專利名稱：一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香石竹環(huán)斑病毒(Carnation ringspot virus，CRSV)，屬于番茄叢矮病毒科中香 石竹環(huán)斑病毒屬，是一種重要的檢疫性植物病毒(《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生 物名錄》(2007))。該病毒主要在芬蘭、德國(guó)、立陶宛、波蘭、英國(guó)、前蘇聯(lián)、意大利、匈牙利、法 國(guó)、荷蘭、哥倫比亞、墨西哥、美國(guó)、澳大利亞等國(guó)發(fā)生，我國(guó)未報(bào)道。香石竹環(huán)斑病毒的自然寄主主要是香石竹，還有蘋果、李屬、西洋梨、繁縷、早熟禾 等，它們?cè)谖覈?guó)有大面積的種植。CRSV感染后導(dǎo)致香石竹花萼分裂，每株花數(shù)量減少，降低 產(chǎn)量25 %，開花后香石竹病株鮮重較低，造成花畸形，降低生產(chǎn)力。美國(guó)CRSV發(fā)病率15 %， 波蘭香石竹發(fā)病率最高者可達(dá)85%，香石竹環(huán)斑病毒的檢驗(yàn)檢疫具有較大的經(jīng)濟(jì)重要性。CRSV可隨無性繁殖材料進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，線蟲能夠傳毒，汁液、機(jī)械也可傳毒。因 此，如果進(jìn)口帶毒的無性繁殖材料，或者隨帶的土壤中有帶病毒的線蟲，都可能將該病毒傳 入我國(guó)。我國(guó)經(jīng)常從香石竹環(huán)斑病毒疫區(qū)國(guó)家引進(jìn)大量繁殖材料，CRSV可能隨之傳入我國(guó)。 該病毒又有傳毒介體線蟲，一旦傳入，難以鏟除，后患無窮。為了維護(hù)我國(guó)花卉和水果等產(chǎn) 業(yè)的健康發(fā)展、防止香石竹環(huán)斑病毒隨進(jìn)境物傳入中國(guó)并盡量減少國(guó)際貿(mào)易摩擦，開發(fā)出 準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)香石竹環(huán)斑病毒的先進(jìn)技術(shù)，意義重大。目前，關(guān)于檢測(cè)香石竹環(huán)斑病毒的方法文獻(xiàn)報(bào)道極少，主要有鑒別寄主接種法、酶 聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)等(Clack M F, Adams A N. Journal of generalvirology. 1977， 34:475-483.；陶庭典，易建平等，DAS-ELISA檢測(cè)香石竹環(huán)斑病毒[J].植物檢疫，2001， 15(4) :216-217.)。ELISA技術(shù)操作步驟繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性。未見 有采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)CRSV的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由 序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的 序列5所示DNA組成。所述試劑可由所述特異引物、特異探針甲和特異探針乙組成；所述特異探針甲的 核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。所述特異探針甲可為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述特異 探針乙可為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列6所示。所述試劑可用于制備輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑盒，它包括所述試劑。所述試劑可用于輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒。
本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)病毒 的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用 特異引物對(duì)乙進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為74bp且PCR產(chǎn)物乙為70bp，待 測(cè)病毒為候選的香石竹環(huán)斑病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表 的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列4所示DNA和序列表 的序列5所示DNA組成的引物對(duì)。本發(fā)明還保護(hù)另一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)病 毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針甲進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以待 測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和特異探針乙進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙； 根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)病毒是否為候選的香石竹環(huán)斑病毒；所述特異引物 對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物 對(duì)乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針 甲為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙為TaqMan探針，核 苷酸序列如序列表的序列6所示。如果所述擴(kuò)增曲線甲和所述擴(kuò)增曲線乙均為陽性，待測(cè) 病毒為候選的香石竹環(huán)斑病毒。所述待測(cè)病毒具體可為李痘病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯V病毒、馬鈴薯Y病毒或 香石竹環(huán)斑病毒。