專利名稱：一株產(chǎn)黑色素的大腸桿菌工程菌9f2及其所產(chǎn)生的4hppd酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株轉(zhuǎn)化了從深海宏基因組文庫中克隆得到的4HPPD酶的大腸桿菌 9F2，該工程菌表達4HPPD酶，4-羥基苯丙酮酸在該酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通過氧化和多聚化生成黑色素。
背景技術：
黑色素包括兩大類，一大類是酪氨酸、多酚及它們相關化合物代謝最終產(chǎn)物；黑色素另外一大類屬于花色昔類而顯黑色色素，主要分布在植物中。第一類黑色素是復雜黑色高聚物，自然界中基本上可分為三類即真黑色素、棕黑素和異黑素。真黑色素含氮，不含硫原子，顏色為深棕色或黑色棕黑素含氮和硫原子，顏色為略帶紅色的棕色或黃色異黑素呈棕色或黑色，主要存在于植物中。按照堿解或氧化降解產(chǎn)物來看，可將黑色素分為吲哚構(gòu)架和兒茶酚構(gòu)架兩種。黑色素能作為紫外線吸收劑、抗氧化劑和新型天然藥物載體，用以治療某些與黑色素缺乏有關神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如著色性干皮病、帕金森氏癥、老年性癡呆癥、亨廷氏舞蹈病等。黑色素有很大應用潛力，如在化妝品或染發(fā)劑裝飾作用方面、清除自由基、生物殺蟲劑光保護等，一些可溶性黑色素在體外對HIV病毒有顯著抑制作用，抗流感病毒，誘導細胞凋亡。在很多霉菌、細菌、放線菌等能產(chǎn)生黑色素，如黑曲霉，它在生成抱子同時分泌黑色素。一般認為黑色素不是微生物生長、代謝、繁殖所必須，但黑色素能提高微生物抗重金屬毒害，抗紫外及射線損害，抗氧化，從而增強其生存能力。由于黑色素產(chǎn)品的特性以及我國的特殊國情，我國黑色素市場具有不同于國外市場、不同其他色素產(chǎn)品市場的特征。我國黑色素企業(yè)數(shù)量較少，規(guī)模不大，因此總體規(guī)模不大。近年來，隨著食品添加劑工業(yè)的迅速發(fā)展，國外市場對黑色素的需求量正逐年增加。近年來我國人們生活水平不斷提高，對健康食品更加重視，尤其是天然黑色素在食品中的應用，必將促使黑色素的需求量大幅度增加，其市場前景十分看好。2009年國內(nèi)工業(yè)形勢好轉(zhuǎn)，對黑色素的需求好轉(zhuǎn)，全年黑色素行業(yè)市場規(guī)模達到了 21921萬元。今后隨著需求量的增加和產(chǎn)品價格的不斷走高，其市場規(guī)模將進一步增大，預計到2015年黑色素市場規(guī)模將達到40880萬元。目前，我國黑色素的產(chǎn)能規(guī)模已經(jīng)超過了 2000噸。初步估計，2010年中國黑色素的生產(chǎn)能力將超過2100噸，達到2150噸。目前我國黑色素工業(yè)生產(chǎn)原料主要為黑豆和黑芝麻，原料供應容易受到氣候、季節(jié)影響。而微生物生產(chǎn)黑色素具備不受地域、季節(jié)限制，易于工業(yè)化的特點，在未來黑色素產(chǎn)業(yè)開發(fā)中具有很高的價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一株大腸桿菌大腸桿菌工程菌DH5 α 9F2 (Esherichia coliDH5 α 9F2)，該工程菌表達4HPPD酶，4-羥基苯丙酮酸在該酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通過氧化和多聚化生成黑色素。該大腸桿菌5C11菌種保藏號為CCTCC NO =M 2010Μ4，保藏日期為2010年9月21日，保藏地點為湖北省武漢市武漢大學，保藏機構(gòu)為中國典型培養(yǎng)物保藏中心。我們從東太平洋深海沉積物樣品進行富集，提取富集樣品DNA建立R)simid文庫， 質(zhì)粒載體(Fosmid，插入片段40 451Λ)，宿主是大腸桿菌(Escherichia coli)，獲得約 3000個克隆子。通過篩選，得到一個克隆子。該克隆在LB培養(yǎng)36小時后呈現(xiàn)棕紅色。該克隆插入片段全長測序后經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，該序列和GENEBANK中的 Pseudomonasstutzeri A1501 (GenBank :CP000304. 1)上的 4HPPD 酶基因有著很高的相似性。根據(jù)序列設計引物，以全長序列作為模板，PCR擴增出一條約1. 5Kb的片段，基因序列如圖2所示。將該基因克隆到T載體轉(zhuǎn)化到Dffia感受態(tài)細胞，得到工程菌9F2。克隆的4HPPD酶基因，全長1083個堿基對，編碼了 4HPPD酶(361個氨基酸)，分子量為40. 4Kda。經(jīng)實驗驗證，培養(yǎng)基中的苯丙氨酸和酪氨酸可以在大腸桿菌宿主酪氨酸酶作用下生成4-羥基苯并酮酸p-hydroxyphenylpyruvate (PHPP)，PHPP在該酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通過氧化和多聚化生成黑色素。


