專利名稱：一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙的重要病原體之一，主 要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱子等特征，此外PPV還與非化膿性心肌炎、 皮炎、腸炎及病毒血癥等有關，PPV能加重豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)引起的 斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)。近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，大型集約化豬場的相繼出 現(xiàn)，該病的發(fā)生呈上升趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。1966年Mary和Mahnel首次于豬瘟病毒組織中分離到該病毒并證實了其病原作 用。此后在歐、美、亞、非及大洋洲很多國家均有報道。我國于1982年由中國獸藥監(jiān)察所分 離到該病毒，此后在上海、黑龍江、吉林、四川、浙江等地均分離到該病毒，雖然各地分離的 PPV來源不同，名稱各異，但均為同一型，血清學上無差別。隨著研究的深入，國內(nèi)外眾多的 科研工作者已從多方面對此病毒進行了不同層次的研究。目前，PPV的診斷方法主要有病原學診斷方法、血清學診斷方法、分子生物學診 斷方法。病原學診斷方法是PPV最確切的一種實驗室診斷方法，但從流產(chǎn)胎兒組織接種細 胞分離病原操作復雜、耗時耗力。血清學診斷方法主要包括血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗 (HI)、血清中和試驗(SN)、間接熒光抗體試驗(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗作(ELLISA)。血 清學試驗相對簡單，但是其靈敏性較低，易出現(xiàn)非特異反應，在感染初期，由于低水平抗體 效價的影響，尤其是對隱性感染動物往往漏檢，從而造成了本病的流行和蔓延。分子生物學 診斷方法主要是各種PCR技術(shù)和核酸探針雜交，這些方法具有高特異性和高靈敏度，引物 與探針可以大量合成并長期保存，檢測速度快、結(jié)果可靠，避免散毒等優(yōu)點，在畜禽傳染病 的檢測、鑒別診斷方面已得到了廣泛應用。但PCR技術(shù)也存在其缺陷，最主要的問題是成本 較高，技術(shù)性較強，操作煩瑣，設備昂貴，樣品檢測費用較高，故不適合于基層診斷和大規(guī)模 流行病學調(diào)查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用。本發(fā)明提供的試劑盒 基于環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)，可以快速 檢測豬細小病毒。本發(fā)明提供了檢測豬細小病毒的專用引物，由以下三對環(huán)介導等溫擴增所用引物 組成；一對引物是與豬細小病毒的基因組DNA (GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對，一對引物是與豬細小病毒的基因組DNA (GenBankAccession Number NC-001718)中NSl基因結(jié)合的外側(cè)引物對，一對引物是與豬細小病毒的基因組 DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl 基因結(jié)合的環(huán)形引物對。NSl 基因為 PPV全基因組中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1的基因，如GenBank AccessionNumber NC-001718中自5，末端第292至2280位核苷酸所示。所述專用引物的靶序列具體可為豬細小病毒的基因組DNA (GenBank AccessionNumber NC-001718)中NSl基因的部分區(qū)域，該部分區(qū)域的核苷酸序列如序列表 的序列1所示。所述內(nèi)側(cè)引物對由上游引物FIP和下游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷 酸序列具體可為序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具體可為序列表中的 序列5 ；所述外側(cè)引物對由上游引物F3和下游引物B3組成，所述上游引物F3的核苷酸序 列具體可為序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具體可為序列表中的序列3 ； 所述環(huán)形引物對由上游引物LF和下游引物LB組成，所述上游引物LF的核苷酸序列具體可 為序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具體可為序列表中的序列7。F3 :5，-CAAGCAACAATGGCTAGCTATATG-3，(序列表的序列 2)；B3 5' -GTTGGTGTTGTTGGCTCGC-3‘(序列表的序列 3)；FIP :5，-GTATTTATTGGGGTTTGCATTTTTTTATCATTGGGGAAATGTACCTGAT-3，(序列表的 序列4)；BIP 5，-ACATCAGTGAAAACTTCGCCAGCTTTTGCTAAATCCAGGTCCTCCTGT-3，(序列表的 序列5)；LF :5，-GCTCCTCCCATTTTTCTGAC-3，(序列表的序列 6)；LB :5，-ACAACAACTACGCAGCAACTC-3，(序列表的序列 7)。應用所述專用引物檢測豬細小病毒的原理如下根據(jù)豬細小病毒的基因組DNA (GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl 基 因的部分區(qū)域(GenBank Accession Number NC-001718 自 5’末端第 1918-2144 位核苷酸； 序列表的序列1)設計一組用于環(huán)介導等溫擴增的引物，即內(nèi)側(cè)引物對(內(nèi)側(cè)上游引物FIP 和內(nèi)側(cè)下游引物BIP)、外側(cè)引物對(外側(cè)上游引物F3和外側(cè)下游引物B3)和環(huán)形引物對 (環(huán)形上游引物LF和環(huán)形下游引物LB)。三對引物和所述區(qū)域變異區(qū)域的八個特定區(qū)域的 序列完全配對(見表1)，可以確保反應的徹底進行，也保證了檢測方法的特異性。表1專用引物與豬細小病毒的基因組DNA的結(jié)合區(qū)域
