專利名稱：一種輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
藜草花葉病毒(Sowbane mosaic virus，SoMV)，屬于南方菜豆花葉病毒成員。該 病毒分布在世界近30個(gè)國家和地區(qū)，包括澳洲、北美、南美、南非、澳大利亞、保加利亞、加 拿大、前捷克斯洛伐克、意大利、日本、前南斯拉夫、奧地利、波蘭、瑞士、德國、比利時(shí)、荷蘭、 英國、愛爾蘭、法國、希臘、葡萄牙、西班牙、羅馬尼亞、匈牙利、阿爾巴尼亞、土耳其、摩洛 哥。該病毒在中國無報(bào)道，是我國進(jìn)境重要的檢疫性病毒種類之一(《中華人民共和國進(jìn) 境植物檢疫性有害生物名錄》(2007年最新版).)。藜草花葉病毒的自然寄主較多，如蘋 果、葡萄、櫻桃、香石竹、菊花等，這些寄主植物在我國都有大面積的種植，我國的氣候條件 也與世界上該病毒的許多疫區(qū)的氣候條件相似，因此該病毒一旦傳入我國，可導(dǎo)致嚴(yán)重危 害。該病毒可被多種植物的種子傳播昆諾阿藜(Chenopodium aqinoa)種傳率60%以上； 墻生藜(Chenopodiummurale)種傳率20-70%。病株子代幼苗感染率高達(dá)83% ；莧色藜 (Chenopodiumamaranticlolor)種傳率34-62%?；ǚ邸⑹芮秩镜闹参镆部蓚鞑ゲ《?。我國 每年都有大量的種子、苗木進(jìn)入，因此該病毒具有較高的傳入可能性。近年來，每年從國外輸入中國的葡萄等種子、苗木數(shù)量較大，其中可能攜帶有 SoMV。由于我國藜草花葉病毒的寄主植物種類多、種植面積大，該病毒一旦傳入我國，將對(duì) 我國的葡萄、蘋果等產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重影響。進(jìn)境種子、苗木中植物病毒的檢測(cè)是我國檢驗(yàn)檢疫 系統(tǒng)的重點(diǎn)，也是難點(diǎn)，尤其是木本植物中病毒的檢測(cè)，由于它們?cè)谥仓牦w內(nèi)含量低、分布 不均，且時(shí)有復(fù)合侵染等特殊性，傳統(tǒng)的方法，極易出現(xiàn)漏檢和誤檢。為了維護(hù)葡萄、蘋果等 產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，防止藜草花葉病毒隨種子、苗木傳入中國，開發(fā)出快速、靈敏檢測(cè)該病毒的 先進(jìn)的技術(shù)，意義重大。為了保障我國蘋果、葡萄等產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，開發(fā)先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)， 防止藜草花葉病毒傳入我國具有重要意義。目前，檢測(cè)藜草花葉病毒主要以電鏡技術(shù)(Kerlan C，Mille B, DunezJ. Immunosorbent electron ；microscopy for detecting apple chlorotic leaf spotand plum pox viruses. Phytopathology, 1981, 71 :400 404.)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 為主(Cambra Μ, Asensio Μ, Gorris M Τ, et al. Detection of plum poxpotyvirlls using monoclonalantibodies to structural and non-structuralproteins. Blletin OEPP/ ΕΡΡ0,1994，24 :569_577.)。電鏡技術(shù)設(shè)備昂貴，檢測(cè)靈敏度低；ELISA技術(shù)操作步驟繁瑣、 檢測(cè)周期長、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性。未見有采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)SoMV的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序 列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。
所述試劑可由所述特異引物和特異探針組成；所述特異探針的核苷酸序列如序列 表的序列4所示。所述特異探針可為TaqMan探針。所述試劑可用于制備輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑盒，包括所述試劑。所述試劑可用于輔助鑒定藜草花葉病毒。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定藜草花葉病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)病毒的 cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特 異引物對(duì)乙進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為78bp且PCR產(chǎn)物乙為97bp，待測(cè) 病毒為候選的藜草花葉病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序 列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序 列3所示DNA組成的引物對(duì)。本發(fā)明還保護(hù)另一種輔助鑒定藜草花葉病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)病毒 的cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以待測(cè) 病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙； 根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)病毒是否為候選的藜草花葉病毒；所述特異引物對(duì) 甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì) 乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針為 TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴(kuò)增曲線甲和所述擴(kuò)增曲線乙 均為陽性，待測(cè)病毒為候選的藜草花葉病毒。