專利名稱：制備羅漢果苷Ⅳ的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備羅漢果苷IV的方法，屬于中藥領域。
背景技術：
羅漢果主產(chǎn)于廣西，江西，廣東，也被稱作僧果，在我國有數(shù)百年的種植歷史，其在中醫(yī)中的應用可追溯到1813年。羅漢果中的葫蘆烷三萜甙類化合物，包括賽門苷I，羅漢果苷II，羅漢果苷III，羅漢果苷IIIE，羅漢果苷IV，羅漢果苷V等。其中羅漢果苷IV的含量極低，提取難度大成本高，國內(nèi)外未見有羅漢果苷IV的制備工藝的相關報道。目前，國外醫(yī)藥工作者發(fā)現(xiàn)羅漢果苷IV具有良好的治療丙肝的作用，可單獨或與其他藥物共用起到良好的治療效果。羅漢果苷IV其毒副作用小，生物利用度高，是新興的抗病毒天然植物成分，具有廣闊的市場價值。目前制約羅漢果苷IV應用的瓶頸問題是羅漢果苷IV的制備，羅漢果苷IV在羅漢果原料粉末中含量< 0. 05% (羅漢果苷V的含量為2%左右)，所以苷IV制備困難，成本高。嚴重的制約了羅漢果苷IV的開發(fā)應用。因此，如何開發(fā)出一種高效的制備羅漢果苷IV 的方法成為本領域目前迫切需要解決的技術難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種成本較低的制備羅漢果苷IV的方法。本發(fā)明制備羅漢果苷IV的方法為采用β -葡萄糖苷酶水解羅漢果苷V、羅漢果 (可以是羅漢果鮮果或羅漢果干粉)或含有羅漢果苷V的羅漢果提取物。其中，羅漢果水提取物或乙醇溶液提取物均適用于本發(fā)明。進一步的，上述的制備羅漢果苷IV的方法，優(yōu)選每kg羅漢果苷V采用證 50k 萬U β -葡萄糖苷酶水解；其中，IU是β -葡萄糖苷酶在最適PH值和溫度的條件下，Imin水解的β-葡聚糖溶液產(chǎn)生Iyg葡萄糖的酶的用量。β-葡萄糖苷酶的水解時間優(yōu)選為2 24h。其中，上述制備羅漢果苷IV的方法，其采用β-葡萄糖苷酶水解羅漢果苷V或含有羅漢果苷V的羅漢果提取物的具體步驟如下a、溶解羅漢果苷V、羅漢果或含有羅漢果苷V的羅漢果提取物加溶劑溶解，使溶液中的羅漢果苷V的濃度為0. 025 0. 300g/mL ；b、水解a步驟所得溶液中加入β-葡萄糖苷酶水解，并調節(jié)溶液的PH值和溫度使其與β -葡萄糖苷酶的酶解PH值和溫度相適應；C、分離、純化，得到羅漢果苷IV。其中，所述a步驟中的溶劑可以為常規(guī)溶劑，溶劑優(yōu)選為水或與β -葡萄糖苷酶的酶解PH值相適應的緩沖液。其中，上述a步驟酶解時，若羅漢果苷V濃度過高，會在溶液中形成分子間氫鍵，降低酶水解效率；若羅漢果苷V濃度過低，則羅漢果苷IV的產(chǎn)率較低，還會增加濃縮成本，溶液中的羅漢果苷V的濃度為0. 025 0. 300g/mL較為合適。進一步的，由于β-葡萄糖苷酶的溶解度有限，加入過多，則會造成浪費；β-葡萄糖苷酶的濃度過低，則水解效率較低，上述b步驟水解時溶液中的β -葡萄糖苷酶的濃度優(yōu)選為1. 5萬 5. 0萬U/mL (指水解時酶的初始濃度)。其中，更優(yōu)選的水解條件為水解時溶液中的羅漢果苷V濃度0. lg/mL(指水解時羅漢果苷V的初始濃度)，β -葡萄糖苷酶濃度為2. 0萬U/mL (指水解時酶的初始濃度)， 水解時間為16h。其中，由于β-葡萄糖苷酶的種類較多，不同的β-葡萄糖苷酶的最佳酶活的PH 值和溫度不同，因此，為了提高水解效率，可以調節(jié)水解溶液的PH值和溫度使其與β-葡萄糖苷酶的酶解PH值和溫度相適應，即調節(jié)至β -葡萄糖苷酶的最佳酶活的ρΗ值和溫度。其中，上述c步驟中可以采用常規(guī)的分離、純化方法，如凝膠柱層析方法、HPLC純化法等，分離、純化得到高純度的羅漢果苷IV產(chǎn)品。其中，上述的葡萄糖苷酶可以為常規(guī)的葡萄糖苷酶，可以采用市售的葡萄糖苷酶或自行制備的葡萄糖苷酶(β_葡萄糖苷酶可按常規(guī)方法制備)，考慮
到成本的因素，上述的β-葡萄糖苷酶優(yōu)選為纖維素酶、1，4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶、 半纖維素酶中至少一種。本發(fā)明方法工藝簡單，成本較低，可以將羅漢果粉末中羅漢果苷IV的含量從 < 0.05%，提高到2. 00%以上；對于羅漢果提取物(羅漢果苷V含量約為40%，羅漢果苷 IV含量約為1. 5% )，本發(fā)明方法可以將羅漢果苷IV的含量提高到20%以上。經(jīng)過分離、 純化，可以使羅漢果苷IV的純度達到98%以上。本發(fā)明方法為羅漢果苷IV的制備提供了一種新的途徑，具有廣闊的應用前景。