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有香石竹環(huán)斑病毒的方法，包括如下步 驟(1)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針甲進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò) 增曲線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和特異探針乙進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增 曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)樣本中是否含有香石竹環(huán)斑病毒；所述特 異引物對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特 異引物對(duì)乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對(duì)；所述特 異探針甲為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙為TaqMan探 針，核苷酸序列如序列表的序列6所示。如果所述擴(kuò)增曲線甲和所述擴(kuò)增曲線乙均為陽性， 待測(cè)樣本含有香石竹環(huán)斑病毒。所述TaqMan探針5’末端具體可連接有熒光報(bào)告染料FAM，3’末端具體可連接有 熒光淬滅染料TAMRA。不同的方法，靈敏度和準(zhǔn)確性差異較大，如ELISA與PCR凝膠電泳方法靈敏度相差 100倍以上，PCR凝膠電泳與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靈敏度相差也在100倍以上。即使同樣采用 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，由于引物的擴(kuò)增效率不一樣，靈敏度差異也可達(dá)到1000倍以上。在實(shí) 際檢測(cè)鑒定工作中，為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)常需要對(duì)一個(gè)結(jié)果進(jìn)行兩個(gè)以上的確認(rèn)試 驗(yàn)，不同方法檢測(cè)靈敏度不一樣，很難保證兩個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果完全一樣，這就為結(jié)果的判斷增 加了難度，特別是在檢測(cè)目標(biāo)含量極少的情況下，這種難度就會(huì)進(jìn)一步加大。若兩套方法檢 測(cè)靈敏度一樣或非常接近，這個(gè)難題就迎刃而解。實(shí)時(shí)熒光PCR(Realtime-PCR)檢測(cè)技術(shù)是國(guó)際最近十余年發(fā)展起來的高新檢測(cè) 技術(shù)，該技術(shù)將PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合起來。與目前已報(bào)道的其它檢測(cè)技術(shù)相比，該技術(shù)具有巨大的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在(a)能實(shí)時(shí)觀察PCR過程中待檢測(cè)樣品模板 DNA(或cDNA)擴(kuò)增情況，無需進(jìn)行電泳、染色和紫外檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了操作程序并縮短檢測(cè) 時(shí)間；(b)采用熒光信號(hào)放大功能，大大提高了靈敏度；(c)特異性引物與特異熒光探針雙 保險(xiǎn)結(jié)構(gòu)有效提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；(d)全封閉的操作系統(tǒng)，減少了 PCR產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 的染污和樣品間的交叉染污，有效降低和避免了假陽性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，是目前最 準(zhǔn)確、最靈敏的技術(shù)，其優(yōu)越性使之在植物檢疫中具有廣闊的應(yīng)用范圍和前景。香石竹環(huán)斑病毒(Carnation ringspot virus，CRSV)是我國(guó)重要的檢疫性有害生 物。本研究根據(jù)CRSV中移動(dòng)蛋白基因(movement protein gene)的保守序列，設(shè)計(jì)了兩套 引物探針組合物(每套引物探針組合物由上游引物、下游引物和探針組成)，建立了雙引物 探針-RT-Realtime PCR檢測(cè)CRSV的方法。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下⑴上述實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在本發(fā) 明得以全部體現(xiàn)，如準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速和能有效減少污染等；(2)兩套引物探針相互驗(yàn) 證，進(jìn)一步有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；(3)兩套引物探針的擴(kuò)增效率一致，因此對(duì)于同一個(gè) 樣品的兩次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果的能保證基本一致，從而降低了結(jié)果判斷的難度，在實(shí)際檢測(cè)工 作、科研和解決重大的國(guó)際貿(mào)易爭(zhēng)端中具有極強(qiáng)的可操作性；(4)兩套引物探針的擴(kuò)增效 率極高，檢出低限均可達(dá)0. 46fg/ μ 1植物總RNA。