所述待測(cè)病毒具體可為藜草花葉病毒、番茄黑環(huán)病毒、草莓潛環(huán)斑病毒、番茄叢矮 病毒或桃叢簇花葉病毒。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有藜草花葉病毒的方法，包括如下步 驟(1)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增 曲線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增 曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)樣本中是否含有藜草花葉病毒；所述特異 引物對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異 引物對(duì)乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異 探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴(kuò)增曲線甲和所述擴(kuò)增 曲線乙均為陽性，待測(cè)樣本含有藜草花葉病毒。所述TaqMan探針5’末端具體可連接有熒光報(bào)告染料FAM，3’末端具體可連接有 熒光淬滅染料TAMRA。不同的方法，靈敏度和準(zhǔn)確性差異較大，如ELISA與PCR凝膠電泳方法靈敏度相差 100倍以上，PCR凝膠電泳與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靈敏度相差也在100倍以上。即使同樣采用 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，由于引物的擴(kuò)增效率不一樣，靈敏度差異也可達(dá)到1000倍以上。在實(shí) 際檢測(cè)鑒定工作中，為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)常需要對(duì)一個(gè)結(jié)果進(jìn)行兩個(gè)以上的確認(rèn)試 驗(yàn)，不同方法檢測(cè)靈敏度不一樣，很難保證兩個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果完全一樣，這就為結(jié)果的判斷增 加了難度，特別是在檢測(cè)目標(biāo)含量極少的情況下，這種難度就會(huì)進(jìn)一步加大。若兩套方法檢測(cè)靈敏度一樣或非常接近，這個(gè)難題就迎刃而解。實(shí)時(shí)熒光PCR(Realtime-PCR)檢測(cè)技術(shù)是國際最近十余年發(fā)展起來的高新檢測(cè) 技術(shù)，該技術(shù)將PCR擴(kuò)增與熒光檢測(cè)系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合起來。與目前已報(bào)道的其它檢測(cè)技術(shù) 相比，該技術(shù)具有巨大的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在(a)能實(shí)時(shí)觀察PCR過程中待檢測(cè)樣品模板 DNA(或eDNA)擴(kuò)增情況，無需進(jìn)行電泳、染色和紫外檢測(cè)，大大簡化了操作程序并縮短檢測(cè) 時(shí)間；(b)采用熒光信號(hào)放大功能，大大提高了靈敏度；(c)特異性引物與特異熒光探針雙 保險(xiǎn)結(jié)構(gòu)有效提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；(d)全封閉的操作系統(tǒng)，減少了 PCR產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 的染污和樣品間的交叉染污，有效降低和避免了假陽性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，是目前最 準(zhǔn)確、最靈敏的技術(shù)，其優(yōu)越性使之在植物檢疫中具有廣闊的應(yīng)用范圍和前景。藜草花葉病毒(Sowbane mosaic virus, SoMV)是我國重要的檢疫性有害生物。本 研究根據(jù)SoMV中多聚蛋白基因(polyprotein gene)的保守序列，設(shè)計(jì)了三條巢式PCR引 物和一條TaqMan探針，建立了半巢式-RT-Realtime PCR檢測(cè)SoMV的方法。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下⑴上述實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在本發(fā)明 得以全部體現(xiàn)，如準(zhǔn)確、靈敏、簡便、快速和能有效減少污染等；(2)設(shè)計(jì)上非常巧妙地將巢 式PCR的原理運(yùn)用到實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中，并與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合；(3)在實(shí)時(shí)熒 光PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上僅增加一條引物，就形成兩套獨(dú)立的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)系統(tǒng)；(4)兩套 引物探針相互驗(yàn)證，進(jìn)一步有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；(5)兩套引物探針的擴(kuò)增效率一致， 因此對(duì)于同一個(gè)樣品的兩次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果的能保證基本一致，從而降低了結(jié)果判斷的難 度，在實(shí)際檢測(cè)工作、科研和解決重大的國際貿(mào)易爭端中具有極強(qiáng)的可操作性；(6)兩套引 物探針的擴(kuò)增效率極高，檢出低限均可達(dá)0. 4fg/yl植物總RNA。


