專利名稱：富含磷壁酸的肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病原微生物的培養(yǎng)，尤其涉及肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)，屬于芽胞桿菌綱乳桿菌目鏈球菌科鏈球菌屬，是一 種革蘭陽性球菌，菌體呈矛頭狀，多成雙排列，寬端相對(duì)，尖端向外。在痰液、膿汁、肺組織病 變中亦可呈單個(gè)或短鏈狀。肺炎鏈球菌無鞭毛，無芽胞，在機(jī)體內(nèi)或含血清的培養(yǎng)基中能形 成莢膜，莢膜需特殊染色才可見。肺炎鏈球菌經(jīng)常寄居于正常人的鼻咽腔中，多數(shù)不致病或致病力弱，僅少數(shù)有致 病力。作為一種條件致病菌，肺炎鏈球菌通常形成帶菌狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，尤在呼 吸道病毒感染后或嬰幼兒、年老體弱者易發(fā)生肺炎鏈球菌肺部感染。肺炎鏈球菌主要引起 人類大葉性肺炎，約占細(xì)菌性肺炎的80%。肺炎后可繼發(fā)胸膜炎、膿胸，也可引起中耳炎、乳 突炎、副鼻竇炎、腦膜炎和敗血癥等。肺炎鏈球菌的抗原主要包括1、莢膜多糖抗原是一類型特異性多糖抗原，根據(jù)莢膜多糖的不同，肺炎鏈球菌可 區(qū)分為約90多個(gè)血清型。莢膜多糖抗原可以誘導(dǎo)人體產(chǎn)生特異性抗體，對(duì)同型感染有保護(hù) 作用。針對(duì)肺炎鏈球菌的莢膜多糖疫苗、莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)疫苗均已廣泛使用。2.菌體抗原(I)C多糖一種特異性多糖，存在于肺炎鏈球菌胞壁中，為各型菌株所共有。在 Ca2+存在時(shí)，肺炎鏈球菌C多糖可為血清中一種稱為C反應(yīng)蛋白(C reactive protein ； CRP)的球蛋白所沉淀。C多糖在人體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度抗體水平，但該抗體卻并沒有保 護(hù)性。(2)M蛋白是一種型特異抗原。C多糖是由重復(fù)單位組成的細(xì)胞壁磷壁酸，為肺炎鏈球菌的共同抗原，存在于所有 血清型肺炎鏈球菌的細(xì)胞壁中。在莢膜多糖疫苗、莢膜多糖-蛋白偶聯(lián)疫苗生產(chǎn)過程中，分 離純化的莢膜多糖不可避免的混雜有C多糖。為了精確定量疫苗中莢膜多糖的含量，需要 對(duì)莢膜多糖中混雜的C多糖進(jìn)行檢測(cè)。在莢膜多糖疫苗效力評(píng)價(jià)方面，人體內(nèi)存在的抗C多糖抗體常常干擾對(duì)莢膜多糖 抗體的定量測(cè)定，例如用ELISA方法測(cè)定的抗莢膜多糖抗體數(shù)值偏高。經(jīng)改進(jìn)的ELISA檢 測(cè)方法，需要在測(cè)定前先用C多糖對(duì)血清樣本中的C多糖抗體進(jìn)行吸附，以得出更加準(zhǔn)確的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般認(rèn)為，C多糖由2-8個(gè)重復(fù)單位組成，每個(gè)重復(fù)單位由五個(gè)單糖結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包 括一個(gè)葡萄糖、一個(gè)2-乙酰胺-4-氨基-2，4，6-三脫氧半乳糖(AAT)、兩個(gè)半乳糖胺和一個(gè) 5-磷酸核糖醇，重復(fù)單位之間通過磷酯鍵相連。在兩個(gè)半乳糖胺殘基上連接有磷酸膽堿集 團(tuán)，是C多糖的顯著特征。不同的研究者報(bào)道的C多糖結(jié)構(gòu)不完全相同，主要差異在于重復(fù) 單位中磷酸膽堿的數(shù)量以及乙?；潭?。這種差異可能與肺炎鏈球菌的種類、菌體培養(yǎng)方法、C多糖的提取方法等多種因素有關(guān)。本領(lǐng)域迫切需要結(jié)構(gòu)完整的C多糖樣品和/或?qū)φ掌?，用于肺炎鏈球菌多糖疫?或結(jié)合疫苗的質(zhì)量控制以及相關(guān)檢測(cè)試劑的生產(chǎn)。因此，建立質(zhì)量可控、重復(fù)性好、適合大 規(guī)模生產(chǎn)的肺炎鏈球菌培養(yǎng)、C多糖分離純化工藝具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種富含磷壁酸的肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法，該方 法培養(yǎng)的富含磷壁酸的肺炎鏈球菌用于C多糖樣品和/或?qū)φ掌返闹苽洹１景l(fā)明提供了一種肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法，在特征是在培養(yǎng)基中添加氯化膽堿。