圖1為特異性測(cè)定中試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為ARn，橫軸為循環(huán)數(shù)；A 為 CRSV, B 為 PPV，C 為 PVA, D 為 PVV, E 為 PVY，F(xiàn) 為 CKl, G 為 CK2。圖2為特異性測(cè)定中試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)；A 為 CRSV, B 為 PPV，C 為 PVA, D 為 PVV, E 為 PVY，F(xiàn) 為 CKl, G 為 CK2。圖3為靈敏度測(cè)定中試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù)；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所對(duì)應(yīng)的 RNA 濃度依次為 4. 6ng/μ l、460pg/μ l、46pg/μ 1、4. 6pg/ μ l,460fg/y l、46fg/y 1、4. 6fg/y 1,0. 46fg/μ 1,0. 046fg/μ 1,0. 0046fg/μ 1，K 對(duì)應(yīng) DEPC 水。圖4為靈敏度測(cè)定中試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所對(duì)應(yīng)的 RNA 濃度依次為 4. 6ng/μ l、460pg/μ l、46pg/μ 1、4. 6pg/ μ l,460fg/y l、46fg/y 1、4. 6fg/y 1,0. 46fg/μ 1,0. 046fg/μ 1,0. 0046fg/μ 1，K 對(duì)應(yīng) DEPC 水。圖5為試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比圖；縱軸為ARn,橫軸為循環(huán)數(shù)；A為試劑 甲，B為試劑乙。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)時(shí)熒光PCR基因擴(kuò)增儀為ABI PARISM 7000(美國(guó)ABI 公司)；核酸蛋白分析儀為BioPhotometer (德國(guó)印pendorf公司)；植物總RNA提取試劑盒 (商品名Ε. Ζ. N.A ，美國(guó)Omega公司產(chǎn)品，貨號(hào)R2867_01)購(gòu)自北京雙羸生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)(貨號(hào)DRR037A)、實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(Platinum 定量PCR SuperMix-UDG，貨號(hào)C11730-025)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。以下實(shí)施例中的 定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為Ct值 < 40，為陽性；Ct值彡40，為陰性。香石竹環(huán)斑病毒(Carnationringspot virus, CRSV) :ATCC 編號(hào) PV-21 ；馬鈴薯V 病毒(potato V virus, PVV) =ATCC 編號(hào) PV-754 ；李痘病毒(Plumpox virus, PPV) =ATCC 編號(hào) PVAS-709 ；馬鈴薯A 病毒(Potato Virus A, PVA) =ATCC 編號(hào) PVAS-266 ；馬鈴薯Y 病毒(potato virus Y, PVY) =ATCC 編號(hào) PV-50 ；ATCC 即美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American Type Culture Collection), http:// www, atcc. orR/0實(shí)施例1、試劑的制備一、引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)美國(guó)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中香石竹環(huán)斑病毒基因組(NC_003531)中CRSV移動(dòng)蛋 白(movement protein)基因序列保守區(qū)，分別設(shè)計(jì)兩條上游引物(CRSV1F和CRSV2F)、兩條 下游引物(CRSV1R 和 CRSV2R)和兩條 TaqMan 探針(CRSV1P 和 CRSV2P)。二、試劑的組成1、試劑甲的組成試劑甲由CRSV1F、CRSVlR和CRSVlP組成(引物和探針由上海生工合成)。CRSVlF(上游引物)5，-GGTGACAGTGTTGCACTGAACTTT-3，(序列表的序列 1)；CRSVlR(下游引物)5，-CCAGGAGTGCCGACAGAAAC-3，(序列表的序列 2)；CRSVlP (探針)5，(FAM)-TGGCACCCAACGAAAGAACTAAGTCCG-3，(TAMARA)；(核苷酸 序列為序列表的序列3，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA)。CRSVlF和CRSVlR的靶序列大小為74bp (見序列表的序列7)。2、試劑乙的組成試劑乙由CRSV2F、CRSV2R和CRSV2P組成(引物和探針由上海生工合成)。CRSV2F(上游引物)5，-TTGCCGATGTGCCCAAGTAT-3，(序列表的序列 4)；CRSV2R(下游引物)5，-GGCGTAGCCTCCTGATGATTT-3，(序列表的序列 5)；CRSV2P (探針)5，(FAM)-CGGTATCGCCCCGCCTTCG-3，(TAMARA)；(核苷酸序列為序 列表的序列6，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA)。 CRSV2F和CRSV2R的靶序列大小為70bp (見序列表的序列8)。實(shí)施例2、試劑的應(yīng)用分別取感染五種病毒(CRSV、PVA、PVV、PVY和PPV)的香石竹葉片，取健康香石竹 葉片作為對(duì)照，應(yīng)用實(shí)施例1制備的試劑甲和試劑乙分別進(jìn)行特異性測(cè)定、靈敏度測(cè)定，并 進(jìn)行試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比。一、試劑的特異性測(cè)定1、總RNA提取及質(zhì)量控制用植物總RNA提取試劑盒從感染每種病毒的葉片(5種)和健康葉片(CKl)中分 別提取總RNA。用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度與純度值，并以此控制核酸質(zhì)量。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將步驟1從6種葉片中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ； DEPC水作為總RNA的對(duì)照(CK2)。S. M W M (25 μ L) 5 μ L PrimerScript Buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 總 RNA,力口 DEPC 水至 25 μ L。反應(yīng)條件37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的特異性用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。