圖1 所表示的是工程菌9F2用LB培養(yǎng)的生長狀況，9F2在LB中培養(yǎng)M小時。圖2 所表示是9F2培養(yǎng)液中HGA檢測。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。實施例1本發(fā)明工程菌的獲得本發(fā)明提供的工程菌是采用以下方法獲得的1.深海沉積物樣品的富集取出4°C保存的東太平洋深海沉積物樣品10g，于人工海水放線菌富集500ml培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為，200rpm，10天。2.深海沉積物富集樣品DNA提取富集產(chǎn)物30ml，IOOOOg離心15分鐘，去上清， 加入 13. 5ml DNA抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl，IOOmM EDTA-Na, IOOmM磷酸鈉緩沖液，1. 5M Nacl, CTAB pH 8. 0)，混勻后，加溶菌酶(10mg/ml) ；37度水平振蕩30分鐘；加入1. 5ml 20% SDS，將其至于65度水浴渦中水浴2小時，同時每15-20分鐘伴隨著溫柔的顛倒混勻； 將離心管6000g離心十分鐘，去上清，沉淀重復洗兩次(4. 5ml buffer+0. 5mlSDS，65度， lOmin，離心6000g，10min)此步可以省略；集中三次所得到的上清，加入等體積的酚氯仿， 15000g離心15min ；取水相溶液到另一離心管中，再加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1 小時；16000g離心20min，得到DNA粗提物；用70%乙醇洗滌，離心之后放置于操作臺吹干， 最后用去離子水溶解。3.深海沉積物富集樣品宏基因組文庫的構(gòu)建A. DNA 剪切提取環(huán)境樣品或所富集菌體的DNA，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測
B. DNA 選擇1.切下片段大約40K至45K的DNA，，在70. C溶膠lOmin，按Img固體膠溶解后體積為 1 μ 1 計算，加入 GELase 50XBuffer,每 100 μ 1 膠加入 IU GELase Enzyme, 45. C 水浴 1 小時。2. 70. C 水浴 lOmin，滅活 GELase Enzyme3.離心去除未被降解的瓊脂。4.加入1/10體積醋酸鈉，溫柔混勻。5.加入2. 5倍體積的無水乙醇，溫柔混勻。6.室溫沉淀 IOmin.7. 13000rpm/min 離心 20min，小心吸除上清8.將沉淀用預冷的70 %乙醇洗兩次9.吹干后將 DNA 溶于 TE Buffer.C. DNA末端補平1.補平體系X μ 1 無菌水8 μ 1 IOX End-Repair Buffer8 μ 1 2. 5mM dNTP Mix8 μ 1 IOmM ATPUp to 20 μ g sheared insert DNA (約 0. 5 μ g/ μ 1)4μ 1 End-Repaie Enzyme Mix80 μ 1總反應體積2.室溫放置 45min.3.加入酚-氯仿抽提4.取上清，加入1/10體積醋酸鈉，溫柔混勻。5.加入2. 5倍體積的無水乙醇，溫柔混勻。6.-20. C 過夜沉淀。7. 13000rpm/min 離心 20min，小心吸除上清8.將沉淀用預冷的70 %乙醇洗兩次9.吹干后將 DNA 溶于 TE Buffer.D.連接反應1.連接體系Χμ 1 無菌水1 μ 1 IOX Fast-Link Ligation Buffer1 μ 1 IOmM ATP1 μ 1 CopyControl pCClFOS VecterX μ 1 concertrated insert DNA1 μ 1 Fast-Link DNA Ligase10 μ 1總反應體積2.室溫放置連接2個小時
3.反應體系置于70°C，10分鐘，滅活DNA Ligase.E.克隆子制備1.將EPI300轉(zhuǎn)入已添加IOmM MgS04的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD達到0. 8-1. 0， 4度保存菌液可保存72小時。2.置冰上融化一管包裝蛋白，當融化時迅速吸出25 μ 1到一個新的離心管中。剩下的25 μ 1仍然置于-70. C接下去使用。3. 25 μ 1包裝蛋白中加入10 μ 1連接反應產(chǎn)物。4. 30. C 水浴 90min.5.加入另外25μ1包裝蛋白，30. C水浴90min.6.力口入 Phage dilution buffer 940 μ 1,使總體積達到 lml.F. Titering the Packaged CopyControl Fosmid Clones1.加入10 μ 1包裝好的溶液與100 μ 1 EPI300-T1R宿主細胞混勻。2. 37. C 水浴 20min.3.涂于含有12. 5 μ g/ml氯霉素的LC平板上，過夜培養(yǎng)4.計算克隆子數(shù)目。G.克隆子確認.1.提取克隆子質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。2.