圖1為特異性測(cè)定中試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為ARn，橫軸為循環(huán)數(shù)；A 為 SoMV，B 為 TBRV，C 為 SLRSV，D 為 TBSV，E 為 PRMV，F(xiàn) 為 CK1，G 為 CK2。圖2為特異性測(cè)定中試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；；縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)； A 為 SoMV，B 為 TBRV，C 為 SLRSV，D 為 TBSV，E 為 PRMV，F(xiàn) 為 CK1，G 為 CK2。圖3為靈敏度測(cè)定中試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù)；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所對(duì)應(yīng)的 RNA 濃度依次為 4ng/μ l、400pg/μ l、40pg/μ l、4pg/μ 1、 400fg/ μ 1、40fg/ μ 1、4fg/ μ 1,0. 4fg/ μ 1,0. 04fg/ μ 1,0. 004fg/ μ 1，K 對(duì)應(yīng) DEPC 水。圖4為靈敏度測(cè)定中試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所對(duì)應(yīng)的 RNA 濃度依次為 4ng/μ l、400pg/μ l、40pg/μ l、4pg/μ 1、 400fg/ μ 1、40fg/ μ 1、4fg/ μ 1,0. 4fg/ μ 1,0. 04fg/ μ 1,0. 004fg/ μ 1，K 對(duì)應(yīng) DEPC 水。圖5為試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比圖；縱軸為ARn,橫軸為循環(huán)數(shù)；A為試劑 甲，B為試劑乙。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實(shí)時(shí)熒光PCR基因擴(kuò)增儀為ABI PRISM 7000(美國ABI公司)；核酸蛋白分析儀為BioPhotometer (德國印pendorf公司)；植物總RNA提取試劑盒 (商品名Ε. Ζ. N.A ，美國Omega公司產(chǎn)品，貨號(hào)R2867_01)購自北京雙羸生物公司；反轉(zhuǎn)錄 試劑盒購自大連寶生物公司(TaKaRa)(貨號(hào)DRR037A)、實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(Platinum 定量PCR SuperMix-UDG，貨號(hào)C11730-025)購自美國Invitrogen公司。以下實(shí)施例中的 定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為Ct值 < 40，為陽性；Ct值≥40，為陰性。藜草花葉病毒(sowbanemosaic virus, SoMV) :ATCC 編號(hào) PV-109 ；番茄黑環(huán)病毒(TBRV)購自英國安德珍公司；胃(strawberry latent ringspot virus, SLRSV) :ATCC PV-1069 ；番茄叢矮病毒(Tomatobushy stunt virus, TBSV) :ATCC 編號(hào) PV-483 ；桃叢簇花葉病毒(Peachrosette mosaic virus, PRMV) :ATCC 編號(hào) PV-398 ；ATCC 即美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American Type Culture Collection) , http:// www, atcc. orR/0實(shí)施例1、試劑的制備一、引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)美國NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中藜草花葉病毒基因組中多聚蛋白質(zhì)基因 (polyprotein gene) (DQ450973)序列保守區(qū)，分別設(shè)計(jì)一條上游引物(SoMVF)、兩條下游引 物(SoMVRl 和 SoMVR2)和一條 Taqmam 探針(SoMVP)。二、試劑的組成1、試劑甲的組成試劑甲由SoMVF、SoMVRl和SoMVP組成(引物和探針由上海生工合成)。SoMVF(上游引物)5，-CCGATGGAACACTTATTCAACAGT-3，(序列表的序列 1)；SoMVRl (下游引物)5，-TGGAGTTGGTGGAGGAAGTACA-3，(序列表的序列 2)；SoMVP (探針)5，(FAM)-TCGCCGGGTGTTATGAAGTCAGGATC-3，(TAMARA)；(核苷酸序 列為序列表的序列4，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA)。SoMVF和SoMVRl的靶序列大小為78bp (見序列表的序列5)。2、試劑乙的組成試劑乙由SoMVF、SoMVR2和SoMVP組成(引物和探針由上海生工合成)。SoMVF(上游引物)5，-CCGATGGAACACTTATTCAACAGT-3，(序列表的序列 1)；SoMVR2(下游引物)5，-GCCATAAGGCAGCGGACTC-3，(序列表的序列 3)；SoMVP (探針)5，(FAM)-TCGCCGGGTGTTATGAAGTCAGGATC-3，(TAMARA)；(核苷酸序 列為序列表的序列4，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA)。SoMVF和SoMVR2的靶序列大小為97bp (見序列表的序列6)。實(shí)施例2、試劑的應(yīng)用分別取感染五種病毒(SoMV、TBRV、SLRSV、TBSV和PRMV)的葡萄葉片，取健康葡萄 葉片作為對(duì)照，應(yīng)用實(shí)施例1制備的試劑甲和試劑乙分別進(jìn)行特異性測(cè)定、靈敏度測(cè)定，并 進(jìn)行試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比。一、試劑的特異性測(cè)定
