要求1所述菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素。
5.如權(quán)利要求4所述的細(xì)菌素，其特征在于，所述細(xì)菌素的SDS-PAGE表觀分子量為 5500Da。
6.一種生產(chǎn)細(xì)菌素的方法，包括如下步驟1)制備發(fā)酵液發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的菌株，得到發(fā)酵液；2)分離細(xì)菌素粗品將得到的發(fā)酵液離心取上清，加硫酸銨至飽和度為80%，4°C下靜 置8 16小時，離心棄去上清得到細(xì)菌素粗品；3)純化往沉淀中加入初始發(fā)酵液1/100體積的20mM磷酸鹽緩沖液以溶解沉淀，然后 將沉淀溶液轉(zhuǎn)移至IKDa透析膜，4°C下對蒸餾水透析M小時，透析液用預(yù)平衡Q Sepharose FF的陰離子交換層析柱進(jìn)行純化，平衡液為pH7. 5 20mM的tris-HCl緩沖液，洗脫液為含 IMNaCl的tris-HCl緩沖液，流速3ml/min，收集活性峰；再進(jìn)行kphadex G-100凝膠過濾 層析柱進(jìn)行純化，平衡液為PH7. 0 IOmM的硫酸鈉緩沖液，洗脫液為150mM的NaCl溶液，固 定流速0. 5ml/min,收集活性峰合并為細(xì)菌素純品液。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，其中步驟1)采用權(quán)利要求3所述的方法發(fā) 酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌LFB112。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，其中步驟幻將發(fā)酵的得到發(fā)酵液經(jīng) 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后取上清液，在上清液中慢慢加入硫酸銨固體粉末進(jìn)行鹽析，邊 加邊攪拌，直至飽和度達(dá)80%，然后在4°C下靜置12小時，再在12000轉(zhuǎn)/分鐘4°C下離心 30分鐘，棄去上清液得到細(xì)菌素粗品。
9.權(quán)利要求4或5所述的細(xì)菌素在制備生物獸藥或飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LFB112，保藏號為CGMCC No.2996。該菌株具有較高的抑菌活性，對多種動物致病菌及食源致病菌具有抑菌作用。本發(fā)明還提供了由該菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素，其對熱和酸相對穩(wěn)定，具有廣譜抑菌作用，但不抑制有益菌。實驗表明，本發(fā)明菌株LFB112，及其產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠改善雞的臨床癥狀，提高生長速度以及飼料報酬，可應(yīng)用于生物獸藥或飼料添加劑。
文檔編號C12P1/04GK102071162SQ201010560828
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者張日俊, 李桂冠, 謝建華 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)