試齊[J甲的反應(yīng)體系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, CRSVlF (15 μ Μ) 1 μ 1, CRSVlR (15 μ Μ) 1 μ 1, CRSVlP (10 μ Μ) 1 μ 1, cDNA 2. 0 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水 至25μ1。每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試齊[J乙的反應(yīng)體系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, CRSV2F(15yM)ly 1, CRSV2R(15 μ Μ) 1 μ 1, CRSV2P (10 μ Μ) 1 μ 1, cDNA 2. 0 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水 至25μ1。每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PARISM 7000的96孔板中進(jìn)行；循環(huán)條件 為50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 個(gè)循環(huán)。采用試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖1。采用試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖2。 應(yīng)用試劑甲只有在CRSV中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(Ct值=14)，判為陽性；應(yīng)用試劑乙只有在CRSV 中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(Ct值=15)。PPV、PVA、PVV、PVY、CKl和CK2均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，判為陰 性。結(jié)果表明，試劑甲(或試劑乙)的特異性很好，結(jié)果與預(yù)計(jì)相符。二、試劑的靈敏度測(cè)定1、總RNA提取和各個(gè)稀釋液的制備用植物總RNA提取試劑盒從感染CRSV的葉片中提取總RNA，用核酸蛋白分析 儀BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度和純度值。濃度值為46ng/ μ 1，純度值為 0D260/280 = 2. 20, 0D260/230 = 2. 38。用DEPC水將提取的總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到各個(gè)稀釋液。各個(gè)稀釋液 中，RNA 濃度分另Ij 為 4. 6ng/y l、460pg/y l、46pg/y 1、4· 6pg/y l、460fg/y l、46fg/y 1、 4. 6fg/y 1,0. 46f g/ μ 1,0. 046f g/ μ 1,0. 0046f g/ μ 1。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將各個(gè)稀釋液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的 對(duì)照。S. M W M (25 μ L) 5 μ L PrimerScriρt Buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 稀釋液，加 DEPC 水至 25 μ L。反應(yīng)條件37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的靈敏度
用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。試齊[J甲的反應(yīng)體系(25yL) =PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, CRSVlF (15 μ Μ) 1 μ 1, CRSVlR (15 μ Μ) 1 μ 1, CRSVlP (10 μ Μ) 1 μ 1, cDNA 2. 0 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水 至25μ1。每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試齊[J乙的反應(yīng)體系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, CRSV2F(15yM)ly 1, CRSV2R(15 μ Μ) 1 μ 1, CRSV2P (10 μ Μ) 1 μ 1, cDNA 2. 0 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水 至25μ1。每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PARISM 7000的96孔板中進(jìn)行；循環(huán)條件 為50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 個(gè)循環(huán)。采用試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖3。采用試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖4。 應(yīng)用試劑甲可以判為陽性的最低稀釋度為0. 46fg/yl植物總RNA(Ct值=35)；應(yīng)用試劑 乙可以判為陽性的最低稀釋度為0. 46fg/yl植物總RNA(Ct值=36)。結(jié)果表明，應(yīng)用試劑 甲(或試劑乙)檢測(cè)的靈敏度可達(dá)10_8，即0. 46fg/ μ 1植物總RNA0 三、試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比1、總 RNA 提取用植物總RNA提取試劑盒從感染CRSV的葉片中提取總RNA。用核酸蛋白分析儀 BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度和純度值。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對(duì)照。反應(yīng)體系同步驟一的2。3、試劑的靈敏度用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。方法同步驟一的3。實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖5。采用試劑甲的Ct值=13 ；采用試劑乙的Ct值=13。 結(jié)果表明，試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率幾乎完全一樣。