圖1是酶水解前后羅漢果提取物的HPLC圖，其中，圖A為酶水解前的羅漢果提取物的HPLC圖，圖B為酶水解后羅漢果提取物的HPLC圖，圖中劃圈處為羅漢果苷IV。圖2是經(jīng)純化后的羅漢果苷IV的HPLC圖(圖Α)及羅漢果苷IV標準樣品的HPLC 圖(圖B)。圖3是純化后的羅漢果苷IV的核磁圖譜(1H NMR)。圖4是純化后的羅漢果苷IV的核磁圖譜(1 NMR)。圖5是純化后的羅漢果苷IV的質譜圖。
具體實施例方式羅漢果苷V的結構如(I)所示，羅漢果苷IV的結構如(II)所示。
權利要求
1.制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于采用β-葡萄糖苷酶水解羅漢果苷V、羅漢果或含有羅漢果苷V的羅漢果提取物。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于所述的羅漢果提取物為羅漢果水提取物或乙醇溶液提取物。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于每g羅漢果苷V 采用5 50萬U的β -葡萄糖苷酶水解；其中，IU是β -葡萄糖苷酶在最適ρΗ值和溫度的條件下，Imin水解的β -葡聚糖溶液產(chǎn)生1 μ g葡萄糖的酶的用量。
4.根據(jù)權利要求1 3任一項所述的制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于β-葡萄糖苷酶的水解時間為2 Mh。
5.根據(jù)權利要求1 4任一項所述的制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于采用 β-葡萄糖苷酶水解羅漢果苷V或含有羅漢果苷V的羅漢果提取物的具體步驟如下a、溶解羅漢果苷V、羅漢果或含有羅漢果苷V的羅漢果提取物加溶劑溶解，使溶液中的羅漢果苷V的濃度為0. 025 0. 300g/mL ；b、水解a步驟所得溶液中加入β-葡萄糖苷酶水解，并調節(jié)溶液的ρΗ值和溫度使其與β -葡萄糖苷酶的酶解PH值和溫度相適應；c、分離、純化，得到羅漢果苷IV。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于所述a步驟中的溶劑為水或與β-葡萄糖苷酶的酶解PH值相適應的緩沖液。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于所述b步驟水解時溶液中的β -葡萄糖苷酶的濃度為1. 5萬 5. 0萬U/mL。
8.根據(jù)權利要求5所述的制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于水解時溶液中的羅漢果苷V濃度0. lg/mL，β -葡萄糖苷酶濃度為2. 0萬U/mL，水解時間為16h。
9.根據(jù)權利要求1 8任一項所述的制備羅漢果苷IV的方法，其特征在于所述的 β -葡萄糖苷酶為纖維素酶、1，4-β -D-葡聚糖葡糖苷水解酶、半纖維素酶中至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備羅漢果苷IV的方法，屬于中藥領域。本發(fā)明所解決的技術問題是提供了一種成本較低的制備羅漢果苷IV的方法。本發(fā)明制備羅漢果苷IV的方法為采用β-葡萄糖苷酶水解羅漢果苷V、羅漢果或含有羅漢果苷V的羅漢果提取物。本發(fā)明方法工藝簡單，成本較低，可以將羅漢果粉末中羅漢果苷IV的含量從＜0.05％，提高到1.5％以上；對于羅漢果提取物(羅漢果苷V含量約為40％，羅漢果苷IV含量約為1.5％)，本發(fā)明方法可以將羅漢果苷IV的含量提高到20％以上。經(jīng)過分離、純化，可以使羅漢果苷IV的純度達到98％以上。本發(fā)明方法為羅漢果苷IV的制備提供了一種新的途徑，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12P19/56GK102477455SQ201010561029
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權日2010年11月26日
發(fā)明者張良蕾, 胡云嶺, 謝海峰 申請人:成都普瑞法科技開發(fā)有限公司