1、總RNA提取及質(zhì)量控制用植物總RNA提取試劑盒從感染每種病毒的葉片(5種)和健康葉片(CKl)中分 別提取總RNA。用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度與純度值，并以 此控制核酸質(zhì)量。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將步驟1從6種葉片中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ； DEPC水作為總RNA的對(duì)照(CK2)。反應(yīng)體系(25μ L) 5 μ L PrimerScript Buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 總 RNA,力口 DEPC 水至 25 μ L。反應(yīng)條件37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的特異性用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。試齊[J甲的反應(yīng)體系(25yL) =PCR buffer (2 Χ) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, SoMVF (15 μ Μ) 1 μ 1, SoMVRl (15 μ Μ) 1 μ 1, SoMVP (10 μ Μ) 1 μ 1, cDNA 2. O μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至 25 μ 1。每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試齊[J乙的反應(yīng)體系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, SoMVF(15 μ Μ) 1 μ l,SoMVR2(15yM)ly 1, SoMVP (10 μ Μ) 1 μ 1, cDNA 2. O μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至 25 μ 1。每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PRISM 7000的96孔板中進(jìn)行；循環(huán)條件為 50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 個(gè)循環(huán)。采用試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖1。采用試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖2。 應(yīng)用試劑甲只有在SoMV中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(Ct值=18)，判為陽性；應(yīng)用試劑乙只有在SoMV 中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(Ct值=18)。TBRV、SLRSV、TBSV、PRMV、CKl和CK2均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，判 為陰性。結(jié)果表明，試劑甲(或試劑乙)的特異性很好，結(jié)果與預(yù)計(jì)相符。二、試劑的靈敏度測(cè)定1、總RNA提取和各個(gè)稀釋液的制備用植物總RNA提取試劑盒從感染CRSV的葉片中提取總RNA，用核酸蛋白分析 儀BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度和純度值。濃度值為40ng/ μ 1，純度值為 0D260/280 = 2. 16，0D260/230 = 2. 33。用DEPC水將提取的總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到各個(gè)稀釋液。各個(gè)稀釋液中， RNA 濃度分別為 4ng/ μ 1、400pg/ μ 1、40pg/ μ 1、4pg/ μ 1、400fg/ μ 1、40fg/ μ 1、4fg/ μ 1、 0. 4fg/y 1、0· 04fg/ μ 1、0· 004fg/ μ 1。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將各個(gè)稀釋液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的 對(duì)照。反應(yīng)體系(25μ L) 5 μ L PrimerScriρt Buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6mers (100 μ M)，2 μ L 稀釋液，加 DEPC 水至 25 μ L。反應(yīng)條件37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的靈敏度用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。試齊[J甲的反應(yīng)體系(25yL) =PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, SoMVF (15 μ Μ) 1 μ 1, SoMVRl (15 μ Μ) 1 μ 1, SoMVP (10 μ Μ) 1 μ 1, cDNA 2. O μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至 25 μ 1。每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試齊[J乙的反應(yīng)體系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, SoMVF(15 μ Μ) 1 μ l,SoMVR2(15yM)ly 1, SoMVP (10 μ Μ) 1 μ 1, cDNA 2. O μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至 25 μ 1。每個(gè)cDNA設(shè)置2個(gè)重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PRISM 7000的96孔板中進(jìn)行；循環(huán)條件為 50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 個(gè)循環(huán)。采用試劑甲的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖3。采用試劑乙的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖4。 應(yīng)用試劑甲可以判為陽性的最低稀釋度為0. 4fg/yl植物總RNA(Ct值=36)；應(yīng)用試劑乙 可以判為陽性的最低稀釋度為0. 4fg/yl植物總RNA(Ct值=37)。結(jié)果表明，應(yīng)用試劑甲 (或試劑乙)檢測(cè)的靈敏度可達(dá)10_8，即0. 4fg/ μ 1植物總RNA0三、試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率對(duì)比1、總 RNA 提取用植物總RNA提取試劑盒從感染SoMV的葉片中提取總RNA。用核酸蛋白分析儀 BioPhotometer測(cè)定其OD值，得出其濃度和純度值。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對(duì)照。反應(yīng)體系同步驟一的2。3、試劑的靈敏度用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和實(shí)施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。方法同步驟一的3。實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖5。采用試劑甲的Ct值=15 ；采用試劑乙的Ct值=15。 結(jié)果表明，試劑甲和試劑乙的擴(kuò)增效率幾乎完全一樣。