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，培養(yǎng)基中添加的氯化膽堿的濃度2. 5 200ug/ml ；優(yōu)選的， 氯化膽堿濃度為5 150ug/ml ；更優(yōu)選的，氯化膽堿濃度為20 80ug/ml ；最優(yōu)選的，氯化 膽堿濃度為40 80ug/ml。本發(fā)明的肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法，所用的培養(yǎng)基為商品TSB培養(yǎng)基；優(yōu)選的，TSB 培養(yǎng)基在接種前補(bǔ)加1.0%葡萄糖。本發(fā)明所用的培養(yǎng)基還可以是自制復(fù)合培養(yǎng)基，所述的自制復(fù)合培養(yǎng)基包含氯化 鈉0. 25%、磷酸二氫鈉0. 1 %、磷酸氫二鉀0. 3%、硫酸鎂0. 041 %、氯化鈣0. 001 %、蛋白胨 1.0%、酵母浸出粉0.5%、葡萄糖1.0%。本發(fā)明的肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法，肺炎鏈球菌的培養(yǎng)為兩級(jí)或三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，每 級(jí)培養(yǎng)接種后在37°C、CO2孵箱培養(yǎng)4 8小時(shí)；更優(yōu)選的，肺炎鏈球菌的培養(yǎng)為三級(jí)擴(kuò)大 培養(yǎng)，第一級(jí)、第二級(jí)培養(yǎng)接種后培養(yǎng)4 8小時(shí)，第三級(jí)培養(yǎng)在接種后培養(yǎng)6小時(shí)。本發(fā)明的肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法，肺炎鏈球菌菌株為粗造型肺炎鏈球菌突變體； 優(yōu)選的肺炎鏈球菌菌株選自CSR SCS2 CloneU R6A、R36A或RSC-2 ；更優(yōu)選的，肺炎鏈球菌 菌株為CSR SCS2 Clonel菌株。本發(fā)明的肺炎鏈球菌培養(yǎng)方法，獲得的肺炎鏈球菌生長(zhǎng)狀態(tài)好，磷壁酸含量高，易 于大規(guī)模生產(chǎn)。用該培養(yǎng)方法獲得的肺炎鏈球菌提取的C多糖，結(jié)構(gòu)完整，磷含量、氨基己 糖含量、糖醛酸含量等關(guān)鍵指標(biāo)與參比C多糖(丹麥血清研究所提供)接近，適合作為肺炎 鏈球菌多糖疫苗、蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)中C多糖檢測(cè)的對(duì)照品，也可用于評(píng)價(jià)肺炎鏈球菌多 糖疫苗、蛋白結(jié)合疫苗的檢測(cè)試劑。
具體實(shí)施例方式菌株常用于純化制備C-Ps的肺炎鏈球菌菌株包括CSR SCS2 Clone 1、R6A、R36A、RSC_2 等。本發(fā)明采用的肺炎鏈球菌菌株為CSR SCS2 Clonel，為一株II型肺炎鏈球菌的莢膜 突變株，因失去莢膜成為粗糙型(有莢膜則為光滑型)。也有研究報(bào)道稱在其細(xì)胞表面包 裹有一層C多糖“莢膜”層。使用CSR SCS2Cl0nel菌株在C多糖的分離純化中不受莢膜 多糖的干擾，所以被多數(shù)研究者采用，例如Schiffman，G. et al, (1971)Capsulation of Pneumococcus with soluble cell wall-like polysaccharide. J. Exp. Med. 134,600-617. 以及S0rensen U. B. S. et al, (1984) C-polysaccharide in a pneumococcal vaccine. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C 92 :351_356。
肺炎鏈球菌的鑒別(1)形態(tài)學(xué)觀察典型的肺炎鏈球菌為革蘭染色陽性球菌，直徑約1 μ m。常呈雙排列。菌體成矛頭 狀，寬端相對(duì)，尖端向外。在液體培養(yǎng)中可呈單個(gè)或短鏈狀。有毒株在體內(nèi)形成莢膜。普通 染色時(shí)莢膜不著色，表現(xiàn)為菌體周圍透明環(huán)。無鞭毛。不形成芽胞。菌體衰老時(shí)，或由于自 溶酶(autolysin)的產(chǎn)生將細(xì)菌裂解后，可呈現(xiàn)革蘭染色陰性。(2)糖，醇生化反應(yīng)肺炎鏈球菌可以在以乳糖、棉子糖或菊糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，不能在以甘露 醇或山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，常用于肺炎鏈球菌的鑒別。