權(quán)利要求
1.一種檢測豬細小病毒的專用引物，由以下三對環(huán)介導等溫擴增所用引物組成；一對 引物是與豬細小病毒的基因組DNA中NSl基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對，一對引物是與豬細小病 毒的基因組DNA中NSl基因結(jié)合的外側(cè)引物對，一對引物是與豬細小病毒的基因組DNA中 NSl基因結(jié)合的環(huán)形引物對；所述NSl基因如GenBank Accession NumberNC-OO 1718中自 5，末端第292至2280位核苷酸所示。
2.如權(quán)利要求1所述的專用引物，其特征在于所述內(nèi)側(cè)引物對由上游引物FIP和下 游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下游引物BIP 的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對由上游引物F3和下游引物B3組成，所 述上游引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列是序列表 中的序列3 ；所述環(huán)形引物對由上游引物LF和下游引物LB組成，所述上游引物LF的核苷 酸序列是序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列是序列表中的序列7。
3.權(quán)利要求1或2所述的專用引物在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒用于檢測待測 樣本中是否含有豬細小病毒和/或輔助鑒定豬細小病毒。
4.一種含有權(quán)利要求1或2所述的專用引物的試劑盒；所述試劑盒用于檢測待測樣本 中是否含有豬細小病毒和/或輔助鑒定豬細小病毒。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括溶液B；所述溶液B由溶 劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下所述上游引物F3為2. 4-3. 6pmol/ μ 1，所述下游引物Β3為2. 4-3. 6pmol/μ 1，所述上游引物FIP為20-28pmol/μ 1，所述下 游引物BIP為20-28pmol/ μ 1，所述上游引物LF為IO-Hpmol/ μ 1，所述下游引物LB為 10-14pmol/y 1。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述溶液B中，所述上游引物F3為3pmol/ μ 1，所述下游引物Β3為3ρπι01/μ 1，所述上游引物FIP為24ρπι01/μ 1，所述下游引物BIP 為24ρπι01/μ 1，所述上游引物LF為12pm0l/l·! 1，所述下游引物LB為12pmol/y L·
7.如權(quán)利要求4或5或6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括溶液A；所述 溶液A由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下KC1為16. 67nmol/yl, MgSO4 · 7H20 為 13. 33nmol/y 1，(NH4)2SO4 為 16. 67nmol/y 1，鈣黃綠素為 0. 083nmol/y 1， MnCl2 · 4H20 為 lnmol/μ 1，四種脫氧核苷酸各 2. 33hmol/y 1，甜菜堿為 0. 33ymol/y 1，IM pH8. 8Tris-HCl 為 33· 33nmol/y 1，Tween-20 為 0. (體積百分含量)，Bst DNA 聚合酶 為 0. 8υ/μ 1。
8.—種檢測來自死亡動物的樣品中是否攜帶豬細小病毒的方法，是用權(quán)利要求1或 2所述專用引物對來自死亡動物的樣品的總DNA進行環(huán)介導等溫擴增反應，檢測擴增產(chǎn) 物，確定來自死亡動物的樣品中是否攜帶豬細小病毒；所述環(huán)介導等溫擴增反應的條件為 60-65 °C、30-90min。
9.權(quán)利要求1或2所述專用引物或權(quán)利要求4至7中任一所述試劑盒在檢測待測樣本 中是否含有豬細小病毒中的應用。
10.權(quán)利要求1或2所述專用引物或權(quán)利要求4至7中任一所述試劑盒在輔助鑒定豬 細小病毒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用。本發(fā)明提供的試劑盒，包括三對引物，即與豬細小病毒的基因組DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中NS1基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對、外側(cè)引物對和環(huán)形引物對。本發(fā)明的豬細小病毒檢測試劑盒，檢測靈敏度高，最低可檢測出10個拷貝的靶DNA，操作簡單方便，特別適于基層現(xiàn)場進行的臨床醫(yī)學檢測及食品中可能污染的豬細小病毒的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102002539SQ201010561158
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者吳文學, 李佳禾, 黃書林 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學