權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列 1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于所述試劑由所述特異引物和特異探針組成； 所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于所述特異探針為TaqMan探針。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在制備輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑。
6.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在輔助鑒定藜草花葉病毒中的應(yīng)用。
7.一種輔助鑒定藜草花葉病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用 特異引物對(duì)甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙進(jìn)行 PCR,得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為78bp且PCR產(chǎn)物乙為97bp，待測(cè)病毒為候選的藜 草花葉病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組 成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組 成的引物對(duì)。
8.一種輔助鑒定藜草花葉病毒的方法，包括如下步驟以待測(cè)病毒的cDNA為模板，用 特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線甲；以待測(cè)病毒的cDNA為模板， 用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和 擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)病毒是否為候選的藜草花葉病毒；所述特異引物對(duì)甲為序列表的序列 1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物對(duì)乙為序列表的序列1 所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸 序列如序列表的序列4所示。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待測(cè)病毒為藜草花葉病毒、番茄黑 環(huán)病毒、草莓潛環(huán)斑病毒、番茄叢矮病毒或桃叢簇花葉病毒。
10.一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有藜草花葉病毒的方法，包括如下步驟(1)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為CDNA；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)甲和特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線 甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對(duì)乙和所述特異探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到擴(kuò)增曲線 乙；根據(jù)擴(kuò)增曲線甲和擴(kuò)增曲線乙判斷待測(cè)樣本中是否含有藜草花葉病毒；所述特異引物 對(duì)甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異引物 對(duì)乙為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異探針 為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列4所示。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定藜草花葉病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑包括由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的特異引物。所述試劑還可包括核苷酸序列如序列表的序列4所示的特異探針。藜草花葉病毒是我國重要的檢疫性有害生物，本發(fā)明中利用三條巢式PCR引物和一條TaqMan探針，建立了半巢式-RT-Realtime PCR檢測(cè)SoMV的方法。該方法有機(jī)地結(jié)合了巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)；三條引物和一條探針形成的兩套PCR體系相互驗(yàn)證，有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有效提高了檢測(cè)的靈敏度。本方法準(zhǔn)確、靈敏、簡便、快速，檢出低限均可達(dá)0.4fg/μl植物總RNA。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102002537SQ201010561149
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者方紹慶, 楊益娥, 王真, 粟智平, 繆玉剛, 耿金培, 邵立洪 申請(qǐng)人:煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心