質(zhì)粒酶切圖譜分析最終構(gòu)建成功約3000個克隆子的文庫。4. 4HPPD基因克隆轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)一個克隆在LB培養(yǎng)36小時后呈現(xiàn)棕紅色，經(jīng)全長測序后發(fā)現(xiàn)其含有4HPPD 基因，將該基因克隆到T載體轉(zhuǎn)化到Dffia感受態(tài)細胞，感受態(tài)在37°C、120RPM下活化。 取50微升涂板，10小時后在含有氨芐青霉素的LB平板上得到工程菌9F2。24小時后，可見該工程菌在平板上產(chǎn)色素。工程菌9F2所產(chǎn)黑色素驗證已有報道微生物或宏基因組文庫中的4HPPD酶可以在大腸桿菌中表達并產(chǎn)黑色素。培養(yǎng)基中的苯丙氨酸和酪氨酸可以在大腸桿菌宿主酪氨酸酶作用下生成4-羥基苯并酮酸p-hydroxyphenylpyruvate (PHPP)，PHPP在4HPPD酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通過氧化和多聚化生成黑色素。通過HPLC我們檢測到工程菌9F2 LB培養(yǎng)基中的黑尿酸，見圖
Io實施例2酶基因的克隆和測序通過對fosmid克隆子的全長序列分析以及在Gene Bank中的BLAST的結(jié)果分析， 該全長序列和I3Seudomonas stutzeri A1501 (GenBank :CP000304. 1)相似性最高，其中全長序列中一個片段和PseucIomonas stutzeri A1501的4HPPD基因同源性最高，為98%。根據(jù)序列和分析結(jié)果設計擴增4HPPD基因引物，引物為9F2-PF5' -TCAGGTCCATCCCATAGCAG-3‘ ；9F2-PR 5' -GTGATACCGCGTGATCTCAAT-3‘。PCR步驟如下95°C預變性5分鐘；95°C變性1分鐘，50°C復性45s，68°C延伸2分鐘30個循環(huán)后68°C延伸10分鐘，4°C保溫。并將所得的片段克隆到T載體上，并進行測
6序。根據(jù)已測得序列，經(jīng)DNA和蛋白對比顯示所克隆得到的片段就是所需要的4HPPD 酶基因及其上下游200個堿基左右長度的序列。將所克隆的片段根據(jù)引物設定的識別位點進行相應的酶切處理，并與相同酶處理好的載體相連，最終轉(zhuǎn)化到E. Coli EPI300感受態(tài)細胞中進行誘導表達。培養(yǎng)基為LB，轉(zhuǎn)速 180rpm，37°C培養(yǎng) M 小時。
權(quán)利要求
1.一株大腸桿菌工程菌 DH5a 9F2(Esherichia coli DH5 α 9F2)，保藏號為CCTCC NO: M2010244。
2.如權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌工程菌，其特征在于，該工程菌是由含4HPPD酶的基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌得到。
3.如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌工程菌9F2^sherichia coli DH5a9F》，其特征在于能夠合成一種黑色素。
4.如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌工程菌9F2^sherichia coli DH5a9F》，其特征在于該工程菌能夠表達4HPPD酶，培養(yǎng)基中的苯丙氨酸和酪氨酸可以在大腸桿菌宿主酪氨酸酶作用下生成4-羥基苯并酮酸p-hydroxyphenylpyruvate (PHPP)，PHPP在該酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通過氧化和多聚化生成黑色素。
5.一種4HPPD酶基因，其特征在于，具有SEQ ID NO. 1所示的堿基序列及其功能等同物或變異體。
6.一種4HPPD酶，其特征在于，具有SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。
7.—種生產(chǎn)黑色素的方法，其特征在于采用權(quán)利要求1所述的大腸桿菌9F2或其 4HPPD酶基因或4HPPD酶的氨基酸序列，獲得4HPPD酶，用該酶轉(zhuǎn)化4-羥基苯并酮酸生成尿黑酸，尿黑酸通過氧化和多聚化生成黑色素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)黑色素的大腸桿菌工程菌9F2及其所產(chǎn)生的4HPPD酶。該工程菌能夠產(chǎn)生一種黑色素。該工程菌在37℃培養(yǎng)條件下，生長狀況良好。該菌含有4HPPD基因(全長1083個堿基對)，編碼了4HPPD酶(361個氨基酸)，分子量為40.4Kda。
文檔編號C12N1/21GK102477407SQ201010564108
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者易志偉, 湯熙翔, 王風平, 肖湘, 馬群 申請人:國家海洋局第三海洋研究所