(3)奧普托欣敏感試驗(yàn)奧普托欣(Optochin，鹽酸乙基氫化羥基奎寧)對(duì)肺炎鏈球菌有特異抑制作用，其 作用機(jī)制可能是干擾葉酸生物合成，而對(duì)其它鏈球菌則無此作用。常用于肺炎鏈球菌的鑒 別。(4)膽汁溶菌試驗(yàn)?zāi)懼蚰扄}可溶解肺炎鏈球菌，可能是由于膽汁降低細(xì)胞膜表面的張力，使細(xì)胞 膜破損或使菌體裂解；或者是由于膽汁激活了肺炎鏈球菌自溶酶，加速了肺炎鏈球菌本身 自溶過程，促使細(xì)菌發(fā)生自溶。主要用于肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者 陰性。培養(yǎng)基本發(fā)明采用的固體血瓊脂培養(yǎng)基為含8%綿羊血的瓊脂培養(yǎng)基，可制作成斜面或 平板，為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。本發(fā)明采用的液體培養(yǎng)基主要為兩種，主要成分及來源如下(1)復(fù)合液體培養(yǎng)基成份所述的復(fù)合培養(yǎng)基包含氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二 鉀、硫酸鎂、氯化鈣、蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖，具體配比見下表。臨用前配制，分裝后8 磅30分鐘高壓滅菌，小三角瓶200ml，大三角瓶600ml，大立瓶9. 5L (1 %葡萄糖在接種時(shí)補(bǔ) 加)。表1復(fù)合培養(yǎng)基組分配比
權(quán)利要求
1.一種肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，在肺炎鏈球菌液體培養(yǎng)基中添加終濃度 為2. 5 200ug/ml的氯化膽堿。
2.如權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的氯化膽堿的終濃度為5 150ug/ml。
3.如權(quán)利要求2的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的氯化膽堿的終濃度為20 80ug/ml。
4.如權(quán)利要求3的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的氯化膽堿的終濃度為40 80ug/ml。
5.如權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的肺炎鏈球菌液體培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基添加終濃度為的葡萄糖。
7.如權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的肺炎鏈球菌液體培養(yǎng)基為自制培養(yǎng) 基，所述的自制培養(yǎng)基包含氯化鈉0. 25%、磷酸二氫鈉0. 1%、磷酸氫二鉀0. 3%、硫酸鎂 0. 041%、氯化鈣0. 001%、蛋白胨1.0%、酵母浸出粉0.5%、葡萄糖1.0%。
8.如權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其特征在于，肺炎鏈球菌的培養(yǎng)為兩級(jí)或三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)， 每級(jí)培養(yǎng)接種后在37°C、(X)2孵箱培養(yǎng)4 8小時(shí)。
9.如權(quán)利要求8的培養(yǎng)方法，其特征在于，肺炎鏈球菌的培養(yǎng)為三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，第一 級(jí)、第二級(jí)培養(yǎng)接種后培養(yǎng)4 8小時(shí)，第三級(jí)培養(yǎng)在接種后培養(yǎng)6小時(shí)。
10.如權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的肺炎鏈球菌為CSRSCS2Clonel菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的肺炎鏈球菌的培養(yǎng)方法，在液體培養(yǎng)基中添加氯化膽堿，并對(duì)培養(yǎng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，獲得的肺炎鏈球菌菌體富含磷壁酸，特別適合作為提取肺炎鏈球菌C多糖的材料。
文檔編號(hào)C12R1/46GK102093963SQ201010564079
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者任珍蕓, 沈榮 申請(qǐng)人:蘭州生物制品研究所