權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序 列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示 DNA組成。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于所述試劑由所述特異引物、特異探針甲和特 異探針乙組成；所述特異探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙的 核苷酸序列如序列表的序列6所示。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于所述特異探針甲為TaqMan探針；所述特異 探針乙為TaqMan探針。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在制備輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑。
6.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒中的應(yīng)用。
7.一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)病毒的cDNA為模板， 用特異引物對(duì)甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙進(jìn) 行PCR，得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為74bp且PCR產(chǎn)物乙為70bp，待測(cè)病毒為候選的 香石竹環(huán)斑病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA 組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA 組成的引物對(duì)。
8.一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)病毒的cDNA為模板， 用特異引物對(duì)甲和特異探針甲進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以待測(cè)病毒的cDNA為 模板，用特異引物對(duì)乙和特異探針乙進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲 和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)病毒是否為候選的香石竹環(huán)斑病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的 序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的 序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針甲為TaqMan探 針，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙為TaqMan探針，核苷酸序列如序列 表的序列6所示。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待測(cè)病毒為李痘病毒、馬鈴薯A病 毒、馬鈴薯V病毒、馬鈴薯Y病毒或香石竹環(huán)斑病毒。
10.一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有香石竹環(huán)斑病毒的方法，包括如下步驟(1)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為CDNA；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針甲進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲 線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和特異探針乙進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線 乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)樣本中是否含有香石竹環(huán)斑病毒；所述特異引 物對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引 物對(duì)乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探 針甲為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙為TaqMan探針， 核苷酸序列如序列表的序列6所示。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定香石竹環(huán)斑病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑包括序列表的序列1、序列2、序列4和序列5所示DNA組成的特異引物。所述試劑還可包括序列3所示探針甲和序列6所示探針乙。香石竹環(huán)斑病毒是我國(guó)重要的檢疫性有害生物，本發(fā)明提供了兩套PCR引物探針組合物，建立了雙引物探針-RT-Realtime PCR檢測(cè)香石竹環(huán)斑病毒的方法。該方法采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，有效地提高了檢測(cè)的靈敏度；兩套擴(kuò)增效率一致的引物探針組合物相互驗(yàn)證確認(rèn)，有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)際檢測(cè)中具有較強(qiáng)的可操作性。本方法準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速，檢出低限均可達(dá)0.46fg/μl植物總RNA。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102002534SQ20101056113
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者朱水芳, 李曉玉, 楊益娥, 王真, 粟智平, 耿金培, 陳洪俊 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心